Summary
Nós demonstramos um método para determinar a fecundação bem sucedida ou falhada com base na morfologia nuclear do esperma na fertilização dobro de Arabidopsis usando um microscópio da epifluorescência.
Abstract
As plantas de florescência têm um sistema sexual original da reprodução chamado ' fertilização dobro ', em que cada um das pilhas do sperm funde precisamente com uma pilha de ovo ou uma pilha central. Assim, dois eventos de fertilização independente acontecem quase que simultaneamente. A pilha de ovo fertilizada e a pilha central tornam-se no zigoto e no endosperm, respectivamente. Portanto, o controle preciso da dupla adubação é essencial para o desenvolvimento de sementes que se seguiu. A fertilização dupla ocorre no gametófito fêmea (saco do embrião), que é profundamente escondida e coberta com os tecidos grossos do óvulo e do ovário. Esta construção do tecido do pistilo faz a observação e a análise da fertilização dobro completamente difícil e criou a situação atual em que muitas perguntas a respeito do mecanismo da fertilização dobro permanecem sem resposta. Para a avaliação funcional de um candidato potencial para o regulador da fertilização, a análise fenotípica da fertilização é importante. Para julgar a conclusão da fertilização em Arabidopsis Arabidopsis thaliana, as formas de sinais de fluorescência rotulando núcleos de espermatozóides são usadas como indicadores. Uma célula espermática que não fertilizar é indicada por um sinal de fluorescência condensado fora das gametas femininas, enquanto uma célula espermática que fertiliza com sucesso é indicada por um sinal desnaturado devido à carigamia com o núcleo feminino dos gametas. O método descrito aqui fornece uma ferramenta para determinar a fertilização bem-sucedida ou fracassada em condições in vivo.
Introduction
Plantas floridas produzem sementes através de dupla adubação, um processo que é controlado diretamente por interações entre proteínas localizadas na membrana plasmáticadegameta 1,2. Os gametas masculinos da planta de florescência, um par de pilhas de esperma, desenvolvem-se no pólen. Um tubo de pólen que cresce após a polinização entrega um par de células espermáticas para gametas femininas, uma célula de ovo e uma célula central, que se desenvolvem em um saco embrionário. Depois que os gametas masculinos e femininos se encontram, as proteínas na superfície do gameta promovem o reconhecimento, o acessório, e a fusão para terminar a fertilização dobro. Em estudos prévios, as proteínas da membrana do gameta masculino Generative Cell SPECIFIC 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4e gameta expressadas 2 (GEX2)5 foram identificadas como reguladores de fertilização envolvidos na fusão de gametas e acessório, respectivamente. Nós identificamos recentemente uma proteína gameta-específica masculina da membrana, proteína 9 da membrana do domínio DUF679 (DMP9), como um regulador da fertilização envolvido na interação do gameta. Verificou-se que uma diminuição da expressão de DMP9 resulta em inibição significativa da adubação de células de ovo durante a dupla adubação em a. Arabidopsis thaliana6.
Como a fertilização dupla ocorre em um saco embrionário, que é incorporado em um óvulo que é mais envolvido com o tecido do ovário, é difícil observar e analisar os Estados de processos de fertilização dupla. Por esta razão, ainda há muitos pontos obscuros que impedem uma compreensão completa de todo o mecanismo de controle de fertilização dupla. O estabelecimento de técnicas de observação para traçar o comportamento dos gâmetas durante a dupla adubação condições in vivo é indispensável para a análise funcional de potenciais candidatos a reguladores de fertilização. Estudos recentes produziram linhas de marcador onde as estruturas subcelulares do gameta são rotuladas com proteínas fluorescentes. Neste artigo, demonstramos um protocolo simples e rápido para observar a dupla adubação que ocorreu em um saco embrionário derivado de pistilos artificialmente polinados. Usando a linha do marcador do núcleo da célula espermática HTR10-MRFP7, o estado da fertilização de cada gameta fêmea pode ser discriminado com base na morfologia nuclear do sinal do esperma. Nosso protocolo focalizando em tal mudança morfológica dos núcleos do esperma na fertilização pode eficientemente obter uma quantidade suficiente de dados para a prova estatística. Uma linha DMP9-knockdown com fundo HTR10-MRFP (DMP9KD/HTR10-MRFP) foi usada como plantas masculinas para mostrar um único teste padrão da fecundação. O protocolo também é adequado para a análise funcional de outros reguladores de fertilização.
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Protocol
1. polinização artificial
Nota: Antes de iniciar o processo, é necessário um par de fórceps n º 5.
- Cresça a. Arabidopsis thaliana (Col-0) em 22 ° c um ciclo escuro de 16-h Light/8-h em uma câmara de crescimento.
Nota: Corte e remova a primeira haste desenvolvida da flor com as tesouras para promover o desenvolvimento de botões axilar. As plantas vigorously crescentes (2-3 semanas após o corte da primeira haste; a altura da planta aproximadamente 25 cm) são apropriadas para a análise. - Para emascular, remover Sepal (Figura 1b), pétala (Figura 1C), e estame (Figura 1D) de botões florais no estágio 118 (Figura 1a) usando o fórceps no. 5. Bud com pedaços de pétalas visto na parte superior é o melhor.
Nota: Use uma linha de marcador fêmea apropriada do gameta. Neste protocolo, utilizou-se um tipo de planta selvagem como o pai do sexo feminino. - Quinze a dezoito horas após a emasculação, tome o estame de uma flor de DMP9KD/HTR10-MRFP no estágio 138 apertando o filamento com fórceps.
- Para polinizar, gentilmente Pat o estigma de um pistilo emasculado várias vezes com um Anther deiscentes.
2. preparação de ovule para observação
Nota: Os seguintes itens são necessários: um slide de vidro com fita dupla face anexado, no. 5 fórceps, uma agulha de injeção de 27 G, e um microscópio de dissecação.
- 7 a 8 h após a polinização (HAP), recolher o pistilo e colocá-lo na fita dupla face, em seguida, pressione suavemente com fórceps para fixar o pistilo na fita (Figura 2a, a ').
Nota: A maioria dos óvulos em um pistilo receber pelo menos um tubo de pólen 10 Hap9. Se ambas ou qualquer uma das células espermáticas do primeiro tubo de pólen não fertilizar, um segundo tubo de pólen seria atraído pelo óvulo devido ao sistema de recuperação da fertilização10. Para analisar a morfologia dos núcleos espermáticos do primeiro tubo polínico, recomenda-se concluir a preparação dos óvulo por 10 HAP, o mais tardar. - Corte as extremidades superior e inferior do ovário usando uma agulha de injeção um microscópio de dissecação (Figura 2b, B ').
- Cortar a parede do ovário ao longo de ambos os lados do replum (Figura 2C, C ') movendo a ponta da agulha de injecção.
Nota: Insira a agulha de injeção de forma superficialmente para evitar a separação dos óvulo do septo. - Evert a parede do ovário usando a agulha da injeção (Figura 2D, D ').
- Aperte a base do septo ao qual os óvulos estão ligados e levante-o cuidadosamente com o fórceps (Figura 2e).
- Transfira os óvulos em uma gota de água em um vidro de corrediça, e cubra delicadamente com um vidro da tampa para a observação um microscópio de fluorescência (Figura 2e, e ').
3. microscopia
Nota: Neste protocolo, utilizou-se um microscópio de epifluorescência equipado com um cubo de filtro de fluorescência (ver tabela de materiais), uma câmera digital e o software de acompanhamento.
- Adquira imagens de óvulos contendo núcleos de espermatozóides rotulados com mRFP usando uma lente objetiva de 20x ou 40x e a câmera digital equipada.
- Confirme o número de núcleos de espermatozóides rotulados por mRFP em um saco embrionário.
Nota: Ovules contendo dois núcleos de espermatozóides rotulados por mRFP podem ser incluídos no tamanho da população para análise estatística. - Confirme a forma e a posição de cada núcleo de esperma rotulado por mRFP em um saco embrionário.
Nota: Imediatamente após ser liberado de um tubo do pólen, um par de núcleos condensados mRFP-etiquetados do esperma é localizado entre o ovo e a pilha central. Um núcleo decondensed do esperma de MRFP-etiquetado detectado no lado da extremidade Haustório indica a fertilização central da pilha, por exemplo. Usando uma linha de marcador fêmea apropriada da membrana do gameta, como mostrado na Figura 1 suplementar , se ou não a pilha de esperma está submetendo-se à plasmogamia (após a fusão da membrana mas antes do karyogamy) pode ser monitorado claramente.
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Representative Results
Ovules de um pistilo polinizadas com DMP9KD/HTR10-MRFP foram coletados em 7-8 HAP e observados.
A maioria dos óvulos continha dois núcleos de espermatozóides desnaturados com mRFP na célula do ovo (lado micropylar) e as posições do núcleo da célula central (lado final do charazal), respectivamente (Figura 3a), indicando dupla fertilização bem-sucedida. Além disso, foram observados óvulos contendo um núcleo de espermatozóide desnaturado com mRFP no núcleo celular central, além de um núcleo de espermatozóides com rótulo mRFP condensado fora da célula de ovo (Figura 3B), indicando adubação única. No caso de dupla adubação com falha, dois núcleos de espermatozóides condensados com mRFP foram observados no limite da célula de ovo e da célula central (Figura 3C), como em células de espermatozóides mutantes Gcs1 (Figura 3D)3,4 .
Na análise usando o pólen de DMP9KD/HTR10-MRFP , os óvulos que contêm um único núcleo condensado MRFP-etiquetado do esperma (figura 4a) ou três ou mais núcleos do esperma etiquetados por MRFP (Figura 4B) foram observados raramente.
Figura 1: botões florais adequados para a emasculação. (A) um botão de flor no estágio 11, mostrando bocados das pétalas na parte superior. (B-D) Um botão de flor em que foi removido os sépalas (B) e pétalas (C) e que foi então castrado completamente (D). A deiscência do antera ainda não ocorreu. Barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fluxo da preparação da amostra do óvulo. Os procedimentos são mostrados por ilustrações (a-e) e fotografias (a '-e '). (a, a ') Um pistilo é coloc na fita frente e verso unida a um vidro da corrediça, e suas extremidades superiores e mais baixas são cortadas com uma agulha da injeção. (b, b ') A parede do ovário é incisada ao longo de ambos os lados do replum. (c, c ') Ambos os lados das paredes do ovário são abertos, everted, e pressionado na fita para fixar. (d, d ') O septo onde os óvulos são conectados em matrizes é exposto. (e, e ') Uma extremidade do septo é beliscado e levantado com fórceps. O septo com óvulos de conexão é transferido a uma gota da água em um vidro da corrediça. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: fenótipos de fertilização avaliados pela morfologia do sinal nuclear de espermatozóides em ovule. (A) fecundação dupla bem sucedida indicada por dois núcleos de espermatozóides desdensed MRFP-etiquetados (ARROWHEADS). (B) adubação única por DMP9KD/HTR10-células de espermatozóides MRFP indicadas por um núcleo de espermatozóide desnaturado MRFP-rotulado (ponta de seta) e um núcleo de espermatozóides com rótulo MRFP condensado (seta). (C) falha na fertilização dupla por DMP9KD/HTR10-células de espermatozóides MRFP indicadas por dois núcleos de espermatozóides com rótulo MRFP condensado (setas). (D) um exemplo de fertilização dupla fracassada por gcs1HTR10-células de espermatozóides MRFP. Uma linha do marcador onde o núcleo da pilha de ovo (EN) é etiquetado com RFP foi usado. Dois núcleos condensados de espermatozóides (setas), marcados com mRFP, são presos sem fertilização a 18 HAP. (E) ilustração esquemática de um ovule. EC = célula de ovo, CC = célula central, SC = células synergid, ES = saco embrionário, MP = micropyle, CHZ = extremidade calazal. Barras de escala = 20 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: outros potenciais fenótipos de fertilização. Óvulos de um pistilo polinizadas comDMP9 KD/HTR10-MRFP raramente contêm um único núcleo condensado de esperma rotulado por MRFP (a), ou três ou mais núcleos de esperma com rótulo MRFP condensado (B) (setas). Barras de escala = 20 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: núcleos de espermatozóides condensados na plasmogamia durante a fertilização, julgados por combinação com uma linha de marcador de membrana plasmática feminina. Pfwa:: GFP-Pip onde a membrana plasmática da célula central é visualizada foi utilizada como pai feminino (GFP). GFP-PIP também rotula as membranas Endo12. O óvulo contém dois núcleos de espermatozóides condensados por mRFP (setas; RFP). O sinal de RFP no lado de extremidade charazal (seta) é mostrado na célula central (Merge), indicando que o núcleo de espermatozóides está em plasmogamia (após a fusão da membrana do gameta, mas antes da carigamia). O painel à direita é uma ampliação da área cercada por linhas tracejadas na imagem mesclada. Uma área em branco marcada por um asterisco corresponde à posição do núcleo central de células. A linha tracejada indica o contorno da célula central voltada para a célula de ovo. Barra de escala = 20 μm. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
HTR10-mRFP rotula a cromatina paterna (isto é, visualiza núcleos de células espermáticas), e a dinâmica na fertilização dupla foi relatada7. Imediatamente após a liberação de um tubo de pólen, HTR10-mRFP-rotulado núcleos de esperma ainda são condensados. Entretanto, cada um dos núcleos do esperma é desdensed em cima da fusão com um núcleo fêmea fertilizado do gameta em karyogamy três a quatro horas após a fusão7da membrana do gameta. As células de espermatozóides não fertilizados permanecem condensadas, como mostrado em um saco embrionário em que gcs1 células espermáticas são presas sem fertilização (Figura 3D). Geralmente, quando o HTR10 fértil é usado como o pai-pólen, 57,9% ± 17,8% (média ± DP; n = 16 pistilos) de óvulos em um pistilo a 7-8 HAP contêm dois sinais de núcleos de espermatozóides rotulados por mRFP, e quase todos os sinais (97,2%) são desdensed, refletindo a fecundação dobro bem sucedida (um teste padrão de sinal similar é mostrado na Figura 3a). No caso de DMP9KD/HTR10-MRFP, óvulos contendo dois núcleos de espermatozóides marcados com MRFP foram observados em uma frequência semelhante à de HTR10-MRFP, mas 17,6% deles apresentaram adubação única6. Nós adotamos a dinâmica de HTR10-MRFP para a observação de um grande número óvulos circunstâncias in vivo usando um microscópio da epifluorescência. O protocolo é simples e rápido, o que possibilita a coleta de dados suficientes para comprovação estatística. Usando este protocolo como a primeira instância, o significado da única fecundação da pilha central por DMP9KD/HTR10- as pilhas de esperma de MRFP foram provados6.
Com base nas diferenças morfológicas de núcleos de espermatozóides HTR10-mRFP-rotulados derivados de um tubo de pólen, os padrões de fertilização são classificados em três fenótipos: (1) fertilização dupla bem-sucedida, que é caracterizada por dois desdensed HTR10-núcleos de espermatozóides rotulados com mRFP (Figura 3a); (2) adubação única, que apresenta um núcleo condensado HTR10-mRFP-rotulado de espermatozóides e um núcleo de espermatozóide desnaturado HTR10-mRFP-rotulado (Figura 3B); e (3) falha na fertilização dupla, que possui dois núcleos condensados HTR10-mRFP-rotulados de espermatozóides (Figura 3C).
Outras causas potenciais de fenótipos (2) e (3) devem ser consideradas. Relatou-se que as pilhas de esperma começam respectivamente o plasmogamia com uma pilha de ovo ou uma pilha central diversos minutos após ser liberado em um saco do embrião condições semi-in vitro da cultura11. Além disso, existe um tempo de atraso de alguns minutos entre a primeira e a segunda adubação, embora não haja preferência pela ordem de fertilização da célula de ovo e da célula central11. Conseqüentemente, um par de núcleos condensados e decondensed do esperma no phenotype (2) pôde indicar um intervalo de tempo entre as fertilizações em vez da única fecundação. A fim confirmar a ocorrência da única fecundação em uma freqüência significativa no phenotype (2), um número de amostras suficientes para a análise estatística deve ser examinado. O phenotype (3), que tem dois núcleos condensados do esperma (Figura 3C), poderia refletir um período de imobilidade de pilhas de esperma antes da fusão da membrana do plasma12 ou o período entre o plasmogamia e o karyogamy. Conseqüentemente, dois núcleos condensados do esperma em 7-8 HAP não refletem inteiramente o ' fracasso ' da fertilização dobro, e é necessário observar os óvulos em uma época mais atrasada após a polinização para avaliar o sucesso ou a falha da fertilização dobro. A este respeito, a observação do ovário em 16-18 HAP é recomendada, porque a maioria dos óvulos terminariam a fertilização dobro com as pilhas de esperma entregadas pelo primeiro tubo do pólen, e os sinais de HTR10-MRFP de núcleos de esperma fertilizados permaneceria até o seguinte dia de polinização, como mostrado na Figura 3D.
Um teste padrão do único núcleo condensado HTR10-MRFP-etiquetado do esperma (figura 4a) foi detectado raramente, que era provável devido ao desaparecimento rápido de um outro sinal paterno de HTR10-MRFP no gameta fêmea fertilizado em conseqüência da única fecundação. Nesta análise, três ou mais núcleos HTR10-mRFP-etiquetados do esperma foram detectados igualmente como um caso raro (Figura 4B), devido à segunda aceitação do tubo do pólen pelo sistema da recuperação da fertilização10. Neste protocolo, estes casos foram excluídos dos dados, porque traçar os comportamentos de duas pilhas de esperma derivadas de um tubo do pólen é crítico para a avaliação exata.
Desde que a polaridade para as posições das gametas fêmeas em um saco do embrião é regulada bem (isto é, a pilha de ovo e a pilha central diferenciam no micropilar e no lado do Haustório, respectivamente), que o gameta fêmea está fertilizando pode ser julgado pelo parente posições dos núcleos de espermatozóides rotulados por mRFP. Entretanto, há uma limitação na distinção entre Estados fertilizados e do plasmogamia, porque ambos os Estados são indicados pelo sinal condensado dos núcleos do esperma. Para avaliar precisamente se a plasmogamia após a fusão da membrana do gameta ocorreu ou não quando os núcleos do esperma são condensados, é exigido usar linhas fêmeas do marcador da membrana do gameta, como relatado por Takahashi et al. (2018)6. Por exemplo, quando uma planta de Pfwa:: GFP-Pip 12 na qual a membrana plasmática da célula central foi visualizada foi utilizada como um pai feminino, é evidente que uma célula espermática fundida com a célula central estava em plasmogamia (figuracomplementar 1 ).
Em resumo, nosso protocolo descrito aqui pode ser usado para a avaliação estatística do sucesso ou da falha da fertilização em cada gamete fêmea. Embora o emprego do marcador fêmea da membrana do plasma seja exigido para julgar a plasmogamia, nosso método é útil para a análise funcional do regulador da fertilização.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) e pelo financiamento do programa de promoção estratégica de pesquisa prioritária em fitoquímica Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japão).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
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