थायोलेट यूरेसिल का उपयोग संवेदनशील और विशेष रूप से खमीर सकचरोमाइसीसेरेविसेसे नवलिखित आरएनए को शुद्ध करता है .
न्यूक्लिओटाइड अनुरूप, 4-थायोरासिल (4tU), आसानी से कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है और आरएनए में शामिल किया जाता है क्योंकि यह विवो में लिखा जाता है, लेबलिंग की एक संक्षिप्त अवधि के दौरान उत्पादित आरएनए के अलगाव की अनुमति देता है। यह शामिल थायो समूह और आत्मीयता शुद्ध करने के लिए एक biotin moiety संलग्न द्वारा किया जाता है, streptavidin लेपित मोती का उपयोग कर. शुद्ध की एक अच्छी उपज प्राप्त करने, नव संश्लेषित आरएनए कि पूर्व मौजूदा आरएनए से मुक्त है कम लेबलिंग समय संभव बनाता है और गतिज अध्ययन में वृद्धि हुई अस्थायी संकल्प परमिट. यह नव संश्लेषित आरएनए के बहुत विशिष्ट, उच्च उपज शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि कैसे आरएनए खमीर Saccharomyces cerevisiae से निकाला जाता है. तथापि, कुल आरएनए से थायोलेटिड आरएनए के शुद्धिकरण के लिए प्रोटोकॉल किसी भी जीव से आरएनए का उपयोग कर प्रभावी होना चाहिए एक बार यह कोशिकाओं से निकाला गया है. शुद्ध आरएनए कई व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों द्वारा विश्लेषण के लिए उपयुक्त है, इस तरह के रिवर्स ट्रांसक्रिप्टस-क्यूपीसीआर, आरएनए-सेक और SLAM-सेक के रूप में। विशिष्टता, संवेदनशीलता और इस तकनीक का लचीलापन आरएनए चयापचय में अद्वितीय अंतर्दृष्टि की अनुमति देते हैं.
आरएनए एक गतिशील प्रकृति है; इसके उत्पादन के तुरंत बाद बहुत आरएनए तेजी से संसाधित और निम्नीकृत है। वर्तमान में, आरएनए चयापचय के अधिकांश अध्ययन कुल सेलुलर आरएनए का विश्लेषण, जो ज्यादातर पूरी तरह से संसाधित है और स्थिर राज्य स्तर पर. यह स्तर प्रतिलेखन की दरों, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल परिपक्वता और निम्नीकरण के बीच संतुलन पर निर्भर करता है। स्थिर अवस्था संतुलन की ओर ले जाने वाली प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए बहुत ही अल्पजीवी आरएनए प्रजातियों को पकड़ने के लिए विशेष तकनीकों की आवश्यकता होती है।
NUcleotide एनालॉग के साथ आरएनए की मेटाबोलिक लेबलिंग जैसे 4-thiouracil (4tU) या 4-thiouridine (4sU) (एक उत्कृष्ट समीक्षा के लिए Duffy एट अल.1 देखें), थायो लेबल नवजात RNAs और उनके प्रसंस्करण मध्यवर्ती को अलग करने की क्षमता प्रदान करता है. तथापि, प्रकाशित प्रोटोकॉल में कई मिनट2,3के लेबलिंग समय शामिल होते हैं, जो कई प्रतिलिपियों के उत्पादन की दर के सापेक्ष धीमा होता है। यह औसत खमीर जीन टाइप करने के लिए एक मिनट के क्रम में लेता है, तो कम से कम एक मिनट के लिए खमीर आरएनए लेबलिंग बहुत कम माना जा सकता है. अत्यंत तेजी से और विशिष्ट 4 thiouracil प्रोटोकॉल (ers4tU) 4tU निगमन को अधिकतम करने और unlabeled की वसूली को कम से कम द्वारा शोर अनुपात के लिए संकेत अधिकतम, पूर्व मौजूदा आरएनए बहुत कम लेबलिंग समय संभव4.
थायो-संशोधित आधार कोशिकाओं में तेजी से और पर्याप्त मात्रा में नए संश्लेषित आरएनए (nsRNA) लेबल करने के लिए आयात किया जाना चाहिए। इसे बढ़ावा देने के लिए, कोशिकाओं को यूरेसिल-मुक्त माध्यम में उगाया जाता है, और एक उपयुक्त परमेज़ की अभिव्यक्ति 4tU या 4sU को बढ़ावा देने में मदद करती है (प्लाज्मिड की एक सूची के लिए तालिका 1 देखें जो उपयुक्त परमेज़ जीन और अनुपूरक चित्रा 1) लेते हैं। सोडियम हाइड्रॉक्साइड में 4tU की विलेयता अन्य न्यूक्लिओटाइड एनालॉग्स द्वारा आवश्यक विषाक्त कार्बनिक सॉल्वैंट्स की आवश्यकता से बचा जाता है। दुर्भाग्य से, 50 डिग्री सेल्सियस से अधिक सांद्रता पर थायो-संशोधित न्यूक्लिओसाइड्स के साथ लंबी अवधि के लिए बढ़ती संस्कृतियों को राइबोसोम5को बाधित करने के लिए देखा गया है। तथापि, सांद्रता (10 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग यहाँ किया जाता है, और अत्यंत कम लेबलिंग समय, विश्लेषण के लिए पर्याप्त आरएनए देते समय हानिकारक प्रभावों को कम करता है।
इस तकनीक को लक्ष्य प्रोटीन6,7 (चित्र 2) के तीव्र और विशिष्ट ऑक्सिन-मध्यस्थ अवक्षय के साथ संयोजित किया जा सकता है, जिसे “जेड-एएसटी एआईडी 4U” प्रोटोकॉल के रूप में जाना जाता है, जिसमें ऑक्सिन की जेड-एस्ट्राडियोल विनियमित अभिव्यक्ति inducible degron (AID) प्रणाली 4tU लेबलिंग के साथ संयुक्त है. जेड-एआईडी 4U दृष्टिकोण के साथ, एक लक्ष्य प्रोटीन को समाप्त कियाजा सकता है और आरएनए चयापचय पर प्रभाव बारीकी से निगरानी की जा सकती है (चित्र 2)। समय महत्वपूर्ण है; साथ वाले वीडियो को देखने और चित्र 2 और उसके एनिमेटेड रूप पर करीब से ध्यान देने की सलाह दी जाती है (पूरक चित्र 2देखें)।
आरएनए के प्रसंस्करण और गिरावट को सटीक समय समाधान के लिए बहुत तेजी से रोका जाना चाहिए। यह कम तापमान पर मेथनॉल का उपयोग करके हासिल किया जाता है, जो कोशिका की सामग्री को बहुत तेजी से ठीक करता है और न्यूक्लिक एसिड सामग्री8के संरक्षण के दौरान कोशिका झिल्ली को कम करता है। आरएनए निष्कर्षण कुशल होना चाहिए और आरएनए को नुकसान नहीं पहुंचाना चाहिए। यांत्रिक lysis chatropic एजेंटों की अनुपस्थिति में प्रभावी है (अक्सर इन थायो समूहों होते हैं, तो बचा जाना चाहिए). आरएनए की लिथियम क्लोराइड वर्षा को प्राथमिकता दी जाती है, क्योंकि tRNAs कम कुशलता से वेग ित होते हैं। tRNAs तेजी से प्रतिलेखन कररहे हैं और स्वाभाविक रूप से thiolated 9, तो tRNAs हटाने biotinylation अभिकर्मक के लिए प्रतिस्पर्धा कम कर देता है. यदि छोटे, उच्च संरचित आरएनए ब्याज के हैं, शराब आधारित आरएनए वर्षा तरीकों की सिफारिश कर रहे हैं.
थायोलेटिड आरएनए को ठीक करने के लिए बायोटिन को 4tU के साथ आरएनए में शामिल थायो समूहों के माध्यम से सहसंयोजक रूप से संलग्न किया जाता है। संशोधित बायोटिन का उपयोग, जो एक क्लीवेबल डिसल्फाइड बांड (उदा., एचपीडीपी-बायोटिन (एन-$6-(बायोटिनामिडो)एचएक्सिल-3 – (2]पीयिडिलडीइथियो)पीरोपिओनामाइड, ) या एमटीएस-बायोटिन (मिथेन थियोसल्फोनेट) के माध्यम से देता है। के रूप में यह एक कम करने एजेंट के अलावा आरएनए की रिहाई की अनुमति देता है. जैव-ताइनित आरएनए चुंबकीय मनकों के साथ मिलकर स्ट्रेप्टेविडिन पर शुद्ध आत्मीयता है। यह प्रोटोकॉल पहले सूचीबद्ध अन्य लोगों के समान है10 लेकिन गहन पृष्ठभूमि को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है।
थायोल-लेबलिंग प्रयोग के दो प्रकार हैं जो किया जा सकता है, निरंतर और discontinuous लेबलिंग. प्रत्येक के अपने फायदे हैं। निरंतर लेबलिंग में 4tU संस्कृति और नियमित अंतराल पर लिया नमूने के लिए जोड़ा जाता है. इस प्रकार का प्रयोग दर्शाता है कि आरएनए को कैसे संसाधित किया जाता है और समय के साथ स्तर कैसे बदलते हैं। उदाहरण जंगली प्रकार के प्रयोगों और एक पल्स-चेज प्रयोग के साथ उत्परिवर्ती की तुलना शामिल हैं। चित्र 3ठ,ग में दिखाए गए प्रयोग इस प्रकार के हैं. विच्छिन्न लेबलिंग के लिए एक परिवर्तन प्रणाली में प्रेरित है और आरएनए निगरानी की. एक बार परिवर्तन प्रेरित किया गया है संस्कृति कई उप संस्कृति में विभाजित किया जाना चाहिए, और विशिष्ट समय पर, हर एक तो एक संक्षिप्त अवधि के लिए थायो लेबल है. इसका एक उदाहरण चित्र 27में दर्शाए गए एआईडी 4U है। इस प्रकार का प्रयोग आरएनए प्रक्रमण पर उपापचयी परिवर्तन के प्रभाव की निगरानी के लिए विशेष रूप से उपयोगी है (चित्र 3ददेखें ) ।
चित्र 4 और चित्र 5में थायो-लेबलिंग प्रयोग का आलेखीय निरूपण प्रस्तुत किया गया है और एक प्रदेषक जो प्रोटोकॉल के निष्पादन को बहुत सरल बनाता है , उपलब्ध है (4tU प्रयोग template.xlsxदेखें) . के रूप में अच्छी तरह से इस के रूप में पूरक जानकारी एक व्यापक समस्या निवारण मार्गदर्शिका शामिल हैं. $-एएसटी AID 4U प्रोटोकॉल के लिए जो 4tU लेबलिंग को औक्सिन अवक्षय प्रोटोकॉल के साथ एकीकृत करता है, चित्र 2 और अनुपूरक चित्र 2देखें। विस्तृत AID कमी प्रोटोकॉल के लिए Barrass एट अल7 देखें।
यह लेख अत्यंत तेजी से और विशिष्ट 4tU लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, नवजात की वसूली के लिए, नए संश्लेषित आरएनए एस से cerevisiae के रूप में छोटे रूप में 15 लेबलिंग के बाद, unlabeled आरएनए द्वारा बहुत कम संदूषण के साथ.
उपयोगकर्ता हमेशा ठंड तापमान और DEPC इलाज अभिकर्मकों का उपयोग करके आरएनए की अखंडता को बनाए रखने के लिए ध्यान रखना चाहिए. Streptavidin मनका शुद्धि आम तौर पर विश्वसनीय है; हालांकि, मनका बफ़र को हैंडल करने के लिए कठिन है; यह हौसले से बनाया जाना चाहिए, इसके घटकों के साथ सही क्रम में जोड़ा, और ठंडा या autoclaved नहीं. आम असफलताओं में आरएनए को वर्षा चरणों के बाद अपूर्ण रूप से भंग किया जा रहा है, और इसलिए या तो बायोटिनलेट नहीं किया जा रहा है या अन्यथा प्रसंस्करण चरणों के दौरान खो दिया है। अनुपूरक सामग्री में व्यापक समस्या निवारण सहायता है।
वहाँ कुछ सीमाओं ers4tU में के बारे में पता होना करने के लिए कर रहे हैं। एक पहले से ही उल्लेख किया है कि 4tU खमीर की वृद्धि को धीमा कर देता है (चित्र 1a) अंतर्जात थायोलेट्ड आरएनए9के अलावा, लेबलिंग अवधि के दौरान केवल आरएनए को ही शुद्ध किया जा सकता है। थायोlation समय भर में जीन पर रुके हुए पॉलिमरेज थायोलेटेड ट्रांसक्रिप्ट्स का उत्पादन नहीं करेंगे जिन्हें शुद्ध किया जा सकता है, हालांकि थायोlation के दौरान एक रुका हुआ राज्य में प्रवेश करने या छोड़ने के कारण आंशिक रूप से लेबल किए गए ट्रांसक्रिप्ट्स को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। तनाव है कि खराब टाइप, या तो उत्परिवर्तन या विकास की स्थिति की वजह से, थोड़ा nsRNA का उत्पादन, हालांकि तकनीक यहाँ इस्तेमाल फिर भी अन्य तरीकों की तुलना में nsRNA की वसूली में सुधार होगा. लंबे समय तक और बढ़ी हुई संस्कृति की मात्रा इन उपभेदों और स्थितियों में आवश्यक हो सकती है। ध्यान दें कि यूरेसिल नाइट्रोजन का एक अच्छा स्रोत है और इसलिए नाइट्रोजन भुखमरी से संबंधित अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने से पहले इस विधि का परीक्षण किया जाना चाहिए।
ers4tU प्रोटोकॉल अल्पकालिक आरएनए के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जिनमें से कई इतनी तेजी से अपमानित कर रहे हैं कि वे गिरावट मशीनरी गंभीर बिना पहचान ासाई नहीं जा सकता है. उदाहरणों में क्रिप्टोक अस्थिर प्रतिलिपि (CUTs)4,और समय से पहले समाप्ति या प्रमोटर द्वारा उत्पादित लघु प्रतिलिपि 18 और एक प्रमोटर (PROMPTs)19से एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्शन “अपस्ट्रीम” शामिल हैं। स्थिर आरएनए प्रजातियों के प्रसंस्करण के दौरान उत्पादित मध्यवर्ती भी क्षणिक होते हैं लेकिन उन्हें ers4tU प्रतिलेखन4का उपयोग करके समृद्ध किया जा सकता है . ers4tU प्रोटोकॉल इसलिए अत्यधिक क्षणिक आरएनए प्रजातियों का विश्लेषण किया जा करने की अनुमति में असाधारण है और अन्य तरीकों पर एक बड़ा लाभ है, जो निकट शारीरिक स्थितियों के तहत कब्जा कर लिया. इस तकनीक का उपयोग आरएनए पॉलिमरेज म्यूटेंटों में प्रतिलेखन और डाउनस्ट्रीम आरएनए प्रसंस्करण गतिज का अध्ययन करने के लिए किया गया है जो सामान्य20की तुलना में अधिक या धीमी गति से लंबा होता है .
Thiolation भी आरएनए-सेक और SLAM-सेक21के साथ संगत है, सभी आरएनए एक बहुत ही कम समय खिड़की के भीतर उत्पादित उत्तम विस्तार में विशेषता होने की अनुमति.
The authors have nothing to disclose.
इस काम को जेबी [104648] को वेलकम फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। सेल जीव विज्ञान के लिए वेलकम सेंटर में काम वेलकम कोर फंडिंग [092076] द्वारा समर्थित है। लेखक ों को उनकी मदद के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को स्वीकार करते हैं: बेला Maudlin, Emanuela सैनी, सुज़ाना डी लुकास-Arias और शाइनी जॉर्ज. लेखक भी प्लाज्मिड YEpEBI31111के लिए पैट्रिक Cramer धन्यवाद देना चाहते हैं .
β-mercaptoethanol (βME) | Sigma-Aldrich | M3148 | CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 25668 | CAUTION toxic |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave |
DMF (N,N-dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | 227056 | CAUTION toxic |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 29221 | |
EZ-link HPDP Biotin | Thermo scientific | 21341 | Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend. |
Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
Glycogen [20 mg/mL] | Sigma-Aldrich | 10901393001 | Store at -20 °C |
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel | Thermo Scientific | 77712 | Optional |
LiCl | Sigma-Aldrich | 793620 | 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly. |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63033 | 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly. |
Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-M | 5 M solution |
Phenol, low pH. | Sigma-Aldrich | P4682 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH. | Sigma-Aldrich | P1944 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
Pierce Spin Columns | Thermo Scientific | 69702 | Optional |
SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | 32318-M | Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | CAUTION corrosive |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Sigma-Aldrich | 436143 | CAUTION irritant, do not inhale |
Streptavidin Magnetic beads | NEB | 1420S | Store at 4°C |
SUPERase-In, RNase inhibitor | Life technologies | AM2696 | Store at -20°C |
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike | See section 1.7 of the protocol | ||
4-thiouracil (4tU) | ACROS ORGANICS | 359930010 | Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. |
Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | 1 M solutions at various pH |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | 5mg/ml, store at -20°C |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C. |
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 | |
Zeba Columns 0.5ml | Thermo Scientific | 89882 | Store at 4 °C |
Zirconia beads | Thistle Scientific | 110791052 | |
Equipment and Consumables | |||
Beadbeater | Biospec | 112011EUR | Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established. |
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA. | |||
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible. | |||
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g | |||
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist | |||
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark. | |||
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end | |||
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended | |||
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL | Eppendorf | H179467N | |
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL | Ambion | AM12350 | |
Tubes, centrifuge, 50 mL | Sarstedt | 62.547.004 | Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss |
Tubes, centrifuge, 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 | |
Tubes, 2 mL, screw cap | Greiner | 723361 | |
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids | Brand | 781332 |