Ex vivo Oculomotor segment cultuur van embryonale GFP-uitdrukken van muizen voor timelapse-beeldvorming van Oculomotor zenuw uitgroei
Summary
Een ex vivo slice assay maakt het mogelijk om de zenuw uitgroei van de Oculomotor in real-time te laten afbeelen. Segmenten worden gegenereerd door het insluiten van E 10.5 ISLMN: GFP embryo’s in agarose, snijden op een vibratome, en groeien in een podium-top incubator. De rol van Axon guidance trajecten wordt beoordeeld door remmers toe te voegen aan de cultuur media.
Abstract
Nauwkeurige oogbewegingen zijn cruciaal voor het gezichtsvermogen, maar de ontwikkeling van het oculair motorsysteem, met name de moleculaire trajecten die de axon-geleiding beheersen, is niet volledig opgehelderd. Dit is deels te wijten aan technische beperkingen van traditionele axon guidance testen. Om aanvullende axon geleidings signalen te identificeren die de Oculomotor zenuw beïnvloeden, een ex vivo slice assay om de Oculomotor zenuw in real-time te afbeelden naarmate deze in de richting van het oog groeit, werd ontwikkeld. E 10.5 ISLMN-GFP- embryo’s worden gebruikt om ex vivo-segmenten te genereren door ze in agarose in te sluiten, te snijden op een vibratome en ze vervolgens te kweken in een Microscoop-topincubator met timelapse-photomicroscopie voor 24-72 h. regel segmenten even de in vivo timing van de uitgroei van axonen van de Nucleus naar de baan. Kleine molecuul remmers of recombinant proteïnen kunnen aan de kweekmedia worden toegevoegd om de rol van verschillende axon geleidings trajecten te beoordelen. Deze methode heeft de voordelen van het handhaven van meer van de lokale micro omgeving waardoor axonen doorkruisen, niet axotomiseren van de groeiende axonen, en het beoordelen van de axonen op meerdere punten langs hun traject. Het kan ook effecten op specifieke subsets van axonen identificeren. Bijvoorbeeld, remming van CXCR4 zorgt ervoor dat axonen nog steeds binnen de middenhersenen groeien schrapen in plaats van ventraal, maar axonen die al hebben verlaten ventraal zijn niet aangetast.
Introduction
Het oculair motorsysteem biedt een elegant systeem voor het onderzoeken van Axon geleidings mechanismen. Het is relatief ongecompliceerd, bestaande uit drie craniale zenuwen innervating zes extraocular spieren (EOMs) die het oog bewegen, en de levator palpebrae superioris (LPS) die het ooglid liften. De Oculomotor zenuw innert de lp’s en vier eoms-de minderwaardige schuine en de mediale, inferieure en superieure rectus spieren. De andere twee zenuwen, de trochlear en kidnens, elk slechts innervate één spier, de superieure schuine en laterale rectus spier, respectievelijk. Oogbewegingen zorgen voor een gemakkelijke uitlezen, wat aangeeft of innervatie gepast, vermist of afwijkend is. Bovendien, er zijn menselijke oog bewegingsstoornissen die voortvloeien uit tekorten in neuronale ontwikkeling of Axon begeleiding, gezamenlijk aangeduid als de aangeboren craniale desinnervatie stoornissen (Cdd’s)1.
Ondanks deze voordelen wordt het oculair motorsysteem zelden gebruikt in axon guidance studies2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, vanwege technische nadelen. In vitro axon begeleiding assays hebben vele nadelen11. Co-cultuur assays, waarin neuronale explanten worden gekweekt samen met explantaten van doelweefsel12 of getranssinfecteerde cellen13, afhankelijk van beide symmetrie van de explant en precieze positionering tussen de explant en het doelweefsel. Stripe assays14,15, waarin twee signalen zijn vastgelegd in afwisselende strepen en axonen worden beoordeeld op preferentiële groei op één streep, geven alleen aan dat één substraat beter is dan de andere, niet dat het aantrekkelijk is of weerzinwekkend, of fysiologisch relevant. Microfluïdica kamers kunnen precieze chemische gradiënten vormen, maar het onderwerp groeit axonen om stress16,17,18te afschuiven, wat hun groei kan beïnvloeden. Bovendien, in elk van deze benaderingen, het verzamelen van explanten of gezien cellen vereist dat de uitgroeiende axonen worden axotomized en dus deze tests onderzoeken axon regeneratie, in plaats van initiële axon uitgroei. Tot slot, deze in vitro benaderingen verwijderen van de micro-omgeving die invloed op axonen en hun reacties op hints langs verschillende punten van hun cursus, en traditioneel slechts één hint in isolatie te testen. Door deze nadelen te comperen, maakt de geringe omvang van elke Nucleus in het oculaire motorsysteem de dissectie technisch uitdagend voor zowel explantaten als gedisiteerde culturen. Bovendien zijn primaire culturen van oculaire motorneuronen meestal heterogeen, hebben significante celdood, en zijn dichtheids afhankelijke, waarbij het groeperen van cellen uit meerdere embryo’s vereist is (Ryosuki Fujiki, persoonlijke communicatie). In vivo methoden, met inbegrip van Knockout muismodellen, zijn echter ongeschikt om te gebruiken voor screening, gezien de tijd en kosten die nodig zijn.
Methoden die zijn ontwikkeld voor het kweken van hele embryo’s19 het labelen van cellen20 of blokkade van specifieke moleculen21toestaan, maar hele embryo culturen vereisen incubatie in roller flessen die real-time beeldvorming van gelabelde Structuren. Chirurgische technieken die manipulatie van het embryo mogelijk maken en vervolgens verdere ontwikkeling in de baarmoeder of in de buik van de moeder (het handhaven van de placentaire verbinding)22 kunnen ook worden uitgevoerd, maar deze laten ook geen time-lapse Imaging.
Om de obstakels van in vitro testen te overwinnen en een snelle screening van signalerings trajecten mogelijk te maken, werd een ex vivo embryonale segment kweek techniek ontwikkeld23, aangepast van een eerder gepubliceerd protocol voor perifere zenuw groei24. Met behulp van dit protocol, de ontwikkelende Oculomotor zenuw kan worden afgebeeld in de tijd in de aanwezigheid van veel van de omringende structuren langs haar traject, met inbegrip van EOM targets. Door kleine molecuul remmers, groeifactoren of geleidings signalen aan de cultuur media toe te voegen, kunnen we geleidings verstoringen op meerdere punten langs het axon-traject beoordelen, waardoor een snellere beoordeling van potentiële groei-en geleidings factoren mogelijk is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit ex vivo segment cultuur protocol biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de traditionele axon guidance-testen23. De grootte van elke craniale motor kern is geen beperkende factor, en geen moeilijke dissectie is noodzakelijk. De endogene micro omgeving waardoor de axonen reizen wordt gehandhaafd, waardoor wijziging van een signalering traject met behoud van andere signalering trajecten. Bovendien kunnen effecten worden beoordeeld op verschillende punten langs het axon-traject. Aangezien a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering door het National Eye Institute [5K08EY027850], Nationaal Instituut voor kindgezondheid en ontwikkeling [U54HD090255], Harvard-Vision Development Program [5K12EY016335], de Knights Templar Eye Foundation [carrière starter Grant], en de Children’s Hospital Ophthalmologie Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
