לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני
Summary
הvivo לשעבר פרוסה מאפשרת העצב outculמניע העצבים כדי להיות בתמונה בזמן אמת. פרוסות מופקים על ידי הטבעת e 10.5 איי. איי. או. עוברי העוברים ב-agarose, הפרוסות על הרטט, וגדלים בחממה בשלב העליון. התפקיד של מסלולים הדרכה אקסון מוערך על ידי הוספת מעכבי התקשורת התרבות.
Abstract
תנועות עיניים מדויקות הם חיוניים לחזון, אבל הפיתוח של מערכת מנוע עינית, במיוחד מסלולים מולקולריים השליטה אקסון הדרכה, לא הובהר במלואו. הדבר נובע בחלקו ממגבלות טכניות של הנחיות האקסון המסורתיות. כדי לזהות רמזים נוספים הנחיות הדרכה המשפיעים על העצב מניע העיניים, vivo slice לשעבר התמונה לדמות את העצב מניע העיניים בזמן אמת כפי שהוא גדל לקראת העין פותחה. E 10.5 אי אן איי -gfp העוברים משמשים להפקת פרוסות vivo לשעבר על ידי הטבעת אותם בתוך agarose, פרוסות על הרטט, ולאחר מכן גדל אותם בשלב מיקרוסקופ העליון החממה עם הזמן לשגות photomicroscopy עבור 24-72 h. שליטה פרוסות לכידה בעיתוי vivo של צמיחה של אקסונים מן הגרעין אל המסלול. מולקולות קטנות מעכבי או חלבונים רקומביננטי ניתן להוסיף לתקשורת התרבות כדי להעריך את התפקיד של מסלולים הדרכה שונים אקסון. שיטה זו מקבלת את היתרונות של שמירה על יותר של המיקרו-סביבה המקומית שדרכה עוברים האקסונים, לא axotom, ומעריכים את האקסונים בנקודות מרובות לאורך מסלול שלהם. הוא יכול גם לזהות אפקטים בערכות ממשנה ספציפיות של axons. לדוגמה, עיכוב של CXCR4 גורם אקסונים עדיין בתוך המוח האמצע כדי לגדול dorsally ולא ventrally, אבל אקסונים כי כבר יצא ventrally לא מושפעים.
Introduction
מערכת מנוע עינית מספקת מערכת אלגנטית לחקירת מנגנוני הדרכה אקסון. זה מסובך יחסית, המורכב של שלוש עצבי הגולגולת innervating six שרירי העין (eoms) אשר להזיז את העיניים, ואת השריר palpebrae סופרוריס (lps) אשר מרים את העפעף. העצב מניע העיניים innervates LPS וארבעה EOMs-האלכסוני הנחות האמצעי, נחותים, והשרירים rectus מעולה. שני העצבים האחרים, הטרוליר והחוטפים, כל אחד מinnervate רק שריר אחד, השריר האלכסוני והשרירי הצדדי העליון, בהתאמה. תנועות עיניים לספק בדיקה קלה, מראה אם אינבציה היה מתאים, חסר או חריג. בנוסף, קיימות הפרעות בתנועת העין האנושית הנובעות מהליקויים בהתפתחות העצבית או הנחיית האקסון, כינה באופן קולקטיבי את הפרעות הגולגולת הולדות (CCDDs)1.
למרות יתרונות אלה, מערכת מנוע עינית משמש לעתים נדירות ב אקסון לימודי הדרכה2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , 10, עקב החסרונות הטכניים. באמצעות מבחנה מחוץ לספר ההדרכה יש חסרונות רבים11. שיתוף תרבות שותף, שבו האקסופלאליות מתורבת הם מתורבתים יחד עם explants של רקמת היעד12 או תאים מזוהמים13, תלוי הן בסימטריה של מיקום מדויק והמדויק בין רקמת המטרה. פס מספר14,15, שבו שני רמזים מונחים בפסים ואקטונים מתחלפים מוערך על גידול מועדף על פס אחד, רק לציין כי מצע אחד עדיף על השני, לא כי או הוא אטרקטיבי או דוחה, או רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. מיקרופלואידיקה צ’יימברס יכול ליצור מעברי צבע כימיים מדויקים, אבל כפופים הגדלים אקסונים כדי להטות את הלחץ16,17,18, אשר יכול להשפיע על התפתחותם. יתר על כן, בכל הגישות הללו, איסוף האקסוצמחים או תאים הנתק דורש כי אקסונים הגוברת להיות axotom, ולכן אלה בחני למעשה לבחון התחדשות אקסונים, במקום אקסונים הראשונית הצמיחה. לבסוף, בגישות החוץ-גופית מסירים את המיקרו-סביבה המשפיעה על האקסון ועל תגובותיהם לרמזים לאורך נקודות שונות, ובאופן מסורתי בודקים רק אות אחת בבידוד. הרכבה חסרונות אלה, הגודל הקטן של כל גרעין במערכת המנוע העינית מאפשר לקרע מאתגרת מבחינה טכנית עבור הרחבות או תרבויות הנתק. בנוסף, התרבויות הראשיות של נוירונים מוטוריים העינית הם בדרך כלל הטרוגנית, יש מוות תאים משמעותיים, והם תלויים צפיפות, המחייב אגירת תאים מעוברים מרובים (Ryosuki פוג’יקי, תקשורת אישית). עם זאת, בשיטות vivo, לרבות מודלים של עכבר מהממת, אינם מתאימים לשימוש בהקרנה, בהתחשב בזמן ובהוצאות הנדרשות.
שיטות שפותחו לתרבות העוברים שלמים19 לאפשר תיוג של תאים הגירה20 או מצור של מולקולות ספציפיות21, אבל תרבויות העובר השלם דורשים דגירה בבקבוקי רולר אשר מונע הדמיה בזמן אמת של תוויות מבנים. טכניקות כירורגיות המאפשרות מניפולציה של העובר ולאחר מכן לאחר מכן פיתוח נוסף ברחם או בבטן של האם (שמירה על חיבור הסביבה)22 הם גם אפשריים, אבל אלה גם לא לאפשר הזמן לשגות דמיה.
כדי להתגבר על המכשולים של מחוץ לבית הספר ולאפשר הקרנה מהירה של מסלולים איתות, הטכניקה vivo לשעבר התרבות פרוסה מתחלקים התפתחה23, המותאם מתוך פרוטוקול שפורסם בעבר היקפית היקפיים מוצלח24. באמצעות פרוטוקול זה, את העצב המתפתח מתפתח לאורך זמן בנוכחות רבים של המבנים שמסביב לעבר מסלול, כולל מטרות EOM. על ידי הוספת מעכבי מולקולה קטנה, גורמי גדילה, או רמזים הדרכה לתקשורת התרבות, אנחנו יכולים להעריך הדרכה רטבאליות בנקודות מרובות לאורך מסלול אקסון, המאפשר הערכה מהירה יותר של גורמי צמיחה פוטנציאליים הדרכה.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה הפרוטוקול הvivo לשעבר התרבות הפרוסה מספק יתרונות משמעותיים על הנחיית האקסון המסורתית שאומר23. הגודל של כל גרעין המנוע הגולגולתית אינו גורם מגביל, ואין צורך בניתוח קשה. הסביבה האנדודוגני שדרכה לנסוע אקסונים מתוחזק, מתן אפשרות לשינוי של מסלול איתות אחד תוך שמירה על מסלולים אית…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון שסופקו על ידי מכון העין הלאומי [5K08EY027850], המכון הלאומי של בריאות הילד ופיתוח [U54HD090255], הרווארד-חזון המחקר הקליני תוכנית פיתוח [5K08EY027850], האבירים הטמפלרים עין הקרן [קריירה המתחיל גרנט], בית החולים לרפואת עיניים וקרן הילדים [פרס דיסקברי הפקולטה]. . הוא חוקר מכון רפואי הווארד יוז
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
