Brugen af lerede uracil til sensitivt og specifikt rense nyligt transkriberet RNA fra gær Saccharomyces cerevisiae.
Nucleotid analog, 4-thiouracil (4tU), er let optages af celler og indarbejdet i RNA, da det er transkriberet in vivo, tillader isolering af RNA produceret i en kort periode med mærkning. Dette gøres ved at knytte en biotin-delen til den inkorporerede thio-gruppe og affinitet rensende, ved hjælp af streptavidin belagt perler. Opnåelse af et godt udbytte af rent, nyligt syntetiseret RNA, der er fri for allerede eksisterende RNA, gør kortere mærknings tider muligt og tillader øget tidsmæssig opløsning i kinetiske undersøgelser. Dette er en protokol til meget specifik, høj udbytte rensning af nyligt syntetiseret RNA. Den protokol, der præsenteres her, beskriver, hvordan RNA udvindes fra gær Saccharomyces cerevisiae. Men protokollen til rensning af lerede RNA fra Total RNA bør være effektiv ved hjælp af RNA fra enhver organisme, når den er blevet udvundet fra cellerne. Det rensede RNA er velegnet til analyse af mange udbredte teknikker, såsom reverse transkriptase-qPCR, RNA-SEQ og SLAM-SEQ. Specificiteten, følsomheden og fleksibiliteten af denne teknik giver uovertruffen indsigt i RNA-metabolisme.
RNA har en dynamisk karakter; snart efter det er produceret meget RNA hurtigt forarbejdes og nedbrydes. I øjeblikket, de fleste undersøgelser af RNA metabolisme analysere den samlede cellulære RNA, der er for det meste fuldt forarbejdet og på Steady State niveau. Dette niveau afhænger af balancen mellem transkription, post-transkriptional modning og nedbrydning. Analyse af de processer, der fører til Steady State ligevægt kræver specialiserede teknikker til at fange meget kortlivede RNA-arter.
Metabolisk mærkning af RNA med nukleotidanaloger såsom 4-thiouracil (4tu) eller 4-thiouridin (4su) (Se Duffy et al.1 for en fremragende anmeldelse), giver mulighed for at isolere thio-mærkede spirende RNAs og deres behandling mellemprodukter. Men, offentliggjorte protokoller indebærer mærkning gange på flere minutter2,3, somer langsom i forhold til produktionshastigheden af mange udskrifter. Det tager i rækkefølgen af et minut til at transskribere den gennemsnitlige gær gen, så mærkning gær RNA for mindre end et minut kan betragtes som ekstremt kort. Den ekstremt hurtige og specifikke 4 thiouracil protokol (ers4tU) maksimerer signal til støj ratio ved at maksimere 4tU inkorporering og minimere inddrivelse af ikke-mærket, præ-eksisterende RNA gør meget kort mærkning gange muligt4.
Den thio-modificerede base skal importeres til cellerne hurtigt og i tilstrækkelig mængde til effektivt at mærke det nyligt syntetiserede RNA (nsRNA). For at fremme dette, celler dyrkes i uracil-fri medium, og udtryk for en passende permease hjælper med at øge 4tU eller 4sU optagelse (Se tabel 1 for en liste over plasmider, som bærer egnede permease gener og supplerende figur 1). 4tU’s Opløselighed i natriumhydroxid undgår behovet for giftige organiske opløsningsmidler, der kræves af andre nukleotidanaloger. Desværre er dyrkning af kulturer i lange perioder med thio-modificerede Nukleosider ved koncentrationer større end 50 μM blevet observeret for at forstyrre ribosomer5. Men den koncentration (10 μM), der anvendes her, og de ekstremt korte mærknings tider, minimerer skadelige virkninger5 (figur 1a), mens den stadig giver tilstrækkelig RNA til analyse.
Denne teknik kan kombineres med hurtig og specifik auxin-medieret nedbrydning af et målprotein på6,7 (figur 2), benævnt “β-Est Aid 4U”-protokollen, hvor β-estradiol-reguleret ekspression af auxin- inducerbar degron (støtte) system kombineres med 4tU mærkning. Med β-Est AID 4U-tilgangen kan et målprotein være opbrugt, og virkningen på RNA-metabolismen overvåges nøje (figur 2). Timingen er kritisk; Det er tilrådeligt at se den medfølgende video og være meget opmærksom på figur 2 og dens animerede form (Se supplerende figur 2).
Behandling og nedbrydning af RNA skal stoppes ekstremt hurtigt for nøjagtig tidsopløsning. Dette opnås ved hjælp af methanol ved lav temperatur, som fikserer celleindholdet meget hurtigt og nedbryder cellemembranen, samtidig med at nukleinsyre indholdet bevares8. RNA-ekstraktionen skal være effektiv og ikke beskadige RNA. Mekanisk lysis er effektiv i fravær af chaotropic agenter (ofte disse indeholder thio grupper, så bør undgås). Litium klorid udfældning af RNA foretrækkes, da tRNAs er mindre effektivt fældet. trnas er hurtigt transkriberet og naturligt lerede9, så fjerner trnas reducerer konkurrencen om biotinylering reagens. Hvis små, meget strukturerede RNAs er af interesse, alkohol-baserede RNA nedbør metoder anbefales.
For at genvinde det thiolerede RNA, biotin er kovalent fastgjort via thio grupper indarbejdet i RNA med 4tU. Anvendelse af modificeret biotin som binder via en spalte disulfid obligation (f. eks hpdp-biotin (N-[6-(biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)propionamid,) eller MTS-biotin (methan thiosulfonat)) anbefales da det tillader frigivelse af RNA ved tilsætning af et reduktionsmiddel. Det biotinylerede RNA er affinitet renset på streptavidin koblet til magnetiske perler. Denne protokol er magen til andre nævnt tidligere10 , men er blevet intensivt optimeret til at reducere baggrunden.
Der findes to typer af thiol-mærknings forsøg, der kan udføres, kontinuerlig og diskontinuerlig mærkning. Hver har sine egne fordele. I kontinuerlig mærkning tilsættes 4tU kulturen og prøverne tages med jævne mellemrum. Denne type eksperiment viser, hvordan RNA behandles, og hvordan niveauerne ændres over tid. Som eksempler kan nævnes sammenligning af mutant med vilde-type eksperimenter og et impuls-Chase eksperiment. De eksperimenter, der er vist i figur 3b, c, er af denne type. For diskontinuerlig mærkning induceres en ændring i systemet, og RNA overvåges. Når ændringen er blevet induceret kulturen skal opdeles i flere sub-kulturer, og på bestemte tidspunkter, hver enkelt er derefter thio-mærket for en kort periode. Et eksempel er β-Est AID 4U vist i figur 27. Denne type eksperiment er især nyttig til at overvåge virkningen af en metabolisk ændring på RNA-behandling (Se figur 3D).
En grafisk gengivelse af et thio-mærknings eksperiment er præsenteret i figur 4 og figur 5, og et regneark, der i høj grad forenkler protokollens ydeevne, er tilgængelig (Se 4tu Experiment template. xlsx). De supplerende oplysninger indeholder også en omfattende fejlfindingsvejledning. For den β-Est AID 4U-protokol, der integrerer 4tU-mærkning med auxin-nedfiskningsprotokollen, se figur 2 og supplerende figur 2. Se Barrass et al.7 for detaljeret Aid depletering protokol.
Denne artikel præsenterer en protokol for ekstremt hurtig og specifik 4tU mærkning, for genopretning af spirende, nyligt syntetiseret RNA fra S. cerevisiae efter så lidt som 15 S af mærkning, med meget lav kontaminering af umærkede RNA.
Brugeren skal altid sørge for at opretholde integriteten af RNA ved brug af kolde temperaturer og DEPC-behandlede reagenser. Streptavidin perle rensning er generelt pålidelig; Men, vulst buffer er vanskeligt at håndtere; Det skal gøres frisk, med dets komponenter tilsættes i den rigtige rækkefølge, og ikke kølet eller autoklave. Fælles mangler omfatter RNA er ufuldstændigt opløst efter nedbøren trin, og så er enten ikke biotinylated eller på anden måde tabt under behandlingen trin. Der er omfattende fejlfindingshjælp i det supplerende materiale.
Der er nogle begrænsninger at være opmærksom på i ers4tU. En allerede nævnt er, at 4tU bremser væksten af gær (figur 1a). Bortset fra endogent lerede RNAs9, kun RNAs, der er blevet transskriberet i mærknings perioden kan renses ved denne metode. Polymeraser sat på pause på gener i hele thiolationstid vil ikke frembringe de tiolerede udskrifter, der kan renses, selv om udskrifter, der er delvist mærket på grund af polymeraser, som kommer ind i eller forlader en pausetilstand under thiolation, kan inddrives. Stammer, der transskribere dårligt, enten på grund af mutation eller vækstbetingelser, producere lille nsRNA, selv om de teknikker, der anvendes her, vil ikke desto mindre forbedre genopretning af nsRNA i forhold til andre metoder. Længere tid og øget kultur volumen kan være nødvendigt i disse stammer og betingelser. Bemærk, at uracil er en god kilde til kvælstof og så denne metode bør ved, før de anvendes til undersøgelser, der involverer kvælstof sult.
Ers4tU-protokollen er især nyttig til analyse af kortvarige RNAs, hvoraf mange er så hurtigt forringet, at de ikke kan identificeres uden at lamme nedbrydnings maskinerne. Eksempler omfatter kryptiske ustabile udskrifter (nedskæringer)4, og korte udskrifter produceret af for tidlig opsigelse eller promotor proksimale pauser18 og antisense transkriptionen “upstream” fra en promotor (prompter)19. De mellemprodukter, der produceres under behandling af stabile RNA-arter, er også forbigående, men kan beriges ved hjælp af ers4tU transskription4. Ers4tU-protokollen er derfor usædvanlig i at tillade meget forbigående RNA-arter, der skal analyseres og fanges under nær fysiologiske forhold, hvilket er en enorm fordel i forhold til andre metoder. Denne teknik er blevet brugt til at studere transkriptionen og downstream-RNA-behandling kinetik i RNA-polymerase-mutanter, der forlænges hurtigere eller langsommere end normalt20.
Thiolation er også kompatibel med RNA-SEQ og SLAM-SEQ21, så alle RNA produceret inden for en meget kort tid vindue, der skal karakteriseres i udsøgte detaljer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Wellcome-finansiering til JB [104648]. Arbejdet i Wellcome Center for Cell Biology understøttes af Wellcome Core-finansiering [092076]. Forfatterne anerkender medlemmerne af laboratoriet for deres hjælp: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias og shiney George. Forfatterne vil også gerne takke Patrick Cramer for plasmid YEpEBI31111.
β-mercaptoethanol (βME) | Sigma-Aldrich | M3148 | CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 25668 | CAUTION toxic |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave |
DMF (N,N-dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | 227056 | CAUTION toxic |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 29221 | |
EZ-link HPDP Biotin | Thermo scientific | 21341 | Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend. |
Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
Glycogen [20 mg/mL] | Sigma-Aldrich | 10901393001 | Store at -20 °C |
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel | Thermo Scientific | 77712 | Optional |
LiCl | Sigma-Aldrich | 793620 | 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly. |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63033 | 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly. |
Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-M | 5 M solution |
Phenol, low pH. | Sigma-Aldrich | P4682 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH. | Sigma-Aldrich | P1944 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
Pierce Spin Columns | Thermo Scientific | 69702 | Optional |
SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | 32318-M | Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | CAUTION corrosive |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Sigma-Aldrich | 436143 | CAUTION irritant, do not inhale |
Streptavidin Magnetic beads | NEB | 1420S | Store at 4°C |
SUPERase-In, RNase inhibitor | Life technologies | AM2696 | Store at -20°C |
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike | See section 1.7 of the protocol | ||
4-thiouracil (4tU) | ACROS ORGANICS | 359930010 | Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. |
Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | 1 M solutions at various pH |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | 5mg/ml, store at -20°C |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C. |
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 | |
Zeba Columns 0.5ml | Thermo Scientific | 89882 | Store at 4 °C |
Zirconia beads | Thistle Scientific | 110791052 | |
Equipment and Consumables | |||
Beadbeater | Biospec | 112011EUR | Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established. |
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA. | |||
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible. | |||
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g | |||
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist | |||
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark. | |||
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end | |||
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended | |||
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL | Eppendorf | H179467N | |
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL | Ambion | AM12350 | |
Tubes, centrifuge, 50 mL | Sarstedt | 62.547.004 | Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss |
Tubes, centrifuge, 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 | |
Tubes, 2 mL, screw cap | Greiner | 723361 | |
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids | Brand | 781332 |