Summary
우리는 epifluorescence 현미경을 사용하여 애기장대 이중 수정에 있는 정액 핵 형태에 근거하여 성공또는 실패한 수정을 결정하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
꽃 피는 식물은 '이중 수정'이라는 독특한 성적 재생 시스템을 가지고, 있는 정자 세포의 각각은 정확하게 계란 세포 또는 중앙 세포와 융합. 따라서, 2개의 독립적인 풍부하게 함 사건은 거의 동시에 일어든다. 수정란 세포와 중앙 세포는 각각 접합체와 배유로 발전합니다. 따라서, 이중 풍부하게 함의 정밀한 통제는 계속되는 종자 발달을 위해 필수적이다. 이중 수정은 깊게 숨겨져 두꺼운 난소 와 난소 조직으로 덮여 여성 gametophyte (배아 낭)에서 발생합니다. 이 암술 조직 건설은 이중 수정의 관측 그리고 분석을 아주 어렵게 하고 이중 풍부하게 함의 기계장치에 관하여 많은 질문이 대답되지 않는 남아 있는 현재 상황을 만들었습니다. 수정 조절제에 대한 잠재적 인 후보의 기능적 평가를 위해, 풍부하게 함의 의 자형 분석이 중요하다. 애기장대에서수정의 완료를 판단하기 위해, 정자 핵을 표시하는 형광 신호의 모양은 지표로 사용됩니다. 수정하지 못하는 정자 세포는 여성 gametes 외부의 응축형 신호에 의해 표시되는 반면, 성공적으로 비옥하게 하는 정자 세포는 여성 gametes의 핵을 가진 karyogamy 때문에 decondensed 신호에 의해 표시됩니다. 여기서 설명된 방법은 생체 내 조건하에서 성공 또는 실패한 수정을 결정하는 도구를 제공한다.
Introduction
꽃 피는 식물은 이중 수정을 통해 씨앗을 생산, 직접 gamete 혈장 막에 국한 단백질 사이의 상호 작용에 의해 제어되는 과정1,2. 꽃 식물 남성 gametes, 정자 세포의 쌍, 꽃가루에서 개발. 수분 후에 자라는 꽃가루 관은 배아 낭에서 발전하는 여성 gametes, 계란 세포 및 중앙 세포에 한 쌍의 정자 세포를 전달합니다. 남성과 여성의 게임들이 만난 후, gamete 표면의 단백질은 인식, 부착 및 융합을 촉진하여 이중 수정을 완료합니다. 이전 연구에서, 수컷 게임테막 단백질 생성 세포 특이적 1(GCS1)/HAPLESS2(HAP2)3,4 및 GAMETE EXPRESSED 2(GEX2)5는 게임테 융합에 관여하는 수정 조절제로서 확인되었고, 첨부 파일각각. 우리는 최근에 gamete 상호 작용에 관여하는 풍부하게 함 조정기로 남성 gamete 특이적인 막 단백질, DUF679 DOMAIN 막 단백질 9 (DMP9)를 확인했습니다. 우리는 DMP9 발현의 감소가 A. 탈리아나6에서 이중 수정 동안 난자 세포 수정의 현저한 억제를 초래한다는 것을 것을을 발견했습니다.
이중 수정은 난소 조직으로 더 싸여 있는 배아 낭에서 발생하므로 이중 수정 과정의 상태를 관찰하고 분석하기가 어렵습니다. 이러한 이유로, 이중 수정 제어의 전체 메커니즘의 완전한 이해를 방해하는 많은 불분명한 점이 여전히 있다. 생체 내 조건에서 이중 수정 시 게임테의 거동을 추적하는 관찰 기법의 확립은 수정 조절제에 대한 잠재적 후보의 기능적 분석에 필수적입니다. 최근 연구는 gamete 세포 내 구조물이 형광 성 단백질로 표지되는 마커 선을 산출했습니다. 이 기사에서는 인위적으로 수분된 암술에서 파생된 배아 낭에서 발생한 이중 수정을 관찰하기 위한 간단하고 빠른 프로토콜을 보여줍니다. 정자 세포 핵 마커 라인 HTR10-mRFP7를사용하여, 각 여성 게임테의 수정 상태는 정자 핵 신호 형태에 기초하여 구별될 수 있다. 수정에서 정자 핵의 이러한 형태학적 변화에 초점을 맞춘 우리의 프로토콜은 통계적 증거를 위해 충분한 양의 데이터를 효율적으로 얻을 수 있습니다. HTR10-mRFP 배경을 이용한 DMP9-녹다운라인(DMP9KD/HTR10-mRFP)을남성 식물로 사용하여 단일 수정 패턴을 나타내게 하였다. 이 프로토콜은 또한 다른 풍부하게 함 조절제의 기능적 분석에 적합하다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 인공 수분
참고: 프로세스를 시작하기 전에 5번 집게가 필요합니다.
- 성장 챔버에서 16-h 빛/8-h 암흑 주기 하에서 22°C에서 A. 탈리아나(Col-0)를 성장시다.
참고: 잘라 서 드 싹의 개발을 촉진 하기 위해 가위로 첫 번째 개발 된 꽃 줄기를 제거 합니다. 활발하게 성장하는 식물 (첫 번째 줄기절단 후 2-3 주, 식물 높이 약 25cm)는 분석에 적합합니다. - 분리하려면, 5 위 집게를 사용하여 단계 118 (그림 1A)에서 꽃 봉오리의 혈팔 (그림1B),꽃잎 (그림1C)및 스타멘 (그림1D)을제거하십시오. 상단에 보이는 꽃잎의 비트와 꽃봉오리가 가장 좋습니다.
참고: 적합한 여성 게임 마커 라인을 사용합니다. 이 프로토콜에서는 야생 형 식물을 여성 부모로 사용했습니다. - 방출 후 15~18시간, 필라멘트를 집게로 꼬집어 138단계에서 DMP9 KD/HTR10-mRFP꽃의 스타맨을 취한다.
- 수분하기 위해, 부드럽게 dehiscent anther와 함께 여러 번 emasculated 암술의 낙인을 두드려.
2. 관찰을 위한 배풀의 준비
참고: 양면 테이프가 부착된 슬라이드 유리, 5호 집게, 27G 주사 바늘 및 해부 현미경이 필요합니다.
- 수분 (HAP) 후 7 ~ 8 시간, 암포를 수집하고 양면 테이프에 배치 한 다음 테이프에 암술문제를 해결하기 위해 집게로 부드럽게 누릅니다 (그림2A,A').
참고: 암술에서 대부분의 난자 적어도 하나의 꽃가루 튜브 10 HAP 9을받을 수 있습니다. 첫 번째 꽃가루 관에서 정자 세포 중 어느 하나 또는 어느 하나가 수정에 실패하면, 제 2 꽃가루 관은 수정 회복 시스템(10)으로인해 배란에 의해 끌릴 것이다. 첫 번째 꽃가루 관에서 정자 핵 형태를 분석하기 위해, 늦어도 10 HAP에 의해 배란 준비를 완료하는 것이 좋습니다. - 해부 현미경의 밑에 주입 바늘을 사용하여 난소의 상부 및 하부 단부를 잘라냅니다 (도2B,B').
- 주사 바늘의 끝을 이동시켜 리플럼(도2C,C')의양쪽을 따라 난소벽을 슬릿한다.
참고: 중격에서 배란 분리를 방지하기 위해 주사 바늘을 얕게 삽입하십시오. - 주사 바늘을 이용하여 난소벽을 적재하였다(도2D,D').
- 난것이 연결된 중격의 염기를 꼬집고 집게로 조심스럽게 들어 올립니다 (그림2E).
- 미끄럼 틀에 있는 물 한 방울로 난란을 옮기고, 형광 현미경으로 관찰하기 위해 커버 유리로 부드럽게 덮습니다(그림2E,E').
3. 현미경 검사법
참고: 이 프로토콜에서는 형광 필터 큐브(재료 표참조), 디지털 카메라 및 수반되는 소프트웨어가 장착된 에피플루온 현미경을 사용했습니다.
- 20x 또는 40x 대물 렌즈및 장착된 디지털 카메라를 사용하여 mRFP로 표지된 정자 핵을 포함하는 난자의 이미지를 획득합니다.
- 배아 낭에서 mRFP 표지된 정자 핵의 수를 확인합니다.
참고: 2개의 mRFP 표지된 정자 핵을 포함하는 난작은 통계 분석을 위한 인구 규모에 포함될 수 있다. - 배아 낭에서 각 mRFP 표지된 정자 핵의 모양 과 위치를 확인합니다.
참고: 꽃가루 튜브에서 방출 된 직후, 응축 된 mRFP 표지 정자 핵 한 쌍은 계란과 중앙 세포 사이에 국한됩니다. chalazal 끝의 측에서 검출된 decondensed mRFP 표지된 정액 핵은 중앙 세포 풍부하게 함을, 예를 들면 나타냅니다. 보충 도1에 도시된 바와 같이 적합한 여성 게임테 막 마커 라인을 사용함으로써, 정자 세포가 플라스모가미(막 융합 후 하지만 카요가미 전)를 겪고 있는지 여부를 명확하게 모니터링할 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMP9 KD/HTR10-mRFP로수분된 암술로부터의 난을 7-8 HAP에서 수집하고 관찰하였다.
대부분의 난란은 난자 세포 (micropylar 측) 및 중앙 세포 (charazal 끝 측) 핵 위치에서 2 개의 decondensed mRFP 표지된 정액 핵을 각각 포함했습니다 (그림3A),성공적인 이중 수정을 나타내는. 또한, 중앙 세포 핵에 decondensed mRFP 표지된 정자 핵플러스 응축된 mRFP 표지된 정자 핵을 포함하는 난자를난세포 외부의 응축된 mRFP 표지된 정자 핵(도 3B)에서 관찰하였고, 단일 수정을 나타낸다. 이중 수정에 실패한 경우, gcs1 돌연변이 정자 세포에서와 같이 난자 세포와 중앙 세포의 경계에서2개의 응축된 mRFP 표지된 정자 핵이 관찰되었다(그림3D)3,4 .
DMP9KD/HTR10-mRFP 꽃가루를 이용한 분석에서, 단일 응축된 mRFP 표지된 정자 핵을 함유하는 난자(도4A)또는 3개 이상의 mRFP 표지된 정자 핵(도4B)은거의 관찰되지 않았다.
그림 1: 꽃봉오리가 방출에 적합합니다. (A) 11단계에서 꽃봉오리를, 상단에 꽃잎의 비트를 보여준다. (B-D) 꽃봉오리를 제거한 꽃봉오리(B)와 꽃잎(C)을 제거한 다음 완전히 방출하였다(D). 안타사성은 아직 일어나지 않았다. 배율 표시줄 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 배란 샘플 제제의 흐름. 절차는 그림 (A -E)및 사진(A'-E')로표시됩니다. (A, A') 암술은 슬라이드 유리에 부착 된 양면 테이프에 배치되고, 상부 및 하부 끝은 주사 바늘로 차단됩니다. (B, B') 난소 벽은 replum의 양쪽을 따라 절개됩니다. (C, C') 난소 벽의 양면이 열리고, 상적이며, 고정을 위해 테이프에 누릅니다. (D, D') 난자 배열에 연결되는 중격은 드러난다. (E, E') 중격의 한쪽 끝은 집게로 꼬이고 들어 올려져 있습니다. 연결 난것이있는 중격은 슬라이드 유리에 물 방울로 옮겨집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 정자 핵 신호 형태에 의해 판단된 풍부하게 함 표현형 배란에. (A) 두 개의 decondensed mRFP 표지 된 정자 핵 (화살촉)에 의해 표시된 성공적인 이중 수정. (B) DMP9 KD/HTR10-mRFP정자 세포에 의한 단일 수정은 1개의 decondensed mRFP 표지된 정자 핵 (화살촉) 및 1개의 응축된 mRFP 표지된 정자 핵 (화살표)에 의해 표시되었다. (C) DMP9KD/HTR10-mRFP 정자 세포에 의한 이중 수정에 실패하여 2개의 응축된 mRFP 표지된 정자 핵(화살표)으로 나타났다. (D) gcs1HTR10-mRFP 정자 세포에 의한 이중 수정실패의 예. 난세포 핵(EN)이 RFP로 표지되는 마커 라인을 사용하였다. 2개의 응축된 mRFP 표지된 정액 핵 (화살표)는 18 HAP에서 풍부하게 함 없이 체포됩니다. (E) 난자의 개략적 그림. EC = 계란 세포, CC = 중앙 세포, SC = 시너지 세포, ES = 배아 낭, MP = 마이크로 필레, CHZ = 샬라잘 말단. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 기타 잠재력 시료 표현형. DMP9 KD/HTR10-mRFP로수분된 암술로부터의 난란은 거의 단일 응축된 mRFP 표지된 정자 핵(A) 또는 3개 이상의 응축된 mRFP 표지 된 정자 핵(B) (화살표)을 함유하지 않습니다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 수정 하는 동안 plasmogamy에서 응축 된 정자 핵, 여성 플라즈마 막 마커 라인과 조합으로 판단. pFWA::중앙 세포 혈장 막이 가시화되는 GFP-PIP는 여성 모체(GFP)로 사용하였다. GFP-PIP는 또한 엔도 멤브레인12를라벨. 배란에는 두 개의 응축된 mRFP 표지된 정자 핵(화살표; RFP)를 참조하십시오. charazal 끝 측에서 RFP 신호 (화살표) 중앙 세포에 도시 된 (병합), 정자 핵은 플라스모가미에 있음을 나타내는 (gamete 막 융합 후, 하지만 karyogamy 전에). 오른쪽 패널은 병합된 이미지에서 파선으로 둘러싸인 영역의 배율입니다. 별표로 표시된 빈 영역은 중앙 세포 핵의 위치에 해당합니다. 파선은 계란 세포를 향한 중앙 세포의 윤곽을 나타냅니다. 배율 막대 = 20 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HTR10-mRFP 라벨은 친자 염색질(즉, 정자 세포 핵을 시각화함)이며, 이중 수정에서의 역학은7. 꽃가루 관에서 방출 직후, HTR10-mRFP 표지된 정액 핵은 아직도 응축됩니다. 그러나, 각각의 정자 핵은 가메라미에서 수정된 여성 게임테 핵과 병합시 에이치막 융합 7후3~4시간 동안 소멸된다. 수정되지 않은 정자 세포는 gcs1 정액 세포가 풍부하게 함 없이 체포되는 배아 낭에서 도시된 것과 같이 응축된 남아 있습니다 (그림3D). 보통, 비옥한 HTR10-mRFP가 꽃가루 모체로 사용될 때, 57.9% ± 17.8% (평균 ± s.d.; n = 16 암술) 7-8 HAP에서 암술의 두 개의 mRFP 표지 된 정액 신호를 포함하고, 거의 모든 신호 (97.2%) 성공적인 이중 수정을 반영하여 감밀도가 제거됩니다(그림 3A에유사한 신호 패턴이 표시됨). DMP9KD/HTR10-mRFP의경우, 2개의 mRFP 표지된 정자 핵을 함유하는 난것이 HTR10-mRFP의것과 유사한 주파수에서 관찰되었지만, 그 중 17.6%는 단일 수정을 보였다 6. 우리는 epifluorescence 현미경을 사용하여 생체 내 조건 하에서 많은 수의 난자의 관찰을 위해 HTR10-mRFP 역학을 채택했습니다. 이 프로토콜은 간단하고 빠르기 때문에 통계적 증거를 위해 충분한 데이터를 수집할 수 있습니다. 이 프로토콜을 제1 예로서 사용하여, DMP9KD/HTR10-mRFP 정자 세포에 의한중앙 세포의 단일 수정의 중요성이 6으로 입증되었다.
하나의 꽃가루 튜브에서 파생 된 HTR10-mRFP 표지 정자 핵의 형태학적 차이에 따라, 수정 패턴은 세 가지 표현형으로 분류됩니다 : (1) 성공적인 이중 수정, 이는 두 개의 decondensed 특징 HTR10-mRFP 표지된 정자 핵 (그림3A); (2) 단일 수정, 하나의 응축 된 HTR10-mRFP 표지 정자 핵과 하나의 decondensed HTR10-mRFP 표지 정자 핵을 특징으로 (그림3B); 및 (3) 이중 수정에 실패, 이는 두 응축 HTR10-mRFP 표지정자 핵 (그림 3C).
표현형 (2) 및 (3)의 다른 잠재적 인 원인을 고려해야한다. 정자 세포는 각각 반체내 체외 배양 조건하에서배아 낭으로 방출된 후 몇 분 후에 난자 세포 또는 중앙 세포와 함께 플라스모가미를 시작한다고 보고되었다 11. 또한, 난세포와중앙세포의수정순서에 대한 선호도는 없지만, 제1 및 제2 수정사이에는 몇 분의 시간 지연이 존재한다. 따라서 표현형(2)에서 응축되고 감작된 정자 핵한 쌍은 단일 수정 대신 수정 사이의 시간 지연을 나타낼 수 있다. 표현형(2)에서 유의한 빈도에서 단일 수정의 발생을 확인하기 위해 통계 분석에 충분한 다수의 샘플을 검사해야 합니다. 2개의 응축된 정자 핵을 가지는 표현형(3)(그림3C)은혈장 막 융합(12) 또는 플라스모가미와 카요가미 사이의 기간 이전에 정자 세포의 부동성 기간을 반영할 수 있었다. 따라서, 7-8 HAP에서 2개의 응축된 정자 핵은 이중 풍부하게 함의 '실패'를 완전히 반영하지 않으며, 이중 수정의 성공 또는 실패를 평가하기 위하여 수분 후에 나중에 난을 관찰할 필요가 있다. 이와 관련하여, 16-18 HAP에서 난자 관찰은 권장, 난자의 대부분은 첫 번째 꽃가루 튜브에 의해 전달 된 정자 세포와 이중 수정을 완료했기 때문에, 및 수정되지 않은 정자 핵의 HTR10-mRFP 신호는 다음까지 남아있을 것 그림 3D에표시된 바와 같이 수분의 날.
단일 응축된 HTR10-mRFP 표지된 정자 핵의패턴(그림 4A)은 거의 검출되지 않았다. 이러한 분석에서, 3개 이상의 HTR10-mRFP 표지된 정자 핵은 또한 수정회수시스템(10)에 의한 제2 꽃가루관 수용으로 인해 드문 경우(도4B)로검출되었다. 이 프로토콜에서는, 이 케이스는 1개의 꽃가루 관에서 파생된 2개의 정액 세포의 행동을 추적하는 것이 정확한 평가를 위해 중요하기 때문에, 데이터에서 제외되었습니다.
배아 낭에서 여성 게이머의 위치에 대한 극성이 잘 조절되기 때문에(즉, 난자 세포와 중앙 세포가 각각 미세필라와 샬라잘 측에서 분화됨), 여성 게이머가 비옥하게 하는 상대적 에 의해 판단될 수 있다. mRFP 표지된 정자 핵의 위치. 그러나, 두 상태 모두 응축된 정자 핵 신호에 의해 표시되기 때문에, 비수정 상태와 플라스모가미 상태를 구별하는 데 한계가 있다. 정자 핵이 응축될 때 게임테막 융합 후 플라스모가마이가 발생했는지 여부를 정확하게 평가하기 위해서는, 다카하시 등(2018)에 의해 보고된 바와같이 여성 게임테막 마커 라인을 사용해야 한다. 예를 들어, 중앙 세포 혈장 멤브레인이 가시화된 pFWA::GFP-PIP 식물(12)이 여성 부모로서 사용되었을 때, 중앙 세포와 융합된 정자 세포가 플라스모가미(보충도 1)에 있었다는 것이 분명하다. ).
요약하면, 여기에 설명된 프로토콜은 각 여성 게임에서 수정의 성공 또는 실패에 대한 통계적 평가에 사용될 수 있다. 암혈막 마커의 고용은 플라스모가미를 판단하기 위해 필요하지만, 우리의 방법은 수정 조절기의 기능적 분석에 유용하다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 일본과학진흥회(JP17H05832~T.I.)의 후원을 받았으며, 지바대학 지바대학 의 식물화학 식물 분자과학 전략적 우선연구 추진 프로그램의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H.
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M.
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
