Ex vivo nervus Slice kultur fra embryonale GFP-uttrykker mus for time-lapse Imaging av nervus nerve utvekst
Summary
En ex vivo Slice analysen lar nervus nerve utvekst å bli avbildet i sanntid. Sektorer genereres ved å bygge inn E 10.5 ISLMN: GFP embryo in agarose, kutting på en vibratome, og vokser i en scene-topp inkubator. Rollen til axon veilednings trasé vurderes ved å legge til hemmere i kultur mediene.
Abstract
Nøyaktige øyebevegelser er avgjørende for synet, men utviklingen av øye motorsystemet, spesielt de molekylære veiene som kontrollerer axon veiledning, har ikke blitt fullstendig belyst. Dette skyldes delvis tekniske begrensninger i tradisjonelle axon veilednings analyser. For å identifisere flere axon veiledning pekepinner påvirke nervus nerve, en ex vivo Slice analysen til bildet nervus nerve i sanntid som det vokser mot øyet ble utviklet. E 10.5 ISLMN-GFP embryo brukes til å generere ex vivo skiver ved å bygge dem inn i agarose, kutting på en vibratome, deretter vokser dem i et mikroskop stadium-topp inkubator med time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. kontroll skiver recapitulate i vivo timing av utvekst av axons fra kjernen til banen. Små molekyl hemmere eller rekombinant proteiner kan legges til kulturen Media for å vurdere hvilken rolle ulike axon veiledning trasé. Denne metoden har fordelene med å opprettholde mer av de lokale mikromiljøet gjennom hvilke axons Travers, ikke axotomizing den voksende axons, og vurdere axons på flere punkter langs deres bane. Det kan også identifisere effekter på bestemte delsett av axons. For eksempel, hemming av CXCR4 årsaker axons fortsatt innenfor mellomhjernen å vokse dorsalt stedet ventrally, men axons som allerede har gått ut ventrally er ikke berørt.
Introduction
Øye motorsystemet gir et elegant system for å undersøke axon veilednings mekanismer. Det er relativt ukomplisert, bestående av tre skallen nerver innervating seks ekstraokulære muskler (EOMs) som beveger øyet, og levator palpebrae superioris (LPS) som løfter øyelokket. Den nervus nerve innerverer LPS og fire EOMs-den underlegne skrå og midtre, dårligere, og overlegen Rectus muskler. De to andre nerver, den trochlear og abducens, hver eneste innervate en muskel, overlegen skrå og lateral Rectus muskel, henholdsvis. Eye bevegelser gir en enkel avlesning, viser om innervasjon var hensiktsmessig, mangler, eller avvikende. I tillegg er det menneskelige øyebevegelse lidelser som følge av underskudd i neuronal utvikling eller axon veiledning, kollektivt betegnet de medfødte skallen disinnervation lidelser (CCDDs)1.
Til tross for disse fordelene brukes øye motorsystemet sjelden i axon veilednings studier2,3,4,5,6,7,8, 9 andre priser , 10, på grunn av tekniske ulemper. I vitro axon veiledning analysene har mange ulemper11. Co-kultur analyser, der neuronal explants er kultivert sammen med explants av målet vev12 eller transfekterte celler13, avhengig av både symmetri av explant og presis posisjonering mellom explant og målet vev. Stripe analyser14,15, der to Stikkordene er fastsatt i vekslende striper og axons er vurdert for fortrinnsrett vekst på en stripe, bare tyder på at ett substrat er å foretrekke fremfor den andre, ikke at enten er attraktiv eller frastøtende, eller fysiologisk relevant. Materialer Chambers kan danne presise kjemiske graderinger, men underlagt økende axons å skjær stress16,17,18, noe som kan påvirke deres vekst. Videre, i hver av disse tilnærmingene, samle explants eller dissosiert celler krever at outgrowing axons være axotomized og dermed disse analysene faktisk undersøke axon regenerering, snarere enn første axon utvekst. Til slutt, disse in vitro tilnærminger fjerne mikromiljøet som påvirker axons og deres svar på stikkordene langs forskjellige steder av deres kurs, og tradisjonelt bare teste en kø i isolasjon. Compounding disse ulempene, gjør den lille størrelsen på hver kjerne i øye motorsystemet disseksjon teknisk utfordrende for enten explants eller dissosiert kulturer. I tillegg er primære kulturer av øye motor neurons vanligvis heterogene, har betydelig celle død, og er tetthet avhengig, krever pooling av celler fra flere embryo (Ryosuki FUJIKI, personlig kommunikasjon). In vivo metoder, men inkludert knockout musemodeller, er upassende å bruke for screening, gitt den tid og utgifter som kreves.
Metoder utviklet for å kultur hele embryo19 tillate merking av å migrere celler20 eller blokade av spesifikke molekyler21, men hele embryo kulturer krever inkubasjons i rulle flasker som utelukker sanntids Imaging av merket Strukturer. Kirurgiske teknikker som tillater manipulering av embryo og deretter påfølgende videre utvikling enten i livmoren eller i magen av moren (opprettholde placenta)22 er også mulig, men disse heller ikke tillate time-lapse Imaging.
For å overvinne hindringene for in vitro analyser og tillate rask screening av signalering trasé, en ex vivo embryonale skjær kultur teknikk ble utviklet23, tilpasset fra en tidligere publisert protokoll for perifer nerve utvekst24. Ved hjelp av denne protokollen, kan utvikle nervus nerve bli avbildet over tid i nærvær av mange av de omkringliggende strukturer langs banen, inkludert EOM mål. Ved å legge til små molekyl hemmere, vekstfaktorer, eller veiledning signaler til kulturen Media, kan vi vurdere veiledning forstyrrelser på flere punkter langs axon banen, slik at mer rask vurdering av potensiell vekst og veiledning faktorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne ex vivo Slice kultur-protokollen gir betydelige fordeler i forhold til tradisjonelle axon veiledning analyser23. Størrelsen på hver skallen motor kjernen er ikke en begrensende faktor, og ingen vanskelig disseksjon er nødvendig. Den endogene mikromiljøet gjennom som axons reise opprettholdes, slik at modifisering av en signalering sti og samtidig opprettholde andre signalering trasé. I tillegg kan effekter vurderes på ulike punkter langs axon banen. Siden axon veiledning krever flere s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering gitt av National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child helse og utvikling [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical forsker Development program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [karriere starter Grant], og Children ‘ s Hospital Oftalmologi Foundation [fakultet Discovery Award]. ECE er en Howard Hughes Medical Institute etterforsker.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
