Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59952
Automatic Translation
1, 1
1Wellcome Centre for Cell Biology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh

Summary

Hassas ve özellikle maya Saccharomyces cerevisiaeyeni transkripsiyonu RNA arındırmak için tiolated urasil kullanımı .

Abstract

Nükleotid analog, 4-thiouracil (4tU), kolayca hücreler tarafından alınır ve vivo olarak RNA dahil, etiketleme kısa bir süre içinde üretilen RNA izolasyon sağlayan. Bu dahil thio grubu ve yakınlık arındırıcı bir biotin moiety ekleyerek yapılır, streptavidin kaplı boncuklar kullanılarak. Önceden var olan RNA'dan arınmıştır saf, yeni sentezlenmiş RNA iyi bir verim elde etmek kısa etiketleme süreleri mümkün kılar ve kinetik çalışmalarda artan zamansal çözünürlüğe izin verir. Bu, yeni sentezlenen RNA'nın çok özel ve yüksek verimli saflaştırılması için bir protokoldür. Burada sunulan protokol, RNA'nın Saccharomyces cerevisiae mayasından nasıl çıkarılabildiğini açıklamaktadır. Ancak, hücrelerden çıkarıldıktan sonra, itolitli RNA'nın total RNA'dan arındırılması için protokol herhangi bir organizmadan Gelen RNA kullanılarak etkili olmalıdır. Saflaştırılmış RNA ters transkriptaz-qPCR, RNA-seq ve SLAM-seq gibi birçok yaygın olarak kullanılan teknikler tarafından analiz için uygundur. Bu tekniğin özgüllüğü, duyarlılığı ve esnekliği RNA metabolizmasına benzersiz bir bakış açısı sağlar.

Introduction

RNA dinamik bir doğaya sahiptir; kısa bir süre sonra çok RNA hızla işlenir ve bozulur üretilir. Şu anda, RNA metabolizmasının çoğu çalışma toplam hücresel RNA analiz, çoğunlukla tam olarak işlenmiş ve sabit devlet düzeyinde. Bu seviye transkripsiyon oranları, transkripsiyon sonrası olgunlaşma ve bozulma arasındaki dengeye bağlıdır. Sabit durum dengesine yol açan süreçlerin analizi, çok kısa ömürlü RNA türlerini yakalamak için özel teknikler gerektirir.

RNA'nın 4-thiouracil (4tU) veya 4-tiouridin (4sU) gibi nükleotid analogları ile metabolik etiketlemesi (mükemmel bir inceleme için Bkz. Duffy ve ark. 1), tiyo etiketli yeni doğan RNA'ları ve bunların işleme aralarını izole etme olanağı sunar. Ancak, yayınlanan protokoller birkaç dakika etiketleme süreleri içerir2,3, birçok transkript üretim oranına göre yavaş. Bu ortalama maya geni transkripsiyonu için bir dakika sırayla sürer, bu yüzden bir dakikadan az maya RNA etiketleme son derece kısa olarak kabul edilebilir. Son derece hızlı ve spesifik 4 thiouracil protokolü (ers4tU) 4tU kuruluş maksimize ve etiketsiz kurtarma en aza indirerek gürültü oranı sinyali maksimize, önceden var olan RNA mümkünçokkısa etiketleme süreleri 4 .

Tiyo modifiye baz verimli bir şekilde yeni sentezlenen RNA (nsRNA) etiketlemek için hızlı ve yeterli miktarda hücrelere ithal edilmelidir. Bunu teşvik etmek için, hücreler urasil içermeyen ortamda yetiştirilir ve uygun bir permazin ekspresyonu 4tU veya 4sU alımını artırmaya yardımcı olur (uygun permaz genleri taşıyan plazmidlerin listesi için Tablo 1'e ve Ek Şekil1'e bakınız). 4tU'nun sodyum hidroksitteki çözünürlüğü, diğer nükleotit analoglarının gerektirdiği toksik organik çözücülere olan ihtiyacı önler. Ne yazık ki, 50 μM'den büyük konsantrasyonlarda tiyo modifiye nükleozitler ileuzun süre büyüyen kültürlerin ribozomları bozduğu gözlenmiştir 5. Ancak, burada kullanılan konsantrasyon (10 μM) ve son derece kısa etiketleme süreleri, zararlı etkileri en aza indirir5 (Şekil1a),hala analiz için yeterli RNA verirken.

Bu teknik, "β-est AID 4U" protokolü olarak adlandırılan ve β-est aid 4U protokolü olarak adlandırılan ve kandinin ekspresyonunun düzenlendiği bir hedef protein6,7 (Şekil2)hızlı ve spesifik yardımcı aracılı tükenmesi ile kombine edilebilir. indüklemez degron (AID) sistemi 4tU etiketleme ile birleştirilir. β-est AID 4U yaklaşımı ile hedef protein tükenebilir ve RNA metabolizması üzerindekietkisi yakından izlenebilir (Şekil 2). Zamanlama çok önemlidir; eşlik eden videoyu görüntülemeniz ve Şekil 2'ye ve animasyonformuna yakın ilgi göstermeniz tavsiye edilir (Bkz. Ek Şekil2).

Doğru zaman çözünürlüğü için RNA'nın işlenmesi ve bozulması son derece hızlı bir şekilde durdurulmalıdır. Bu çok hızlı hücre içeriğini giderir ve nükleik asit içeriği korurken hücre zarını bozar düşük sıcaklıkta metanol kullanılarak elde edilir8. RNA ekstraksiyonu verimli olmalı ve RNA'ya zarar vermemelidir. Mekanik lisis chaotropic ajanların yokluğunda etkilidir (genellikle bu tiyo grupları içerir, bu yüzden kaçınılmalıdır). RNA lityum klorür çökelti tercih edilir, tRNA'lar daha az verimli çöktürülmüş olduğundan. tRNA'lar hızla transkripsiyonuve doğal olarak thiolated 9, bu nedenle tRNA'ların çıkarılması biyotinylasyon reaktifi için rekabeti azaltır. Küçük, yüksek yapılı RNA'lar ilgi çekiciyse, alkol bazlı RNA yağış yöntemleri önerilir.

Tiyitli RNA kurtarmak için, biotin kovalent 4tU ile RNA dahil tiyo grupları ile bağlanır. Dekolte edilebilir bir disülfit bağı (örneğin, HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamide, p ropionamide, veya MTS-biotin (Metan thulfonate)) ile bağlanan modifiye biyotin kullanımı önerilir. bir indirgeyici madde ekleyerek RNA serbest bırakılmasına izin verir gibi. Biyotinylated RNA arınmış streptavidin manyetik boncuklar ile birleştiğinde saf. Bu protokol, daha önce10 olarak listelenen diğer protokollere benzer, ancak arka planı azaltmak için yoğun olarak optimize edilmiştir.

Sürekli ve kesintisiz etiketleme, yapılabilir tiyol etiketleme deneyi iki türü vardır. Her birinin kendi avantajları vardır. Sürekli etiketlemede 4tU kültüre eklenir ve düzenli aralıklarla alınan numuneler alınır. Bu tür bir deneme, RNA'nın nasıl işlenir ve düzeylerin zaman içinde nasıl değiştiğini gösterir. Örnekler arasında mutantın vahşi tip deneylerle karşılaştırılması ve nabız kovalama deneyi sayılabilir. Şekil 3b,c'de gösterilen deneyler bu türdedir. Kesintili etiketleme için sisteme bir değişiklik indüklenir ve RNA izlenir. Değişim indüklendikten sonra kültür birkaç alt kültüre ayrılmalıdır ve belirli zamanlarda, her biri kısa bir süre için thio-etiketli. Bir örnek şekil 27'de gösterilen β-est AID 4U'dur. Bu tür deneyler, metabolik bir değişikliğin RNA işleme üzerindeki etkisini izlemek için özellikle yararlıdır (Bkz. Şekil 3d).

Bir tio-etiketleme deneyinin grafik gösterimi Şekil 4 ve Şekil5'te sunulur ve protokolün performansını büyük ölçüde kolaylaştıran bir elektronik tablo mevcuttur (bkz. 4tU deneme template.xlsx). Bunun yanı sıra Ek Bilgiler kapsamlı bir sorun giderme kılavuzu içerir. 4tU etiketlemeyi auxin tükenme protokolüile birleştiren β-est AID 4U protokolü için Şekil 2 ve Ek Şekil2'ye bakınız. Ayrıntılı AID tükenme protokolüiçin 7.

Protocol

1. Büyüme ve tiyo etiketleme

NOT: Protokolün bu bölümünün tamamlanma süresi, hücre büyüme hızına bağlı olarak son derece değişkendir. Thio-labelling'den önce çözümleri ve ekipmanları hazırlamasına 1 saat ve numuneleri işlemek için 30 dk etiketleme sonrası izin verin.

  1. S. cerevisiae suşunun hücreiçine 4tU ithalatınıartırmak için permaz (Tablo 1) kodlayan bir plazmid içerdiğinden emin olun.
    NOT: İthalatçı olmadan, 2 dakikadan daha az etiketlemenin başarılı olması olası değildir11 (Bkz. Ek Şekil1). 4tU birleşme büyüme urasil olmadan orta ise daha verimlidir, bu nedenle zorlanma URA3+olmalıdır; Tablo 1'deki plazmidlerin bir çoğu URA3'ü işaretleyici olarak taşır. Eğer bu protokol β-est AID tükenmesi7ile birlişecekse, ek gerinim modifikasyonları gereklidir.
  2. Amino asitler olmadan 6,9 g maya azot tabanı, 20 g glikoz ve 1,92 g SCSM tek açılır−ura(MalzemeTablosu) ilave ederek YMM urasil içermeyen ortamı 1 L suya hazırlayın. Otoklav veya filtre kullanmadan önce büyüme ortamısterilize.
    NOT: Filtre sterilizasyonu, numune toplamada kullanılan metanoldeki hücrelerle birlikte çökeltme ile üretilen peptit/şeker kompleksleri olarak tercih edilir.
  3. YMM urasil içermeyen ortamda mayayı 600 nm (OD600)0,6−0,8 optik yoğunluğa yetiştirin. Kültürün günlük aşamasında büyüdüğünü ve en az iki katına çıktığını sağlayın. 30 °C'de büyüme normalde tavsiye edilir, ancak diğer sıcaklıklar, örneğin, ısıya duyarlı suşlar için kullanılabilir.
    NOT: Gerinim, büyüme koşulları ve RNA verime bağlı olarak yaklaşık 30 mL numune hacmine ihtiyaç duyulacaktır. Bu tutar protokol boyunca kabul edilecektir. Kültürün 30 mL metanol 20 mL ile 50 mL santrifüj tüp içine sığacak en, bu yüzden optimizasyon başlatmak için uygun bir hacimdir. RNA iyileşmesini artırmak için erken zaman noktaları için daha fazla numune hacmi kullanmayı düşünün, 2000 mL'ye kadar çok kısa etiketleme zamanlarında (<1 dk) yavaş büyüyen hücreler için kullanılmıştır.
  4. Buz üzerinde H2O yaklaşık 50 mL chill. Her numune için 2 mL vidalı tüpe 200 μL zirkon boncuk ekleyin ve buz üzerinde soğutun. Ayrıca 50 mL santrifüj tüpler içine 20 mL metanol (DİkKAT) koyun ve kuru buz (DİkKAT) üzerine yerleştirin. Metanol 1/3 için 2/3 örnek hacmi olmalıdır.
    DİkKAT: Metanol inhalasyon, temas ve tüketim ile toksiktir. Bir duman kaputunda büyük hacimlerde dağıtın ve metanol nitril laboratuvar eldivennüfuz gibi eldiven iki çift giymek. Metanol son derece yanıcı, ateşleme tüm kaynaklardan uzak tutun.
    NOT: Kuru buz temasta soğuk yanıklara neden olabileceği ve asfik gaz ürettiği için, iyi havalandırılan bir alanda eldiven kullanın ve kullanın.
    NOT: Bu noktada boncukların eklenmesi, tüp kuruduğundan ve hücre peletinden aşağı doğru dönerken, boncukların da tüp ipliğinden biraz zaman kazandırdığı için numune eklendiğinden daha kolaydır. Ayrıca, bu örnek eklenmeden önce boncuk soğumasını sağlar.
  5. Bir S. pombe başak kültüre eklenecekise (daha sonra değil), iyice buz ve girdap üzerinde tiolated S. pombe hücrelerinin bir aliquot çözülme, en az 30 s, sonra kültürekleyebilirsiniz. Aşağıdaki talimatlara göre hazırlanırsa, bir S. pombe aliquot 400 mL kültür için yeterlidir (on iki 30 mL numune için yeterli artı biraz işleme hataları için izin vermek için). Az ya da çok kültür kullanılıyorsa, kültüre eklenen S. pombe'nin hacmini ayarlayın.
    1. S. cerevisiaeiçin protokolde açıklandığı gibi OD600 için 0,8 tam olarak 1 L Pombe kültür grow .
    2. Adım 1.7 olarak Thio-etiket, ama 10 dakika için.
    3. Temelde adım 1.9 açıklandığı gibi, kuru buz üzerinde 400 mL metanol kullanarak tüm kültürü düzeltin.
    4. 3 dk için 3000 x g santrifüj ile hücre pelet.
    5. Supernatant atın ve H2O 3.3 mL hücre pelet resuspend.
    6. Her biri 80 μL'lik aliquots'a bölün. -80 °C'de saklayın.
    7. 400 mL kültür veya 30 mL numune başına 10 μL için bir aliquot'un tümlerini kullanın.
      NOT: RNAseq performans 1 /10 başak hacmini azaltın. Aliquots'u yeniden kullanmayın; kullanılmayan herhangi bir çivi atın. Bu başak normalleştirmek ve zaman noktaları ve deneyler arasında sonuçları karşılaştırmak için yararlıdır.
  6. Kesintili etiketleme için, gerekli metabolik tedirginliği (örneğin, büyüme koşulları, gen indüksiyonu veya β-est AID7 (Şekil2 ve Ek Şekil2) gibi tükenmesi gibi, kültürü bölerek ikna edin. Tüm şişelerin ve ortamların istenilen sıcaklıkta olduğundan emin olun ve mümkünse kültürü eklemeden önce ortamı aerate edin.
  7. 10 μM'lik bir konsantrasyona kültüre 4tU ekleyinve şiddetle karıştırın (1 /1000 mM 4tU kültür hacminin 1 M NaOH içinde çözünmüş). 15 s 5 dk için Thiol-etiket.
    NOT: Otuz saniye iyi bir başlangıç noktasıdır. 20'den az s için thio-etiketleme zaman baskısı altında kültür manipüle zorluklar nedeniyle daha değişken sonuçlar verir. Ancak, 1 dakikadan fazla etiketleme tekniğin zamansal çözünürlüğünü azaltır.
  8. Bir takip denemesi yapılacaksa; 20−30 s için tiyo-etiketleme izin sonra 5 mM son konsantrasyona 1 / 200 kültür hacmi 1/200 kültür hacmi ekleyerek (thiolated değil), izin.
    NOT: Uridin daha az suda çözünür olduğu için idrar takibi için urasil tercih edilir ve böylece hücrelerin büyümesinde daha az rahatsızlık vardır.
  9. Zaman kursunun sonuna kadar düzenli aralıklarla (en az 15 s) kültür örnekleri alın. Bundan daha kısa örnekleme aralıklarının güvenilir bir şekilde gerçekleşdirilmesi zordur. Adım 1.4 hazırlanan kuru buz üzerinde metanol örnek ekleyin. Kolaylık sağlamak için, 20 mL metanol içeren 50 mL'lik bir tüpe 30 mL kültür ekleyin.
    NOT: Karbondioksit soğukolduğunda metanolde çözünür; bu, numunenin eklenmesi yle çözeltiden çıkar ve karıştırma üzerine köpükler şiddetle ortaya çıkar―numune kaybına neden olan. Bunu önlemek için metanolü <-70 °C'ye kadar sıkıca kapatılmış bir tüpte, gerektiği zamana yakın bir şekilde soğutun ve kuru buza aktarın.
  10. Tüpü kapatın ve sallayarak iyice karıştırın. Örnekleri buza yerleştirin. Örneklerin hiçbirinin dondurulmaz mı kontrol edin; eğer öyleyse, hafifçe elinde sıcak, sürekli ters. Bu en iyi örnek sıcaklığı değerlendirilebilir olarak elde yapılır, her zaman soğuk hissetmesi gerekir. Buzun üzerine yerleştirin. Bu bir duraklama noktası değildir; bir kez tüm örnek sıvı bir sonraki adıma geçin.
  11. Hücreleri peletlemek için 2 dakika (mümkünse 4 °C'de) için 3000 x g'de döndürün. Sıvıyı dökün ve peleti en az 1 mL buz gibi suda hafifçe yukarı ve aşağı borular dökerek yeniden askıya alın.
    NOT: Örnek peletteki artık metanol yeniden askıya alınmasına yardımcı olur.
  12. Adım 1.4'te hazırlanan 2 mL vidalı kapak borularına aktarın. Hücreleri yeniden peletlemek için >13.000 x g'de kısaca (örn. 10 s toplam süre) döndürün, buzun üzerine yerleştirin ve sıvıyı çıkarın.
    NOT: Hücre peleti -70 ila -80 °C'de birkaç ay saklanabilir.

2. Toplam RNA hazırlanması

NOT: Tamamlanma süresi 90 dk'dır.

  1. RNA'yı bozulmadan korumak için dietil pirokarbonat (DEPC) ile işlenmiş çözeltiler kullanın. Aliquot filtreler pipet uçları kullanarak çözümleri ve her zaman eldiven giymek.
    1. Bir çözüm için DEPC 1/1000 hacim ekleyin ve güçlü sallayarak karıştırın.
    2. Oda sıcaklığında (RT) 24 saat bekletin, sonra otoklav.
    3. Amin gruplarına (tris gibi) sahip çözümler DEPC'ye işlenemez. Aliquot toz ve rna iş için özel saklamak. Çözümü yapmak için daha önce depc işlem görmüş H2O'yu kullanın.
      NOT: RNA üzerindeki tiyo grubu fotoaktiz olduğundan, bu noktadan itibaren UV ışığına maruz kalma en aza indirin. Depolama karanlıkta olmalı ve kuluçka en iyi bir kapaklı bir PCR makinede yapılır.
  2. Bir S. pombe başak hücre pelet yerine kültür (her ikisini de yapmayın) eklenecek ise, şimdi ekleyin. Pelet eklemeden önce, buz ve girdap üzerinde thiolated S. pombe hücrelerinin bir aliquot iyice, en az 30 s, çözülme.
    NOT: 1.5.1−1.5.7 adımlarına göre hazırlanırsa, 30 mL kültürden elde edilen bir pelet için 10 μL S. pombe aliquot gereklidir.
  3. Kapağı takmadan önce, kapak ve tüp arasında hiçbir zirkon boncuk sıkışmadığından emin olmak için 1−2 s için çok kısa bir süre döndürün, bu da tüpten örnek ve fenol sızıntısına neden olabilir.
  4. 400 μL asetat EDTA (AE) tampon (50 mM sodyum asetat pH 5.3, 10 mM EDTA pH 8.0) hücreleri şiddetle girdap ile yeniden askıya alın. %10 (w/v) sodyum dodecyl sülfat (SDS) 40 μL ekleyin. SDS köpük olacak gibi girdap etmeyin.
  5. Β-est AID 4U protokolü kullanılacaksa, protein analizi için hücre süspansiyonunun 40°L'sini alın7. Hacmi 400 μL'ye kadar geri yapmak için 40 μL AE ekleyin.
  6. 10 s için düşük pH ve girdap 800 μL fenol (DİkKAT) ekleyin.
    DİkKAT: Fenol inhalasyon ve temas ile toksik ve aşındırıcı. Her zaman bir duman kaputfenol içeren prosedürleri gerçekleştirmek ve eldiven iki çift giymek.
  7. Hücreleri homogenizer (örn. MalzemeTablosu) en düşük güç ayarında üç 2 dakikalık patlamaiçin inceleyin. Homojenizasyon darbeleri arasında 2 dakika buz üzerinde örnekleri bırakın.
    NOT: Diğer homogenizers kullanıyorsanız koşulları optimize edin. Yetersiz titreme kötü verimlere neden olurken, aşırı titreme 260 nm (A260)absorbance tarafından belirlendiği gibi, belirgin daha yüksek verim ile sonuçlanır, ancak RNA bozulabilir. Homojener tercih edilir, ancak sıcak fenol RNA arınma12 kullanılabilir.
  8. 5 dakika boyunca kuru buz üzerine lysed örnek yerleştirin, katılanıncaya kadar, bu rna içine genomik DNA taşıma azaltır. Örnek çözülmeyeceği için çok uzun süre donmayın. Spin 5 dk mikrofuge de >13,000 x g RT at; numune/fenol karışımı düşük sıcaklıkta yapılırsa spin boyunca katı kalacağından, 4 °C'de bunu yapmak için cazip olmayın.
    NOT: Eğer numune dönüş sonunda hala donmuşsa, numune tamamen çözülene kadar 5 dakika daha yeniden döndürün.
  9. Fenol/kloroform ekstresi daha sonra eşit hacimli (yaklaşık 600 μL) fenol ile kloroform özü:kloroform 5:1 sonra kloroform (DİkKAT). Üst fazı fenol içeren başka bir tüpe aktarın:kloroform 5:1 veya kloroform. Vortex, sonra RT bir mikrofuge 5 dakika boyunca spin. Daha sonra üst fazı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
    DİkKAT: Kloroform inhalasyon ve temas ile toksiktir. Her zaman bir duman kaputunda kloroform içeren prosedürleri gerçekleştirmek ve eldiven iki çift giymek.
  10. 10 M LiCl'lik üçüncü ila yarım hacim (yaklaşık 300°L) ekleyin ve RNA'yı çökeltmek için karıştırın. Numune hemen bulutlu gitmeli, ancak en az 10 dakika buz üzerinde veya 4 °C'de (donacağı için -20 °C'nin altında saklamayın) veya çökeltme olana kadar bekletilmelidir.
  11. Bir mikrofuge >13.000 x g 5 dakika için spin. Sıvıyı çıkarın, kısa bir süre yeniden döndürün ve dregs kaldırın. 300−500 μL%70 etanol ile pelet yıkayın, kısa bir süre spin ve kalan etanol kaldırın.
    NOT: Bu yıkıntılar sırasında ilk dönüş olarak tüpün aynı tarafında pelet tutmak, bu şekilde pelet hareket etmez ve kırmak; Eğer kırılırsa RNA'nın bir kısmı kazara kaybolabilir.
    NOT: Peleti kurutmayın; sıvının çoğu çıkarıldığı sürece sonraki adımlara müdahale etmez. RNA bu aşamada -20 °C'de birkaç ay veya uzun süreli depolama için -70 ila -80 °C arasında saklanabilir.
  12. RNA peletini 90 μL TE pH 7.0 (10 mM Tris HCl pH 7.0, 1 mM EDTA pH 8.0) halinde 65 °C'de ısıtarak yeniden çözün. RNA daha yüksek sıcaklıklarda bozulduğu için bu işlem en fazla 5 dakika olmalıdır. Tam RNA çözünürasyon için kontrol edin ve sonra 0.2 mL tüp aktarın. Pipet örnek yukarı ve aşağı; hiçbir "topaklar" olmalıdır ve sıvı yükselmesi ve ucu sorunsuz düşmesi gerekir. Bu çözelti viskozdur, bu nedenle son pipetleme hareketi yavaş olmalıdır.
    NOT: RNA bu aşamada karanlıkta -20 °C'de saklanabilir; Bu da RNA çözünürlük için yararlı olabilir.

3. Biyotinylasyon

NOT: Tamamlanma süresi 60 dkdır. Aşağıdaki adımlar, girdapta açma eğilimi ayrı kapaklı şeritlere göre daha az olduğu için, integral kapaklı bir tüp şeridinde rahatlıkla yapılır.

  1. 5 mM HPDP-biotin çözeltisinin (MTS-biotin HPDP-biotin ile aynı şekilde kullanılabilir) 10 μL(1/10 son hacim) ekleyerek RNA'ya biyotinylate ve iyice karıştırın. Biotin'i eklemeden önce RNA'yı 65 °C'de en fazla birkaç saniye Önceden ısıtın. Karanlıkta maksimum 30 dakika 15 dakika için 65 °C'de kuluçka.
    NOT: Bazı HPDP toplu işleri RNA örneğinde RT'de çökeltisi olduğundan bu ısıtma gereklidir. Isıtmalı kapaklı bir PCR bloğu bunun için idealdir.
  2. Küçük bir reçine hacmi, boyutdışlama sütunu (Tablo Malzemeler) unincorporated biotin hariç hazırlayın. Sütunun alt etiketini çıkarın ve kapağı gevşetin, 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tamponu temizlemek için 1 500 x g'de döndürün ve 0,3 mL TE'yi yavaşça sütunun üstüne ekleyin ve tekrar döndürün. Toplam 3 yıkama için yıkamayı ve iki kez daha döndürün. Son olarak yıkanmış kolonu 1,5 mL'lik taze bir tüpe aktarın.
  3. Örnek kuluçka (adım 3.1) tamamlandıktan sonra, örneği sütunun üst bölümüne ekleyin. 2 dk için 1500 x g spin. Biyotinylated RNA örneği şu anda tüpün dibinde.
    NOT: 1 dk dönüş tüm numuneyi çıkarmak için yeterli değildir.
  4. 10 M LiCl'lik üçüncü ila yarım hacim (yaklaşık 40°L) ekleyin, RNA'yı adım 2.10 olarak yeniden çökeltmek için karıştırın. Örnek hemen bulutlu gitmeli ama en az 5 dakika buz üzerinde veya 4 °C veya çökelti flocculates kadar bırakın; -20 °C'nin altında donacağı için saklamayın. Bir mikrofuge >13.000 x g 5 dakika için örnek santrifüj.
  5. %80 etanol, ≤1 saat döner. Mümkün olduğunca sıvı kaldırmak için adım 2.11 prosedürü izleyin.
    NOT: HPDP-biotin %80 etanolde çok çözünür olduğundan, bu ek bir arınma adımıdır.
  6. Mümkün olduğunca çok un-incorporated biotin kaldırmak için% 80 etanol yıkama tekrarlayın.
    NOT: RNA bu aşamada karanlıkta -20 °C'de de saklanabilir.

4. Yeni sentezlenen RNA saflaştırma

NOT: Tamamlanma süresi 2 saattir.

  1. RNA'yı 200 μL DEPC ile işlenmiş H2O (65 °C kuluçka, adım 2.12'deki prosedüre benzer şekilde kullanılabilir) yeniden eritin.
  2. RNA konsantrasyonu Bir spektrofotometre kullanarakA 260'ta ölçün; spektrofotometrenin doğrusal aralığı içinde elde etmek için numunenin 1/10 seyreltilmesi gerekebilir. Girdap bu seyreltme en az 10 s viskoz RNA eşit çözünmüş olduğundan emin olmak için.
    NOT: Gerekirse biyotinylasyonun etkinliği nokta blot13 ile değerlendirilebilir.
  3. Taze bir tüpe eşit miktarda RNA ekleyin ve DEPC ile işlenmiş H2O'da 200 μL'a kadar makyaj yapın.
    NOT: Elektronik tablo 4tU deneme şablonu.xlsx bu hesaplamaya yardımcı olacak bir forma sahiptir.
  4. Numune RT'de yken, 10 x NaTM tamponunun 25°L'sini ekleyin (0,1 M Tris HCl pH 7,0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl2), 25 μL 1 M NaPi pH 6,8 (0,5 M NaH2PO4 0,5 M Na2HPO4) ve %10 SDS'nin 2,5 μL'si. Iyice karıştırın ve hafifçe döndürün (<30 s; yaklaşık 100 x g).
    NOT: SDS ve tuzların yağışını önlemek için numuneler 4.13 adıma kadar aşağıdaki işlemler boyunca RT'de tutulmalıdır.
  5. 1x NaTM arabelleği, 0,1 M NaPi ve %0,1 SDS, numune başına 2 mL içeren boncuk arabelleği yapın. Gerekli miktarda H2Oilk ve SDS son ekleyin. Bu 24 saat sonra bir çökelti formları olarak her zaman taze yapılmalıdır.
    NOT: Çökelti oluşumunu önlemek için boncuk tamponu aşağıdaki işlemler boyunca RT'de tutulmalıdır. DEPC tedavi veya otoklav etmeyin.
  6. Düşük tutma 1.5 mL tüp e 50 μL streptavidin boncuk ekleyin. Tüpü manyetik rafa yerleştirin, boncukların yerleşmesini bekleyin ve sıvıyı çıkarın
  7. Streptavidin boncuklarını yıkayın.
    1. Boncuk pelet tamamen askıya alınana kadar boncuk tampon ve girdap 200 μL ekleyin. Genellikle 3−5 s gerekli olan tek şey. RNA örneği eklenmeden önce yapılan yıkarlar için tüpleri yuvarlak çevirmek yeterlidir, böylece boncuklar tüpün diğer tarafına doğru hareket eder. Sonra tüpleri orijinal tarafa çevirin, böylece boncuklar bir kez daha tüpün içinden geçsin.
    2. Tüpü düşük hızda (yaklaşık 100 x g) maksimum 5 s sıvıyı aşağı döndürmek için döndürün, ancak boncukları döndürmeyin.
    3. Boncukmıknatıs tarafından yakalanan izin vermek için manyetik raf yerleştirin.
    4. Az sayıda numune için aspirasyon ile sıvıçıkarın; sıvı dökün eğer çok örnek.
      NOT: Çok sayıda numune ile, tüm sıvının tamamen aspirasyonla çıkarılması sorunlu olabilir, çünkü ilk numunedeki boncuklar son numune bitmeden kurutulabilir, bu arka planı arttırır. Yıkama mıknatıs üzerinde iken aynı anda tüm numunelerden sıvı dökülerek hızlandırılabilir. Onlar dökmeden önce mıknatıs üzerinde biraz daha uzun bırakılmalıdır ve kalan sıvı nın küçük miktarda uzak aspire edilmesi gerekir ama, genel olarak, mıknatıs üzerinde daha az zaman ve sıvı olmadan anlamına gelir. Bu şekilde, hızlı bir şekilde 24 veya daha fazla ekstraksiyon yapmak mümkündür.
  8. 200 μL boncuk tampon, 10 μL 20 mg/mL glikojen ve 2.5 μL 5 mg/mL tRNA, RT'de orta hızda 20 dk dönen uç ile blok. Rotasyon boncukları süspansiyonda tutmak. Engelleme tamamlandıktan sonra 4.7.2−4.7.4 adımları olarak sıvıyı çıkarın ve bölüm 4.7'deki adımlar gibi tekrar yıkayın.
  9. Örnekteki boncukları askıya alın. 30 dk dönme ile RT'de kuluçka.
  10. Kuluçka sırasında, her numune için 1,5 mL'lik taze bir tüp hazırlayın. 3 M sodyum asetat pH 5.3 ve 20 g glikojen 1/10 hacim (yaklaşık 10 μL) ekleyin ve 3 s. Bir rafta gerekli kadar saklayın yaklaşık 100 x g spin.
  11. 4.7.2−4.7.4 adımolarak, bağlanmamış RNA'yı boncuklardan çıkarın. Bağlanmamış RNA taze bir tüp içinde sebat edilebilir, ancak tuzlar ve SDS arındırmak için çok zor olun. Daha sonra, bölüm 4.7 girdap ile, en az 3 ila 5 kez en fazla boncukyı yıkayın.
  12. Son yıkamadan sonra tüm sıvı aspire etmek için özel dikkat; her tüpe dönün ve tamponun dregs bir kez daha aspire.
  13. RNA'yı eleştirmek için, boncuklara 50°L taze hazırlanmış 0,7 M β-mercaptoetanol(βME) ekleyin (ticari olarak sağlanan stok çözeltisinin 1/20 seyreltilmesi). Girdap ve kısa bir süre spin, adımlar 4.7.1 ve 4.7.2 olarak. Bulamacı manyetik rafa ve pipete yerleştirin RNA çözeltisini içeren 4.10 adımda hazırlanan 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
  14. Boncuklardan artık RNA'yı kurtarmak ve bu boncuklardan gelen ilk elüasyonu içeren tüpe eluted örneğini eklemek için 4.13.
  15. Numuneyi manyetik rafa geri yerleştirerek ve sıvıyı taze, düşük bağlayıcı 0,5 mL santrifüj tüpe aktararak artık boncukları eluted RNA'dan çıkarın.
  16. Numuneyi karıştırın ve 2.5x hacim (280 μL) etanol ekleyerek nsRNA'yı çökeltin ve bir kez daha karıştırın. -20 °C'de geceye kadar 1 saat bekletin. Maksimum hızda 20 dakika (en az 13.000 x g)önceden soğutulmuş bir santrifüjde (4 °C) spin.
  17. -20 °C'de %70 etanol ile iyice yıkayın. Kalıntı βME aşağı akım uygulamalarını inhibe edeceği için, dregs mümkün olduğunca kaldırmak için her adımda spin; sonunda örnek βME kokusu olmamalıdır.
  18. DEPC ile işlenmiş 1x TE'nin 10−20 μL'lik kısmını 0,005 μL RNase inhibitörüeşdeğeri ile yeniden çözün.
    NOT: Sonraki tüm aşamalar buz üzerinde yapılmalıdır.
  19. RNA konsantrasyonu ve saflığını ölçün.
    1. A260 ve A225'i düşük numune hacmi spektrofotometresinde ölçün.
      NOT: Λ = 225 nm'ye yakın bir emicilik boncuklardan kaçınılmaz bir kirleticidir. RNA yokluğunda kirletici sinyal λ = 260 nm'de %35'e düşer. Bu nedenle, RNA gerçek miktarı formül ile yaklaşık: (A260-(A225*0.35))*40 ng/μL.
    2. Alternatif olarak, biyoanalizör gibi bir mikro-akışkan elektroforez sistemi üzerinde örnek analiz.
      NOT: Bu analiz, RNA bütünlüğü değerlendirilebildiği, kirleticinin nicelliği etkilememesi ve daha az numune alınması gerektiği için spektrofotometre kullanılmasıtercih edilir.
  20. nsRNA'yı analiz edin.
    NOT: Örneğin, belirli RNA'lar standart ters transkriptaz qPCR teknikleri ile ölçülebilir. RNA bu şekilde hazırlanan RNA-seq için kütüphane hazırlama ile uyumludur. RRNA kaldırma 5 dk.'dan az etiketleme süreleri için gerekli değildir.

Representative Results

Bu ers4tU protokolü kullanılarak kurtarılan nsRNA'nın tipik verimleri Şekil 1b'degösterilmiştir , bu bir biyoanalizör tarafından üretilmiştir ve iz RNA'nın büyüklüğüne karşı verimi gösterir (nükleotitler [nt]). Not, hem biyoanalizör izinde hem de inset grafiğinde, rna kurtarma zaman noktası 0'dan sonra uzun zaman noktalarından kurtarılan çok küçük bir kısmıdır - yaklaşık 0,3 μg RNA yaklaşık 109 hücreden iki kat daha fazla ile karşılaştırıldığında kurtarıldı aynı sayıda hücreden sadece 30 s (nsRNA 0.8g) etiketleme sonra. 15 s'de RNA geri kazanımı, örneklemenin gerçekleştiririndeki küçük farkların RNA geri kazanımı üzerinde orantılı olarak daha büyük bir etkisi olduğundan daha değişkendir. Biyoanalizör takibinde rRNA öncüleri 1000 nt'ye yakın bir tepe ve 1700−1800 nt'de bir çift tepe olarak görülebilir. Bu ara ların bolluğu, tiyasyon devam ettikçe artar.

THio-etiketleme ACT1 transkriptinin birleştirilmesini ölçmek için kullanılmıştır (Şekil 3). Tiyo-etiketlemenin başlangıcından itibaren 15 s aralıklarla alınan numuneler ve ACT1 RNA'nın işlenmesi izlenmiştir (Şekil3a,b). Görüldüğü gibi, pre-mRNA (transkripsiyon ile) oluşturulur ve lariats (pre-mRNA dan birleştirme ilk adımda), etiketleme sadece 15 s sonra bile. Yaklaşık 45 s-1 dk sonra, lariats ve pre-mRNA miktarları bu RNA türlerinin kadar transkripsiyon tarafından oluşturulan olarak birleştirme ile işlenir ile denge ulaşmak.

Şekil 3c'de gösterilen verileri üretmek için zorlanma 4tU ile 25 s'ye darbe aldı ve daha sonra idrarla kovalandı. Pre-mRNA ve lariats üretimi maksimum 1 dakikada ulaşır. Bu şekil 3bile iyi karşılaştırır; 45 s sonra elde edilen maksimum denge artı etiketleme 25 s ulaşmak için. Zirveden sonra, thio etiketli RNA'lar birleştirme işlemi boyunca kovalandıkça seviyeler düşer.

Şekil 3d β-est AID 4U sistemi 6 kullanarak, bir protein birleştirme faktörü ve RNA metabolizması üzerindeki etkisini tükenmesi gösterir6,7. Burada Prp16p, 25 dk tükenmeden sonra fizyolojik seviyelere yakın olan bu seviyenin %5'ine düşürülür. Prp16p15birleştirme ikinci adım için önemli bir birleştirme faktörüdür. Lariats birleştirme ikinci adımsırasında kaldırılır (Şekil 3a), ama burada Prp16 sınırlayıcı hale geldikçe ön mRNA düzeyinin üzerinde artış. Daha sonraki tükenme zamanlarında, ikincil etkiler nedeniyle diğer faktörler sınırlayıcı hale gelir, böylece lariat düzeyleri azalır ve pre-mRNA düzeyleri yükselir. Spliced mRNA düzeyi azalır.

Figure 1
Şekil 1: 4tU ve RNA kurtarma büyüme. (a) 4-thiouracil büyümeyi etkiler. Urasil olmadan YMM bırakma büyüme ortamında 4tU konsantrasyonunun artırılması, p4FuiΔPEST plazmidini taşıyan S. cerevisiae'nin (BY4741) iki katına çıkarılmasını artırır. Tecan Infinite Pro 200'de 4 çoğaltma kültürü 30 °C'de izlendi. Tüm kültürler, 0.1 ve 0.6 arasında OD600 ile, boyunca günlük aşamasında idi. Mock, büyüme hızını tek başına değiştirmeyen eşdeğer miktarda NaOH eklenen bir kontrol kültürüdür. Bu grafik, tiyo-etiketlemenin hızlı etiketleme ile hücrehasarı arasında uzlaşma olduğunu göstermektedir. Hata çubukları 4 çoğaltma standart hatadır. (b) nsRNA verimi yaklaşık 15 s etiketlemeden doğrusal olarak artar. Ana figür, 15 s aralıklarla 4tU ilave edildikten sonra 0 (thiolated değil) ile 2 dk arasında saflaştırılmış, nsRNA biyoanalizör izlerini gösterir. Etiketlenmemiş örnekten ayırt edilememiştir gibi 15 s'lik örneğin gösterilmediğini unutmayın. İki büyük zirve ribozomal RNA'lara (rRNA) karşılık gelir. rRNA öncüleri ve ara etkileri, olgun rRNA'lardan daha yüksek molekül ağırlığında birkaç tepe olarak görülebilir. Bu öncüllerin ve ara ların geri kazanımı zamanla artar. Bir temsili denemenin sonuçları gösterilir. Inset grafiği 4tU ile artan kuluçka ile nsRNA kurtarma gösterir. nsRNA verimi 4tU ile büyüme süresinin artmasıyla artar. Kurtarma bu deneyin zaman ölçeği boyunca son derece doğrusal (R2 = 0.934) ve biyoanalizör göz tarafından etiketlenmemiş örnek ayırt olmasa bile 4tU ile 15 s etiketleme bile arka plan üzerinde hafif bir artış gösterir Izleme. Hata çubukları üç biyolojik çoğaltma için standart hata gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: β-est AID 4U β-est AID 4U grafik protokolü. β-est AID 4U protokolünün grafiksel özeti. β-estradiol (β-est) auxin inducible degron (AID) sisteminin ekspresyonunu teşvik eder ve bu sistem aid* etiketli hedef proteini tüketir, ayrıntılı bir protokol için Barrass vd. 7'ye başvurun. Bu durumda protein yıkımı başlamadan 25 dakika önce degron sistem ekspresyonu başlatılır ve her zaman noktasında thiolation 1 dk. Örnekler indüksiyondan önce ve tükenme sırasında her 2 dakikada bir alınır. Animasyonlu bir sürüm Ek Şekil2'de görünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: ACT1 RNA birleştirmenin öncülleri ve ara ları. ACT1 pre-mRNA transkriptlerinin birleştirilmesi nicel ters transkripsiyon PCR16ile izlendi. ACT1 öncül (pre-mRNA), ara lariat-exon2 (Lariat) ve spliced ürün (mRNA) düzeyleri ACT1 Exon2 düzeyine ve bu RNA'ların sabit durum düzeylerine göre normalleştirilmiş olarak gösterilmiştir. (a) ACT1 transkriptinde qPCR ürünlerinin yeri. ACT1 transkriptlerinin birleştirme reaksiyonunun öncüllerinin, ara larının ve ürünlerinin düzeylerini titretmek için kullanılan qPCR ürünlerinin konumlarının şeması16. Ekonlar kutular, intron bir çizgi olarak ve her iki ucunda elmas ile çizgiler olarak qPCR ürünleri ile temsil edilir, renk grafiklerde kullanılan eşleşir. Pre-mRNA PCR pre-mRNA için özeldir ve bu ürün birleştirmenin ilk adımından sonra bozulan dal noktasını geçtiği için herhangi bir ara birleştirme değildir. Lariat PCR birleştirme ilk adım ve ikinci sonra üretilen excised lariat ürün tespit edecektir. mRNA PCR, splicing, mRNA ürününe özgüdür. Exon PCR'nin sonuçları (excised lariat hariç tüm öncüllerde, ara ürünlerde ve ürünlerde mevcut) grafiklerde gösterilmez, çünkü bu veriler normalleştirmek için kullanılır ve bu nedenle her zaman 1'e eşittir. (b) Sürekli tiyatılma. 4tU transkripsiyon la dahil edildikçe pre-mRNA miktarı zamanla artar ve kısa bir gecikmeden sonra birleştirme, bu miktarı lariat-exon2 ara ve birleştirilmiş ürünlere dönüştürür. Bu pre-mRNA ve lariat türlerinin seviyeleri 4tU ile büyüme 15 s kadar az sonra arka plan üzerinde tespit edilebilir ve 4tU ile sürekli etiketleme yaklaşık 45 s sonra maksimum ulaşmak, bu noktada üretim dilimlenmiş dönüşüm ile dengeli mRNA ve/veya bozulma. Değerler sabit durumlarına (grafiğin en sol daki noktası) normalleştirilmiştir ve ekson 2 düzeyleri, ekson 2'nin transkripsiyonuna göre görünümlerini ve işlemelerini göstermek için normalleşir. ACT1 RNA birleştirme büyük ölçüde co-transkripsiyonel4olduğundan,17 spliced mRNA hızla en bol türler haline gelir, seviyesi exon 2 benzer. Üç biyolojik kopyanın standart hatası, her biri üç kat daha fazla test edilmiş. (c) Nabız/kovalamaca. 25 saniyelik thiolation nabzı idrarla kovalamaca nın ardından. Bu RNA'ların (en sol nokta) sabit durum düzeyleriyle karşılaştırıldığında, başlangıçta yeni sentezlenen havuzda çok bolmiktarda bulunurlar. MRNA'ya (veya bozulmuş) işlendikçe, seviyeler kademeli olarak azalır ve her biri üç biyolojik kopyanın standart hatası ile sabit durum seviyelerine çok benzer seviyelere yaklaşır. (d) nsRNA ve protein tükenmesi. Act1 pre-mRNA transkriptlerinin panelde olduğu gibi kantitatif ters transkripsiyon PCR tarafından izlenen (a ) Şekil 2'de açıklandığı gibi auxin degron sistemini kullanarak Prp16 proteininin tükenmesi üzerine birleştirilmesi . Prp16 protein düzeyleri de ikinci Y eksenine karşı çizilen grafikte auxin tükenmesi öncesinde ki seviyelerin yüzdesi olarak görüntülenir. Prp16, panelde gösterilen birleştirmenin ikinci adımıiçinözellikle önemli olan spliceosome'ın hayati bir bileşenidir. Bu adım sınırlayıcı hale geldiğinde lariats başlangıçta birikir. Daha sonraki zamanda puan birleştirme tamamen başarısız olur, lariats artık üretilir ve pre-mRNA düzeyleri yükselir. Hata çubukları, her biri üç biyolojik çoğaltmanın standart hatasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Protokol bölümlerinin grafik özeti 1-3. Hücreler 4tU ile itmiyedilmiştir ve modifiye nükleotiti RNA'ya dahil etmek için büyümesine izin verilir. Bir tiyitli S. pombe başak zaman noktaları ve deneyler arasında normalleştirme sağlamak için eklenebilir. 4tU'nun nabzı, thiolated olmayan idrar ididin kullanılarak takip edilebilir. Etiketleme ya sürekli 4tU ek veya büyüme koşulları için bir değişiklik yapılabilir, kültür bölünmüş ve 4tU büyüme durumu değişikliği artan zamanlarda kültürlere eklendi, ama her etiketleme sadece kısa bir süre için. Hücreler toplanır ve RNA hücrelerden hazırlanır, tercihen homogenizer ve fenol bazlı yöntemler kullanılarak. RNA biyotinylated ve daha sonra biyotinylated RNA bir boyut dışlama sütunu kullanılarak unincorporated biotin saflaştırılmış. nsRNA şimdi streptavidin boncuk (bölüm 4, Şekil 5)ile arınma için hazırdır. Kırmızı daki sayılar protokoldeki adım numaralarına karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Protokol bölümünün grafik özeti 4. Bölüm 1'den 3'e (Şekil4)göre streptavidin boncuklar bloke edilir ve biyotinylated RNA örneği hazırlanan boncuklara eklenir. Biyotinylated RNA streptavidin boncuk ve un-biotinylated RNA bağlanır kaldırıldı ve yıkanmış. Biyotinylated RNA βME kullanılarak boncuklar eluted ve daha fazla araştırma için hazır çökelti. Kırmızı daki sayılar protokoldeki adım numaralarına karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: 1 ve 3 dakika tiyo-etiketleme de ithalatçıek kopyaları ile ve olmadan maya hücrelerinden nsRNA kurtarmaiyileştirilmesi. Fui1'in mayanın 2 μm plazmidden ifade edilen kendi organizatörü olduğunu unutmayın. Bu genin genomik kopyası bu her iki suşta da mevcuttur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Şekil 2: β-est AID 4U β-est AID 4U grafik protokolünün animasyonlu versiyonu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Dosya 1: 4tU_experiment_template.xltx. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız. 

Plazmid Adı İthalatçı/permease Işaretleyici Yorum
p4Fui S. cerevisiae Fui1 URA3 Fui1, Urasil ve Uridine'i ithal ederek nabız/kovalamaca deneyleri için idealdir.
pAT2 S. cerevisiae Fui1 LEU2
p4Fui-ΔPEST S. cerevisiae Fui1 URA3 Fui1'in PEST motifi devre dışı bırakılmıştır, bu nedenle hücre içi ihtiyacı için yeterli hücre içi urasil olduğunda perma azolmaz. Etiketleme deneylerinde iyi çalışır ve nabız/kovalamaca performansını artırır.
p4Fur S. cerevisiae Kürk4 URA3 Urasil permaz
YEpEBI311 H. Sapiens ENT1 LEU2 Miller ve ark.11. Ayrıca HSV timidine kigin geni içerir.
(dengeleyici nükleozit taşıyıcı)
Tüm plazmidler 2 μm esaslıdır. Tüm p4 plazmidler ve pAT plazmidlerin pRS16 serisi dayanmaktadır. FUI1 ve FUR4 kendi, endojen organizatörleri ifade edilir.

Tablo 1: Plazmidler bu protokol ile kullanılır.

Discussion

Bu makale, son derece hızlı ve spesifik 4tU etiketleme için bir protokol sunar, yeni doğan kurtarma için, yeni sentezlenmiş RNA S. cerevisiae daha az 15 s etiketleme sonra, etiketlenmemiş RNA tarafından çok düşük kontaminasyon ile.

Kullanıcı her zaman soğuk sıcaklıklar ve DEPC ile tedavi reaktifler kullanarak RNA bütünlüğünü korumak için dikkat etmelidir. Streptavidin boncuk arınma genellikle güvenilir; ancak, boncuk tampon işlemek zordur; bileşenleri doğru sırada eklenmiş ve soğutulmuş veya otoklavlı değil, taze yapılmalıdır. Yaygın başarısızlıklar arasında RNA'nın yağış adımlarından sonra tamamen çözülememesi ve bu nedenle işleme adımları sırasında biyolojik olarak biyolojik olarak çözülmemesi veya başka bir şekilde kaybolmaması sayılabilir. Ek malzemede kapsamlı sorun giderme yardımı vardır.

Ers4tU'da dikkat edilmesi gereken bazı sınırlamalar vardır. Bir zaten bahsedilen 4tU maya büyüme yavaşlar (Şekil 1a). Endojen olarak thiolated RNA9dışında, sadece etiketleme döneminde transkripsiyonu olan RNA'lar bu yöntemle saflaştırılabilir. Tiyasyon süresi boyunca genler üzerinde duraklatılmış polimerazlar saflaştırılabilen tiyitasyon transkriptleri üretmez, ancak tiyatifasyon sırasında duraklatılmış bir duruma giren veya bırakan polimerazlar nedeniyle kısmen etiketlenmiş transkriptler kurtarılabilir. Mutasyon veya büyüme koşulları nedeniyle kötü transkripsiyonu yapılan suşlar, burada kullanılan teknikler diğer yöntemlere göre nsRNA'nın iyileşmesini artıracak olsa da, az nsRNA üretir. Bu suşve koşullarda daha uzun süreler ve artan kültür hacimleri gerekebilir. Urasil'in iyi bir azot kaynağı olduğunu ve bu nedenle bu yöntemin azot açlığı ile ilgili çalışmalarda kullanılmadan önce denenmesi gerektiğini unutmayın.

Ers4tU protokolü özellikle kısa ömürlü RNA'ların analizinde yararlıdır ve bunların birçoğu o kadar hızlı bozulur ki, bozulma makinelerini sakat bırakmadan tespit edilemezler. Örnekler şifreli kararsız transkript (CUTs)4ve kısa transkript erken sonlandırma veya organizatör proksimal duraklama18 ve antisense transkripsiyon "upstream" bir promotör (PROMPTs)19tarafından üretilen içerir. Kararlı RNA türlerinin işlenmesi sırasında üretilen ara lar da geçicidir ancak ers4tU transkripsiyon4kullanılarak zenginleştirilebilir. Bu nedenle ers4tU protokolü, son derece geçici RNA türlerinin yakın fizyolojik koşullar altında analiz edilip yakalanmasına izin vermek açısından istisnaidir ve bu da diğer yöntemlere göre büyük bir avantajdır. Bu teknik, normal20'dendaha hızlı veya daha yavaş uzamış RNA polimeraz mutantlarında transkripsiyon ve aşağı RNA işleme kinetiklerini incelemek için kullanılmıştır.

Thiolation da RNA-seq ve SLAM-seq21ile uyumludur , tüm RNA çok kısa bir süre içinde üretilen izin zarif ayrıntılı olarak karakterize edilecek.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Wellcome'nin JB'ye sağladığı fonla desteklenmiştir [104648]. Wellcome Hücre Biyolojisi Merkezi'ndeki çalışmalar Wellcome çekirdek finansmanı ile desteklenmiştir [092076]. Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna De Lucas-Arias ve Shiney George: Yazarlar yardım için laboratuvar üyeleri kabul. Yazarlar da plazmid YEpEBI31111için Patrick Cramer teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol (βME) Sigma-Aldrich M3148 CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use
Chloroform Sigma-Aldrich 25668 CAUTION toxic
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave
DMF (N,N-dimethylformamide)  Sigma-Aldrich 227056 CAUTION toxic
EDTA Sigma-Aldrich 3609 Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide
Ethanol Sigma-Aldrich 29221
EZ-link HPDP Biotin Thermo scientific 21341 Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend.
Glucose Fisher Scientific  G/0500/60
Glycogen [20 mg/mL] Sigma-Aldrich 10901393001 Store at -20 °C
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel Thermo Scientific 77712 Optional
LiCl Sigma-Aldrich 793620 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 63033 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.
Methanol Fisher Scientific M/4000/PC17 CAUTION Toxic and flammable
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139 Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264
NaCl Sigma-Aldrich S9888-M 5 M solution
Phenol, low pH.   Sigma-Aldrich P4682 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.  Sigma-Aldrich P1944 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Pierce Spin Columns Thermo Scientific 69702 Optional
SCSM single drop-out –ura Formedium  DSCS101
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 32318-M Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429 CAUTION corrosive
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Sigma-Aldrich 436143 CAUTION irritant, do not inhale
Streptavidin Magnetic beads NEB 1420S Store at 4°C 
SUPERase-In, RNase inhibitor Life technologies  AM2696 Store at -20°C
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike See section 1.7 of the protocol
4-thiouracil (4tU)  ACROS ORGANICS 359930010 Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. 
Tris base Sigma-Aldrich 93362 1 M solutions at various pH
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001 5mg/ml, store at -20°C
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.
Yeast nitrogen base without amino acids  with amonium sulphate Formedium CYN0410
Zeba Columns 0.5ml Thermo Scientific 89882 Store at 4 °C 
Zirconia beads Thistle Scientific 110791052
Equipment and Consumables
Beadbeater Biospec 112011EUR Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g 
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist 
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end 
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended 
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL Eppendorf H179467N
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL Ambion AM12350
Tubes, centrifuge, 50 mL  Sarstedt 62.547.004 Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss
Tubes, centrifuge, 15 mL  Sarstedt 62.554.001
Tubes, 2 mL, screw cap Greiner 723361
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids Brand 781332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513 (2018).
  2. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).
  3. Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).
  4. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  5. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).
  6. Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast. Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).
  7. Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  8. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  9. Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression. Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).
  10. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).
  13. Rädle, B., et al. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  14. Herzog, V. A., et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).
  15. Ohrt, T., et al. Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system. RNA. 19, 902-915 (2013).
  16. Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
  17. Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast. RNA. 23, 601-610 (2017).
  18. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).
  19. Preker, P., et al. RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters. Science. 322, 1851-1854 (2008).
  20. Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast. Genome Research. 28, 203-213 (2018).
  21. Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding. Nature Methods. 15, 221-225 (2018).

Tags

Biyokimya Sayı 150 Saccharomyces cerevisiae,yeni sentezlenen RNA yeni sentezlenen transkripsiyon birleştirme RNA işleme RNA bozulması RNA metabolizması nabız takibi
RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrass, J. D., Beggs, J. D.… More

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter