पूर्व Vivo Oculomotor स्लाइस संस्कृति भ्रूण GFP से-समय के लिए चूहे को व्यक्त करने के लिए Oculomotor तंत्रिका आउटग्रोथ के समय-लैप इमेजिंग
Summary
एक पूर्व विवो टुकड़ा परख oculomotor तंत्रिका वृद्धि वास्तविक समय में छवि की जा करने के लिए अनुमति देता है। स्लाइस e10.5 IslMN embedding द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं: agarose में GFP भ्रूण, एक vibratome पर टुकड़ा, और एक मंच शीर्ष इनक्यूबेटर में बढ़ रही है. एक्सॉन मार्गदर्शन रास्ते की भूमिका संस्कृति मीडिया के लिए inhibitors जोड़कर मूल्यांकन किया है.
Abstract
सटीक आंख आंदोलनों दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन नेत्र मोटर प्रणाली के विकास, विशेष रूप से आणविक रास्ते एक्सॉन मार्गदर्शन को नियंत्रित करने, पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है. यह आंशिक रूप से पारंपरिक एक्सॉन मार्गदर्शन assays की तकनीकी सीमाओं के कारण है. Oculomotor तंत्रिका को प्रभावित करने वाले अतिरिक्त एक्सॉन मार्गदर्शन संकेतों की पहचान करने के लिए, वास्तविक समय में ओकुलोमोटर तंत्रिका की छवि के लिए एक पूर्व विवो स्लाइस परख के रूप में यह आंख की ओर बढ़ता विकसित किया गया था। E10.5 Isl MN-GFP भ्रूण उन्हें agarose में embedding द्वारा पूर्व vivo स्लाइस उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है, एक vibratome पर slicing, तो उन्हें एक माइक्रोस्कोप चरण में बढ़ रहा है-शीर्ष इनक्यूबेटर के साथ समय चूक photomicroscopy के लिए 24-72 ज नियंत्रण स्लाइस recapitulate नाभिक से कक्षा तक एक्सॉन के वृद्धि के विवो समय में। छोटे अणु inhibitors या रिकॉमबिनेंट प्रोटीन संस्कृति मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है विभिन्न एक्सॉन मार्गदर्शन रास्ते की भूमिका का आकलन. इस विधि के स्थानीय microenvironment जिसके माध्यम से axons पार, नहीं बढ़ axons axtomizing, और उनके प्रक्षेप पथ के साथ कई बिंदुओं पर axons का आकलन के अधिक बनाए रखने के फायदे हैं. यह भी axons के विशिष्ट सबसेट पर प्रभाव की पहचान कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, CXCR4 के निषेध का कारण बनता है axons अभी भी midbrain के भीतर ventrally के बजाय dorsally बढ़ने के लिए, लेकिन axons कि पहले से ही ventrally से बाहर निकल चुके हैं प्रभावित नहीं कर रहे हैं.
Introduction
नेत्र मोटर प्रणाली एक्सॉन मार्गदर्शन तंत्र की जांच के लिए एक सुरुचिपूर्ण प्रणाली प्रदान करता है. यह अपेक्षाकृत सीधी है, जिसमें छह अतिरिक्त मांसपेशियों (ईओएम) को आंतरिक रूप से तीन कपाल तंत्रिकाएं शामिल होती हैं, जो आंख को स्थानांतरित करती हैं, और लेवेटर पैल्पे सुपीरियरिस (एलपीएस) जो पलक को उठाता है। ऑकुलोमोटर तंत्रिका एलपीएस और चार ईओएम को आंतरिक रूप देती है – अवर तिरछा और मध्यस्थ, अवर, और बेहतर आयटस की मांसपेशियों। अन्य दो नसों, trochlear और abducens, प्रत्येक केवल एक मांसपेशी innervate, बेहतर तिरछा और पार्श्व rectus मांसपेशियों, क्रमशः. नेत्र आंदोलनों एक आसान readout प्रदान करते हैं, दिखा अगर innervation उचित था, याद आ रही है, या aberant. इसके अतिरिक्त, मानव नेत्र आंदोलन विकार है कि न्यूरॉन विकास या एक्सॉन मार्गदर्शन में घाटे से परिणाम होते हैं, सामूहिक रूप से जन्मजात कपाल disinnervation विकारों (CCDs)1कहा जाता है.
इन लाभों के बावजूद नेत्र मोटर प्रणाली का प्रयोग एक्सॉन मार्गदर्शन अध्ययन2,3,4,5,6,7,8में बहुत कम होता है. 9 , 10, तकनीकी कमियों के कारण. इन विट्रो एक्सॉन मार्गदर्शन परख में कई नुकसान11हैं . सह-संस्कृति परख, जिसमें न्यूरोनल एक्सप्लांटलक्ष्य ऊतक12 या ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं13के एक्सप्लांट के साथ सुसंस्कृत होते हैं, एक्सप्लांट और लक्ष्य ऊतक के बीच दोनों समरूपता और सटीक स्थिति पर निर्भर करते हैं। धारी assays14,15, जिसमें दो संकेतों बारी धारियों और axons एक पट्टी पर अधिमानी विकास के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं में निर्धारित कर रहे हैं, केवल संकेत मिलता है कि एक सब्सट्रेट दूसरे के लिए बेहतर है, नहीं है कि या तो आकर्षक है या प्रतिकर्षण, या शारीरिक रूप से प्रासंगिक. Microfluidics कक्षों सटीक रासायनिक ढाल फार्म कर सकते हैं, लेकिन तनाव कतरनी के लिए बढ़ axons विषय16,17,18, जो उनके विकास को प्रभावित कर सकते हैं. इसके अलावा, इन दृष्टिकोणों में से प्रत्येक में, explants या अलग कोशिकाओं का संग्रह की आवश्यकता है कि outgrowing axons axotomized हो और इस प्रकार इन assays वास्तव में axon पुनर्जनन की जांच, बजाय प्रारंभिक एक्सॉन वृद्धि. अंत में, इन इन इन विट्रो दृष्टिकोण microenvironment कि axons और उनके पाठ्यक्रम के विभिन्न बिंदुओं के साथ संकेतों को अपनी प्रतिक्रियाओं को प्रभावित दूर, और परंपरागत रूप से केवल अलगाव में एक क्यू परीक्षण. इन नुकसान को जटिल, नेत्र मोटर प्रणाली में प्रत्येक नाभिक के छोटे आकार विच्छेदन या तो explants या dissociated संस्कृतियों के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बनाता है. इसके अतिरिक्त, नेत्र मोटर न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृतियों आमतौर पर विषम हैं, महत्वपूर्ण सेल मौत है, और घनत्व पर निर्भर हैं, कई भ्रूण से कोशिकाओं के पूलिंग की आवश्यकता होती है (Ryosuki फ़ूजी, व्यक्तिगत संचार). vivo तरीकों में, तथापि, नॉकआउट माउस मॉडल सहित, स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए अनुचित हैं, समय और खर्च की आवश्यकता दी.
संस्कृति के लिए विकसित तरीके पूरे भ्रूण19 पलायन कोशिकाओं की लेबलिंग की अनुमति20 या विशिष्ट अणुओं की नाकाबंदी21, लेकिन पूरे भ्रूण संस्कृतियों रोलर बोतलों में ऊष्मायन की आवश्यकता होती है जो लेबल की वास्तविक समय इमेजिंग precludes संरचनाओं. सर्जिकल तकनीक है कि भ्रूण के हेरफेर की अनुमति है और फिर बाद में आगे के विकास या तो गर्भाशय में या माँ के पेट में (प्लेसेंटल कनेक्शन बनाए रखने)22 भी संभव है, लेकिन ये भी समय चूक की अनुमति नहीं है इमेजिंग.
इन विट्रो परख की बाधाओं को दूर करने और संकेतन रास्ते की तेजी से स्क्रीनिंग की अनुमति देने के लिए , एक पूर्व विवो भ्रूण ीय संस्कृति तकनीक विकसित की गई थी23, परिधीय तंत्रिका वृद्धि के लिए एक पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल से अनुकूलित24. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, विकासशील oculomotor तंत्रिका अपने पथ के साथ आसपास के संरचनाओं के कई की उपस्थिति में समय के साथ छवि की जा सकती है, EOM लक्ष्यों सहित. संस्कृति मीडिया के लिए छोटे अणु अवरोधकों, विकास कारकों, या मार्गदर्शन संकेतों को जोड़कर, हम एक्सॉन पथ के साथ कई बिंदुओं पर मार्गदर्शन क्षोभ का आकलन कर सकते हैं, संभावित विकास और मार्गदर्शन कारकों के अधिक तेजी से मूल्यांकन की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पूर्व vivo टुकड़ा संस्कृति प्रोटोकॉल पारंपरिक एक्सॉन मार्गदर्शन पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है23पर ासाकीय ताक पर . प्रत्येक कपाल मोटर नाभिक का आकार एक सीमित कारक नहीं है, और कोई मुश्किल विच?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
राष्ट्रीय नेत्र संस्थान [5K08EY027850], राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और विकास संस्थान [U54HD090255], हार्वर्ड-विजन नैदानिक वैज्ञानिक विकास कार्यक्रम [5K12EY016335], शूरवीरों टेम्पलर नेत्र फाउंडेशन [कैरियर स्टार्टर] द्वारा प्रदान की गई अनुदान अनुदान, और बच्चों के अस्पताल नेत्र विज्ञान फाउंडेशन [फैकल्टी डिस्कवरी पुरस्कार]. ईसीई एक हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के अन्वेषक है।
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
