Summary
Мы демонстрируем метод определения успешного или неудачного оплодотворения на основе сперматозоиды ядерной морфологии в арабидопсисдвойном двойном оплодотворении с помощью эпифлюоресцентного микроскопа.
Abstract
Цветущие растения имеют уникальную систему полового воспроизводства, называемую «двойное оплодотворение», в которой каждая из сперматозоидов точно сливается с яйцеклеткой или центральной клеткой. Таким образом, два независимых события оплодотворения происходят почти одновременно. Оплодотворенная яйцеклетка и центральная клетка развиваются в зиготе и эндосперме, соответственно. Поэтому для последующего развития семян необходим точный контроль за двойным оплодотворением. Двойное оплодотворение происходит в женском гаметофите (эмбрио-мешок), который глубоко скрыт и покрыт толстыми тканями яйчи и яичников. Эта конструкция пестильной ткани затрудняет наблюдение и анализ двойного оплодотворения и создает нынешнюю ситуацию, в которой многие вопросы, касающиеся механизма двойного оплодотворения, остаются без ответа. Для функциональной оценки потенциального кандидата на оплодотворение важен фенотипический анализ оплодотворения. Для того чтобы судить завершение оплодотворения в Arabidopsis thaliana,формы сигналов флуоресценции маркируя ядра спермы использованы как индикаторы. Клетка спермы которая не усваивает показана сжатым сигналом флуоресценции вне женского gametes, тогда как клетка спермы которая успешно оплодотворяет показана decondensed сигналом из-за karyogamy с женским ядром gametes. Описанный здесь метод предоставляет инструмент для определения успешного или неудачного оплодотворения в условиях in vivo.
Introduction
Цветущие растения производят семена путем двойного оплодотворения, процесс, который непосредственно контролируется взаимодействия миноносов, локализованных на гамете плазменной мембраны1,2. Цветущее растение самцов гамет, пара сперматозоидов, развивается в пыльце. Пыльца трубки, которая растет после опыления поставляет пару сперматозоидов для женщин гамет, яйцеклетки и центральной клетки, которые развиваются в эмбриона мешок. После того, как встречаются самцы и женщины- гаметы, белки на поверхности гамет способствуют распознаванию, привязанности и синтезу для полного двойного оплодотворения. В предыдущих исследованиях, мужские гаметовые мембранные белки GENERATIVE CELLSPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2) 3,4 и GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 были определены как регуляторы оплодотворения, участвующие в синтезе гамет и вложения, соответственно. Недавно мы определили мужской гамет-специфический мембранный белок, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), как регулятор оплодотворения, участвующий в взаимодействии гамет. Мы обнаружили, что уменьшение экспрессии DMP9 приводит к значительному ингибированию оплодотворения яйцеклеток во время двойного оплодотворения в A. thaliana6.
Как двойное оплодотворение происходит в эмбриона мешок, который встроен в яйлю, которая дополнительно обернутые с яичников ткани, трудно наблюдать и анализировать состояния двойных процессов оплодотворения. По этой причине до сих пор существует много неясных моментов, которые препятствуют полному пониманию всего механизма контроля за двойным оплодотворением. Создание методов наблюдения для отслеживания поведения гамет во время двойного оплодотворения в условиях in vivo необходимо для функционального анализа потенциальных кандидатов на органы оплодотворения. Недавние исследования дали маркерные линии, где гамет субклеточные структуры помечены флуоресцентными белками. В этой статье мы демонстрируем простой и быстрый протокол для наблюдения за двойным оплодотворением, которое произошло в эмбриональном мешке, полученном из искусственно опыляемых пестики. Использование сперматозоидов ядро маркера линии HTR10-mRFP7, состояние оплодотворения каждой женщины гаметы могут быть дискриминированы на основе спермы ядерной морфологии сигнала. Наш протокол, посвященный такому морфологическому изменению ядер спермы при оплодотворении, может эффективно получить достаточное количество данных для статистического подтверждения. DMP9-нокдаун линии с HTR10-mRFP фон (DMP9KD/HTR10-mRFP) был использован в качестве мужских растений, чтобы показать одну модель оплодотворения. Протокол также подходит для функционального анализа других регуляторов оплодотворения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Искусственное опыление
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом процесса требуется пара щипков No 5.
- Выращивайте A. thaliana (Col-0) при 22 градусах Цельсия при 16-h светлом/8-h темном цикле в камере роста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезать и удалить первый развитый цветок стебель с ножницами для содействия развитию подмышечных почек. Активно растущие растения (через 2-3 недели после разрезания первого стебля; рост растений около 25 см) подходят для анализа. - Чтобы выхозовать, удалить sepal(Рисунок 1B), лепесток (рисунок1C), и тычинки (Рисунок1D) цветочных почек на стадии 118 (Рисунок1A) с помощью No 5 щипцы. Бад с кусочками лепестков видели в верхней лучше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте подходящую женскую линию маркера гамета. В этом протоколе мы использовали растение дикого типа в качестве женского родителя. - Пятнадцать до восемнадцати часов после выхозывания, возьмите тычинки DMP9KD/ HTR10-mRFP цветок на стадии 13 8, щипать нить с щипцы.
- Чтобы опылить, осторожно погладить клеймо выхолощенного pistil несколько раз с дехисточаемым пыльцой.
2. Подготовка Овуле для наблюдения
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуются следующие элементы: слайд-стекло с двусторонним лентой, щиптем No 5, инъекционной иглой 27 G и рассекающим микроскопом.
- 7 до 8 ч после опыления (HAP), соберите пестик и поместите его на двусторонню ленту, затем нажмите осторожно с щипцы, чтобы исправить пестик на ленте (Рисунок 2A,A ').
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство овулей в пестике получают по крайней мере одну пыльцу трубки 10 HAP9. Если обе или любой из сперматозоидов из первой пыльцы трубки не удобрять, вторая пыльца трубки будут привлечены яйчий из-за системы восстановления оплодотворения10. Для анализа морфологии ядер спермы из первой пыльцы трубки, рекомендуется завершить подготовку яйцеклеток на 10 HAP самое позднее. - Отрежьте верхний и нижний концы яичника с помощью инъекционной иглы под рассекающим микроскопом(рисунок 2B,B').
- Прорезаните стенку яичников вдоль обеих сторон ремума(рисунок 2C,C') путем перемещения кончика иглы инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте инъекционную иглу неглубоко, чтобы предотвратить отделение яйчи от перегородки. - Эверт стенки яичников с помощью инъекционной иглы(Рисунок 2D,D').
- Pinch основание перегородки, к которой связаны яймы, и поднимите его осторожно с щипками(рисунок 2E).
- Перенесите овули в каплю воды на слайд-стекле и аккуратно накройте крышкой для наблюдения под флуоресценционным микроскопом(рисунок 2E,E').
3. Микроскопия
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали эпифлюоресцентный микроскоп, оснащенный кубиком флуоресценционного фильтра (см. ТаблицаМатериалов), цифровой камерой и сопутствующим программным обеспечением.
- Приобретайте изображения ядер спермы, содержащих ядра спермы, помеченные mRFP с помощью объектива 20x или 40x объективной и оборудованной цифровой камеры.
- Подтвердите количество ядер спермы с маркировкой mRFP в эмбрионном мешке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Овулы, содержащие два mRFP-маркированных ядрах спермы, могут быть включены в численность населения для статистического анализа. - Подтвердите форму и положение каждого ядра спермы с маркировкой mRFP в эмбрионном мешке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу же после освобождения из пыльцы трубки, пара конденсированных mRFP помечены ядра спермы локализуются между яйцом и центральной клеткой. Одеконденсированное ядро спермы mRFP, обнаруженное на стороне конца чалазал, указывает, например, на оплодотворение центральных клеток. С помощью подходящей женской гаметом мембранной маркерной линии, как показано на дополнительной рисунке 1, независимо от того, проходит ли сперматозоидная клетка плазмогамия (после мембранного синтеза, но до карйогими) можно четко контролировать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Овулы из пестика, опыляемые DMP9KD/HTR10-mRFP, были собраны при 7-8 HAP и соблюдены.
Большинство овулей содержали два деконденсированных mRFP-маркированных ядер спермы в яйцеклетки (микропилярной стороне) и центральной клетке (charazal конце стороны) ядра позиции, соответственно (Рисунок 3A), что свидетельствует об успешном двойном оплодотворении. Кроме того, были замечены яйцеклетки, содержащие одеденденденное ядро спермы mRFP с меткой mRFP в ядре центральной клетки плюс конденсированное ядро спермы mRFP, маркированное спермой за пределами яйцеклетки(рисунок 3B), что указывает на однократное оплодотворение. В случае неудачного двойного оплодотворения, два сгущенных mRFP-маркированных ядер спермы наблюдались на границе яйцеклетки и центральной клетки(рисунок 3C), как и в GCs1 мутантных сперматозоидов (Рисунок3D)3,4 .
В анализе с использованием DMP9KD/HTR10-mRFP пыльцы, яйцеклеток, содержащих один конденсированный mRFP-помечены ядра спермы(Рисунок 4A) или три или более mRFP помечены ядра спермы (Рисунок4B) редко наблюдались.
Рисунок 1: Цветочные бутоны, подходящие для выхобливания. (A) цветочный бутон на стадии 11, показывая биты лепестков в верхней части. (B-D) Цветочный бутон, в котором были удалены sepals (B) и лепестки (C), и что было затем выхолощенный полностью (D). Обезвращенность муравейна еще не произошла. Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Поток подготовки образца яйчи. Процедуры показаны иллюстрациями(A -E)и фотографиями (A' -E'). (A, A') На двустороннюю ленту, прикрепленную к слайд-стеклу, ставится пестиль, а верхние и нижние концы отрезаются инъекционной иглой. (B, B') Стенка яичника разрезается по обе стороны ремряда. (C, C') Обе стороны стен яичника открыты, всегда прикрепляются и прижимаются к ленте для фиксации. (D, D') Перегородка, где яйточки соединены массивами, подвергается воздействию. (E, E') Один конец перегородки ущипнул и поднял с щипками. Перегородка с соединительными яймами передается в каплю воды на слайд-стекле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Фенотипы оплодотворения судят по морфологии ядерного сигнала спермы в яйке. (A) Успешное двойное оплодотворение, указанное двумя деконденсированными mRFP-маркированными ядрами спермы (стрелками). (B) Однократное оплодотворение DMP9KD/HTR10-mRFP сперматозоидов, указанных одним деконденсированным ядром спермы mRFP (стрелка) и одним конденсированным ядром спермы mRFP (стрелка). (C) Неудачное двойное оплодотворение сперматозоидами DMP9KD/HTR10-mRFP, указанные двумя сгущенными ядрами спермы mRFP (стрелками). (D) Пример неудачного двойного оплодотворения сперматозоидами GCs1HTR10-mRFP. Использовалась линия маркера, в которой использовалось ядро яичной клетки (EN), маркированное RFP. Два сгущенных mRFP-маркированных ядер спермы (стрелки) арестованы без оплодотворения в 18 HAP. (E) Схематическая иллюстрация яйцете. EC - яйцеклетка, CC - центральная клетка, SC - синергидные клетки, ES - эмбриональный мешок, МП - микропил, Ch- и chalazal конца. Шкала баров 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Другие возможности фенотипов оплодотворения. Овули из пестика, опыляемого DMP9KD/HTR10-mRFP редко содержат одно сгущенное ядро спермы mRFP (A), или три или более конденсированные ядра спермы mRFP (B ) (стрелки). Шкала баров 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная диаграмма 1: Конденсированные ядра спермы при плазмогамии во время оплодотворения, судя по комбинации с женской линией маркера плазменной мембраны. pFWA::GFP-PIP, где визуализирована плазменная мембрана центральной клетки, использовалась в качестве женского родителя (GFP). GFP-PIP также этикетки эндо мембраны12. Яйцерод содержит два сконденсированных mRFP-маркированных ядер спермы (стрелки; ПФР). Сигнал RFP на стороне charazal конца (стрелка) показан в центральной клетке (Merge), показывая что ядро спермы находится в плазмогамии (после сплавливания мембраны gamete, но перед karyogamy). Панель справа представляет собой увеличение области, окруженной разбитыми линиями на объединенном изображении. Пустая область, отмеченная звездочкой, соответствует положению ядра центральной клетки. Пунктирной линии указывает на контур центральной ячейки, обращенной к яичной ячейке. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HTR10-mRFP этикетки отцовского хроматина (т.е. визуализирует ядра сперматозоидов), и динамика в двойном оплодотворении были зарегистрированы7. Сразу же после выпуска из пыльцы трубки, HTR10-mRFP помечены ядра спермы по-прежнему конденсируются. Тем не менее, каждый из ядер спермы decondensed при слиянии с оплодотворенной женской гаметов ядро в karyogamy три-четыре часа после гамет мембраны слияния7. Неоплодотворенные сперматозоиды остаются конденсированными, как показано в эмбрионе мешок, в котором GCs1 сперматозоидов арестованы без оплодотворения(Рисунок 3D). Обычно, когда плодородный HTR10-mRFP используется в качестве родителя пыльцы, 57,9% и 17,8% (средний s.d.; n 16 пестики) яйцеклеток в пестиле на 7-8 HAP содержат два mRFP-маркированных ядер спермы сигналов, и почти все сигналы (97,2%) обезкисаниваются, отражая успешное двойное оплодотворение (аналогичная схема сигнала показана на рисунке 3A). В случае DMP9KD/HTR10-mRFP, овули, содержащие два mRFP-маркированных ядер спермы наблюдались на той же частоте, что и HTR10-mRFP, но 17,6% из них показали однооплодное оплодотворение6. Мы приняли динамику HTR10-mRFP для наблюдения большого количества яйцетев в условиях in vivo с помощью эпифлюоресцентного микроскопа. Протокол прост и быстр, что позволяет собирать достаточные данные для статистического подтверждения. Используя этот протокол в качестве первого экземпляра, значение одного оплодотворения центральной клетки DMP9KD/HTR10-mRFP сперматозоидов было доказано6.
На основе морфологических различий ядер спермы hTR10-mRFP, полученных из одной пыльцы, модели оплодотворения классифицируются на три фенотипа: (1) успешное двойное оплодотворение, которое характеризуется двумя обезденными HTR10-mRFP-маркированные ядра спермы(рисунок3A); (2) однократное оплодотворение, которое включает в себя одно конденсированное ядро спермы HTR10-mRFP и одно деконденсированное ядро спермы HTR10-mRFP(рисунок3B); и (3) не удалось двойное оплодотворение, которое имеет два конденсированных HTR10-mRFP-помечены ядра спермы(рисунок 3C).
Следует учитывать другие потенциальные причины фенотипов (2) и (3). Было сообщено, что сперматозоиды соответственно начинают плазмогамия с яйцеклетки или центральной клетки через несколько минут после освобождения в эмбрион мешок под полу-в пробирке культурных условий11. Кроме того, между первым и вторым оплодотворением существует временной лаг в несколько минут, хотя нет предпочтения порядку оплодотворения яйцеклетки и центральной клетки11. Таким образом, пара конденсированных и деконденсированных ядер спермы в фенотипе (2) может указывать на временной лаг между оплодотворением вместо одного оплодотворения. Для подтверждения возникновения однократного оплодотворения на значительной частоте в фенотипе (2) следует изучить ряд образцов, достаточных для статистического анализа. Фенотип (3), который имеет два конденсированных ядра спермы(Рисунок 3C), может отражать период неподвижности сперматозоидов до слияния плазменной мембраны12 или период между плазменным и карйогими. Таким образом, два сгущенных ядра спермы на 7-8 HAP не в полной мере отражают "провал" двойного оплодотворения, и необходимо наблюдать яйцеклеток на более позднее время после опыления, чтобы оценить успех или неудачу двойного оплодотворения. В этой связи рекомендуется наблюдать за яйцеклеткой в 16-18 HAP, поскольку большинство яйцеклеток завершили бы двойное оплодотворение сперматозоидами, доставляемыми первой пыльцой, а сигналы HTR10-mRFP неоплодносных ядер спермы останутся до следующего день опыления, как показано на рисунке 3D.
Картина одного сгущенного ядра спермы HTR10-mRFP(рисунок 4A) редко обнаруживалась, что, вероятно, было связано с быстрым исчезновением другого сигнала отцовской HTR10-mRFP в оплодотворенной женской гамете в результате одного оплодотворения. В этом анализе, три или более HTR10-mRFP-метки ядра спермы были также обнаружены как редкий случай(Рисунок 4B), из-за второго принятия пыльцы трубки системы восстановления10. В этом протоколе, эти случаи были исключены из данных, потому что отслеживание поведения двух сперматозоидов, полученных из одной пыльцы трубки имеет решающее значение для точной оценки.
В виду того что полярность для положений женских gametes в мешке зародыша наилучшим образом отрегулирована (т.е., клетка яйцеклетки и центральная клетка дифференцируют на micropylar и chalazal стороне, соответственно), который женский gamete удобряет можно судить относительное положения ядер спермы с маркировкой mRFP. Однако существует ограничение в различении неоплодотворенных и плазмогамии, потому что оба состояния указаны сигналом ядер конденсированных сперматозоидов. Для точного определения плазмогамии после слияния мембраны гамет-мембраны произошло или нет, когда ядра спермы конденсируются, необходимо использовать женские линии метеора, как сообщает Takahashi et al. (2018)6. Например, когда pFWA::GFP-PIP завод12, в котором центральная плазменная мембрана клетки была визуализирована была использована в качестве родителя женского пола, ясно, что сперматозоидная клетка сливается с центральной клеткой была в плазмогамии (Дополнительная рисунок 1 ).
Таким образом, наш протокол, описанный здесь, может быть использован для статистической оценки успеха или неудачи оплодотворения в каждой женской гамете. Хотя использование женской плазменной мембранной маркера требуется, чтобы судить о плазмогамии, наш метод полезен для функционального анализа регулятора оплодотворения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке KAKENHI грант (JP17H05832 т. И.) и за счет финансирования из стратегического приоритетного программы содействия исследованиям по фитохимическим растениям молекулярных наук, Университет Тиба (Япония).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H.
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M.
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
