Summary
Vi viser en metode for å fastslå vellykket eller mislykket befruktning på grunnlag av sperm kjernefysisk morfologi i Arabidopsis dobbel befruktning ved hjelp av en epifluorescence mikroskop.
Abstract
Blomstrende planter har en unik seksuell reproduksjon system kalt "dobbel befruktning", der hver av sperm cellene nøyaktig sikringer med en egg celle eller en sentral celle. Dermed vil to uavhengige befruktning hendelser skje nesten samtidig. Den befruktet egg celle og sentral celle utvikle seg til zygote og endosperm, henholdsvis. Derfor er presis kontroll av dobbel befruktning viktig for den påfølgende frø utvikling. Dobbel befruktning oppstår i den kvinnelige Gametofytt (embryo SAC), som er dypt skjult og dekket med tykt ovule og eggstokk vev. Dette pistil vev konstruksjonen gjør observasjon og analyse av dobbel befruktning ganske vanskelig og har skapt den nåværende situasjonen der mange spørsmål om mekanismen av dobbel befruktning forbli ubesvart. For funksjonell evaluering av en potensiell kandidat for befruktning regulator, er fenotypiske analyse av befruktning viktig. Å bedømme fullføringen av befruktning i Arabidopsis thaliana, formene av fluorescens signaler merking sperm kjerner brukes som indikatorer. En sperm cellen det svikter å gjødsle er indikert av en kondensert fluorescens signal ytterside av det kvinner kjønnscellene, mens derimot en sperm cellen det med hell fertilizes er angitt av en decondensed signal på grunn av karyogamy med det kvinner kjønnscellene ' kjernen. Metoden beskrevet her gir et verktøy for å fastslå vellykket eller mislykket befruktning under in vivo forhold.
Introduction
Blomstrende planter produsere frø gjennom dobbel befruktning, en prosess som er direkte styrt av interaksjoner mellom proteiner lokalisert på Kjønnscelle plasma membran1,2. Blomstrende plante mannlige kjønnscellene, et par sperm celler, utvikle seg i pollen. Et pollen rør som vokser etter pollinering leverer et par sperm celler til kvinnelige kjønnscellene, en egg celle og en sentral celle, som utvikler seg i et embryo SAC. Etter at den mannlige og kvinnelige kjønnscellene møtes, proteiner på Kjønnscelle overflaten fremme anerkjennelse, vedlegg og fusjon for å fullføre dobbel befruktning. I tidligere studier, den mannlige Kjønnscelle membran proteiner GENERATIVE celle spesifikke 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 og Kjønnscelle uttrykt 2 (GEX2)5 ble identifisert som befruktning regulatorer involvert i Kjønnscelle Fusion og vedlegg, henholdsvis. Vi har nylig identifisert en mannlig Kjønnscelle-spesifikt membran protein, DUF679 DOMAIN MEMBRAN PROTEIN 9 (DMP9), som en befruktning regulator involvert i Kjønnscelle interaksjon. Vi fant at en reduksjon på DMP9 uttrykk resulterer i betydelig hemming av egg celle befruktning under dobbel befruktning i a. thaliana6.
Som dobbel befruktning oppstår i et embryo SAC, som er innebygd i en ovule som er videre innpakket med eggstokk vev, er det vanskelig å observere og analysere statene dobbelt befruktning prosesser. Av denne grunn er det fortsatt mange uklare punkter som hindrer en fullstendig forståelse av hele mekanismen av dobbel befruktning kontroll. Etablering av observasjon teknikker for å spore atferden til kjønnscellene under dobbel befruktning under in vivo forhold er uunnværlig for funksjonell analyse av potensielle kandidater til befruktning regulatorer. Nyere studier har gitt markør linjer der Kjønnscelle subcellulære strukturer er merket med fluorescerende proteiner. I denne artikkelen viser vi en enkel og rask protokoll for å observere dobbel befruktning som har skjedd i et embryo SAC avledet fra kunstig pollinated pistils. Ved hjelp av sperm cellekjernen markør linje HTR10-mRFP7, befruktning tilstand av hver kvinnelige Kjønnscelle kan bli diskriminert på grunnlag av sperm kjernefysisk signal morfologi. Vår protokoll med fokus på en slik morfologiske endring av sperm kjerner ved befruktning kan effektivt få en tilstrekkelig mengde data for statistisk bevis. En DMP9-knockdown linje med HTR10-mRFP bakgrunn (DMP9KD/HTR10-mRFP) ble brukt som mannlige planter for å vise en enkelt befruktning mønster. Protokollen er også egnet for funksjonell analyse av andre befruktning regulatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kunstig pollinering
Merk: Før du starter prosessen, er et par av nr 5 tang nødvendig.
- Grow A. thaliana (Col-0) ved 22 ° c under en 16-h lys/8-h mørk syklus i en vekst kammer.
Merk: Klipp ut og fjern den første utviklede blomsten stengel med saks for å fremme utvikling av aksillær knopper. Kraftig voksende planter (2-3 uker etter klipping av den første stilken, Plant høyde ca 25 cm) er egnet for analyse. - For å kastrere, Fjern sepal (figur 1B), petal(figur 1C) og stamen (figur 1d) av blomsterknopper på trinn 118 (figur 1a) ved hjelp av no. 5 tang. Bud med biter av kronbladene sett på toppen er best.
Merk: Bruk en egnet kvinnelig Kjønnscelle markør linje. I denne protokollen, brukte vi en vill type plante som kvinnelige forelder. - Femten til atten timer etter emasculation, ta stamen av en DMP9KD/HTR10-mRFP blomst på scenen 138 ved å knipe filament med tang.
- For å pollinere, forsiktig klappe stigma av en emasculated pistil flere ganger med en dehiscent anther.
2. utarbeidelse av Ovule for observasjon
Merk: Følgende elementer kreves: et lysbilde glass med dobbeltsidig tape festet, no. 5 tang, en 27 G injeksjonsnål, og et dissekere mikroskop.
- 7 til 8 h etter pollinering (HAP), samle pistil og legg den på dobbeltsidig tape, og trykk forsiktig med tang for å fikse pistil på båndet (figur 2a, A ').
Merk: De fleste ovules i en pistil får minst ett pollen rør 10 HAP9. Hvis begge eller en av sædceller fra den første pollen røret ikke klarer å gjødsle, en andre pollen tube ville bli tiltrukket av ovule på grunn av befruktning utvinning systemet10. For å analysere sperm kjerner morfologi fra første pollen rør, anbefales det å fullføre ovule forberedelse av 10 HAP senest. - Klipp av de øvre og nedre endene av eggstokken med en kanyle under et dissekere mikroskop (fig. 2b, B ').
- Slit eggstokken veggen langs begge sider av replum (figur 2C, C ') ved å flytte tuppen av injeksjonsnålen.
Merk: Sett inn injeksjonsnålen lav for å hindre ovule separasjon fra septum. - Evert eggstokken ved å bruke injeksjonsnålen (figur 2D, D ').
- Knip bunnen av septum som ovules er koblet til, og løft det forsiktig opp med tang (figur 2e).
- Overfør ovules inn i en dråpe vann på et lysbilde glass, og forsiktig dekke med et deksel glass for observasjon under et fluorescens mikroskop (figur 2e, E ').
3. mikroskopi
Merk: I denne protokollen brukte vi et epifluorescence mikroskop utstyrt med en fluorescens filter kube (se tabell over materialer), et digitalt kamera og tilhørende programvare.
- Skaff deg bilder av ovules som inneholder sæd kjerner merket med mRFP ved hjelp av en 20x eller 40x objektiv linse og utstyrt digitalkamera.
- Bekreft antallet mRFP-merkede sperm kjerner i et embryo SAC.
Merk: Ovules som inneholder to mRFP-merkede sæd kjerner, kan inkluderes i Befolkningsstørrelsen for statistisk analyse. - Bekreft formen og plasseringen av hver mRFP-merket sperm kjernen i et embryo SAC.
Merk: Umiddelbart etter å ha blitt løslatt fra et pollen rør, et par kondensert mRFP-merket sperm kjerner er lokalisert mellom egg og den sentrale cellen. En decondensed mRFP-merket sperm nucleus oppdaget ved siden av chalazal enden indikerer sentral celle befruktning, for eksempel. Ved å bruke en passende kvinnelig Kjønnscelle membran markør linje, som vist i supplerende figur 1, hvorvidt sæden cellen gjennomgår plasmogamy (etter membran fusjon men før karyogamy) kan overvåkes tydelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovules fra en pistil pollinated med DMP9KD/HTR10-mRFP ble samlet ved 7-8 Hap og observert.
De fleste ovules inneholdt to decondensed mRFP-merket sperm kjerner på egg cellen (micropylar side) og sentral celle (charazal ende side) nucleus posisjoner, henholdsvis (figur 3a), indikerer vellykket dobbel befruktning. I tillegg, ovules inneholder en decondensed mRFP-merket sperm kjernen på den sentrale cellekjernen pluss en kondensert mRFP-merket sperm kjernen utenfor egg cellen (figur 3b) ble observert, indikerer enkel befruktning. I tilfelle av mislykket dobbel befruktning ble to kondensert mRFP-merkede sperm kjerner observert ved grensen av egg cellen og den midtre cellen (figur 3c), som i gcs1 mutant sædceller (figur 3D)3,4 .
I analysen ved hjelp av DMP9KD/HTR10-mRFP pollen, ovules inneholder en enkelt kondensert mRFP-merket sperm nucleus (figur 4a) eller tre eller flere MRFP-merket sperm kjerner (figur 4b) ble sjelden observert.
Figur 1: blomsterknopper egnet for emasculation. (A) en blomst knopp på scenen 11, viser biter av kronbladene på toppen. (B-D) En blomst knopp som ble fjernet begerbladene (B) og kronbladene (C) og det var da emasculated helt (D). Det anther dehiscence har ikke skjedd ennå. Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: flyt av ovule prøve forberedelser. Prosedyrene er vist av illustrasjoner (a-e) og fotografier (a '-e '). (a, a ') En pistil er plassert på dobbeltsidig tape festet til et lysbilde glass, og den øvre og nedre endene er avskåret med en sprøyte nål. (b, b ') Eggstokken veggen er radert langs begge sider av replum. (c, c ') Begge sider av eggstokken veggene er åpnet, vrenges ut, og presset på båndet for festing. (d, d') Septum der ovules er koblet sammen i matriser, vises. (e, e ') Den ene enden av septum er klemt og løftet opp med tang. Septum med forbindelses ovules overføres til en dråpe vann på et lysbilde glass. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: befruktning fenotyper bedømt av sperm kjernefysisk signal morfologi i ovule. (A) vellykket dobbel befruktning indikert av to decondensed mRFP-merket sperm kjerner (pilspisser). (B) enkelt befruktning av DMP9KD/HTR10-mRFP sperm celler indikert av en decondensed mRFP-merket sperm nucleus (pil spiss) og en kondensert mRFP-merket sperm nucleus (arrow). (C) mislyktes dobbel befruktning av DMP9KD/HTR10-mRFP sperm celler indikert av to kondensert mRFP-merket sperm kjerner (piler). (D) et eksempel på mislykket dobbel befruktning av Gcs1HTR10-mRFP sperm celler. En markør linje der egg cellekjernen (EN) er merket med RFP ble brukt. To kondensert mRFP-merket sperm kjerner (piler) er arrestert uten befruktning ved 18 HAP. (E) skjematisk illustrasjon av en ovule. EC = egg celle, CC = sentral celle, SC = synergid celler, ES = embryo SAC, MP = mikropyl, CHZ = chalazal slutt. Vektstenger = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: andre potensielle befruktning fenotyper. Ovules fra en pistil pollinated med DMP9KD/HTR10-mRFP sjelden inneholde en enkelt kondensert mRFP-merket sperm nucleus (a), eller tre eller flere kondensert mRFP-merket sperm kjerner (B) (piler). Vektstenger = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: kondensert sperm kjerner ved plasmogamy under befruktning, bedømt av kombinasjon med en kvinnelig plasma membran markør linje. pFWA:: GFP-PIP der den sentrale celle plasma membranen er visualisere ble brukt som kvinnelig forelder (GFP). GFP-PIP merker også Endo membraner12. Ovule inneholder to kondensert mRFP-merkede sæd kjerner (piler; RFP). Den RFP signal på charazal slutten side (pil) er vist i den sentrale cellen (Merge), som indikerer at sperm kjernen er i plasmogamy (etter Kjønnscelle membran fusjon, men før karyogamy). Panelet til høyre er en forstørrelse av området omgitt av stiplede linjer i det sammenslåtte bildet. Et tomt område merket med en stjerne, tilsvarer plasseringen til den sentrale cellekjernen. Den stiplede linjen viser omrisset til den sentrale cellen som vender mot egg cellen. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HTR10-mRFP etiketter fars kromatin (dvs. visualiserer sperm cellekjerner), og dynamikken i dobbel befruktning har blitt rapportert7. Umiddelbart etter løslatelse fra en pollen tube, HTR10-mRFP-merket sperm kjerner er fortsatt kondensert. Imidlertid er hver av sperm kjerner decondensed ved sammenslåing med en befruktet kvinnelig Kjønnscelle nucleus på karyogamy tre til fire timer etter Kjønnscelle membran Fusion7. Ubefruktede sperm celler forblir kondensert, som vist i et embryo SAC der gcs1 sperm celler er arrestert uten befruktning (figur 3D). Vanligvis, når den fruktbare HTR10-mRFP brukes som pollen forelder, 57,9% ± 17,8% (gjennomsnittlig ± s.d.; n = 16 pistils) av ovules i en pistil ved 7-8 HAP inneholder to mRFP-merket sperm kjerner signaler, og nesten alle signalene (97,2%) er decondensed, noe som reflekterer vellykket dobbel befruktning (et lignende signal mønster vises i figur 3a). I tilfelle av DMP9KD/HTR10-mRFP, ovules inneholder to mRFP-merket sperm kjerner ble observert på en tilsvarende frekvens som for HTR10-mRFP, men 17,6% av dem viste enkel befruktning6. Vi adopterte HTR10-mRFP dynamikk for observasjon av et stort antall ovules under in vivo-forhold ved bruk av et epifluorescence mikroskop. Protokollen er enkel og rask, noe som gjør det mulig å samle tilstrekkelige data for statistisk bevis. Ved hjelp av denne protokollen som første instans, betydningen av enkel befruktning av den sentrale cellen ved DMP9KD/HTR10-mRFP sperm celler ble bevist6.
Basert på morfologiske forskjeller av HTR10-mRFP-merket sperm kjerner avledet fra en pollen tube, er befruktning mønstrene klassifisert i tre fenotyper: (1) vellykket dobbel befruktning, som er preget av to decondensed HTR10-mRFP-merket sperm kjerner (figur 3a); (2) enkel befruktning, som har en kondensert HTR10-mRFP-merket sperm kjernen og en decondensed HTR10-mRFP-merket sperm nucleus (figur 3b); og (3) mislykkede dobbelt befruktning, som har to kondensert HTR10-mRFP-merket sperm kjerner (figur 3c).
Andre potensielle årsaker til fenotyper (2) og (3) bør vurderes. Det har blitt rapportert at sperm celler henholdsvis begynne plasmogamy med en egg celle eller sentral celle flere minutter etter å ha blitt sluppet inn i et embryo SAC under semi-in vitro kultur forhold11. I tillegg er en tidsforsinkelse på noen minutter eksisterer mellom første og andre fertilizations, selv om det ikke er preferanse for rekkefølgen av befruktning av egg cellen og den sentrale celle11. Derfor kan et par kondensert og decondensed sperm kjerner i fenotype (2) indikere en tidsforsinkelse mellom fertilizations i stedet for enkel befruktning. For å bekrefte forekomsten av enkelt befruktning på en signifikant frekvens i fenotype (2), bør en rekke prøver tilstrekkelig for statistisk analyse undersøkes. Fenotype (3), som har to kondensert sperm kjerner (figur 3c), kan reflektere en periode med immobilitet av sperm celler før plasma membran Fusion12 eller perioden mellom plasmogamy og karyogamy. Derfor, to kondensert sperm kjerner ved 7-8 HAP ikke fullt ut reflekterer "svikt" av dobbel befruktning, og det er nødvendig å observere ovules på et senere tidspunkt etter pollinering å vurdere suksess eller fiasko for dobbel befruktning. I denne forbindelse er ovule observasjon på 16-18 HAP anbefalt, fordi de fleste av ovules ville ha fullført dobbel befruktning med sperm celler levert av den første pollen rør, og HTR10-mRFP signaler av ubefruktede sperm kjerner ville forbli til neste pollinering, som vist i figur 3D.
Et mønster av enkelt kondensert HTR10-mRFP-merket sperm kjernen (figur 4a) ble sjelden oppdaget, noe som sannsynligvis var på grunn av den raske forsvinningen av en annen fars HTR10-mRFP signal i befruktet kvinnelige Kjønnscelle som følge av en enkelt befruktning. I denne analysen, tre eller flere HTR10-mRFP-merket sperm kjerner ble også oppdaget som en sjelden sak (figur 4b), på grunn av andre pollen rør aksept av befruktning utvinning system10. I denne protokollen ble disse tilfellene utelatt fra dataene, fordi sporing av atferden til to sædceller avledet fra ett pollen rør er avgjørende for nøyaktig vurdering.
Siden polaritet for posisjonene til den kvinnelige kjønnscellene i et embryo SAC er godt regulert (dvs. egg cellen og den sentrale celle skille på micropylar og chalazal side, henholdsvis), som kvinnelige Kjønnscelle er gjødsling kan bedømmes av den relative posisjonene til mRFP-merket sperm kjerner. Det er imidlertid en begrensning i å skille mellom ubefruktede og plasmogamy tilstander, fordi begge statene er indikert med kondensert sperm kjerner signal. For å vurdere nøyaktig om plasmogamy etter Kjønnscelle membran fusjon har forekommet eller ikke når sæd kjernene er kondensert, er det nødvendig å bruke kvinnelige Kjønnscelle membran markør linjer, som rapportert av Takahashi et al. (2018)6. For eksempel, når en pFWA:: GFP-PIP Plant12 der den sentrale celle plasma membranen ble visualisere ble brukt som en kvinnelig forelder, er det klart at en sperm celle smeltet sammen med den sentrale cellen var i plasmogamy (supplerende figur 1 ).
Oppsummert kan vår protokoll som er beskrevet her brukes til statistisk vurdering av suksess eller svikt i befruktning i hver kvinnelige Kjønnscelle. Selv om ansettelse av den kvinnelige plasma membran markør er nødvendig for å bedømme plasmogamy, vår metode er nyttig for funksjonell analyse av befruktning regulator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for fremme av science KAKENHI stipend (JP17H05832 til T. I.) og ved finansiering fra Strategic priority Research Promotion program på phytochemical Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japan).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H.
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M.
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
