Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Ekstremt hurtig og specifik metabolisk mærkning af RNA in vivo med 4-thiouracil (Ers4tU)

doi: 10.3791/59952 Published: August 22, 2019

Summary

Brugen af lerede uracil til sensitivt og specifikt rense nyligt transkriberet RNA fra gær Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Nucleotid analog, 4-thiouracil (4tU), er let optages af celler og indarbejdet i RNA, da det er transkriberet in vivo, tillader isolering af RNA produceret i en kort periode med mærkning. Dette gøres ved at knytte en biotin-delen til den inkorporerede thio-gruppe og affinitet rensende, ved hjælp af streptavidin belagt perler. Opnåelse af et godt udbytte af rent, nyligt syntetiseret RNA, der er fri for allerede eksisterende RNA, gør kortere mærknings tider muligt og tillader øget tidsmæssig opløsning i kinetiske undersøgelser. Dette er en protokol til meget specifik, høj udbytte rensning af nyligt syntetiseret RNA. Den protokol, der præsenteres her, beskriver, hvordan RNA udvindes fra gær Saccharomyces cerevisiae. Men protokollen til rensning af lerede RNA fra Total RNA bør være effektiv ved hjælp af RNA fra enhver organisme, når den er blevet udvundet fra cellerne. Det rensede RNA er velegnet til analyse af mange udbredte teknikker, såsom reverse transkriptase-qPCR, RNA-SEQ og SLAM-SEQ. Specificiteten, følsomheden og fleksibiliteten af denne teknik giver uovertruffen indsigt i RNA-metabolisme.

Introduction

RNA har en dynamisk karakter; snart efter det er produceret meget RNA hurtigt forarbejdes og nedbrydes. I øjeblikket, de fleste undersøgelser af RNA metabolisme analysere den samlede cellulære RNA, der er for det meste fuldt forarbejdet og på Steady State niveau. Dette niveau afhænger af balancen mellem transkription, post-transkriptional modning og nedbrydning. Analyse af de processer, der fører til Steady State ligevægt kræver specialiserede teknikker til at fange meget kortlivede RNA-arter.

Metabolisk mærkning af RNA med nukleotidanaloger såsom 4-thiouracil (4tu) eller 4-thiouridin (4su) (Se Duffy et al.1 for en fremragende anmeldelse), giver mulighed for at isolere thio-mærkede spirende RNAs og deres behandling mellemprodukter. Men, offentliggjorte protokoller indebærer mærkning gange på flere minutter2,3, somer langsom i forhold til produktionshastigheden af mange udskrifter. Det tager i rækkefølgen af et minut til at transskribere den gennemsnitlige gær gen, så mærkning gær RNA for mindre end et minut kan betragtes som ekstremt kort. Den ekstremt hurtige og specifikke 4 thiouracil protokol (ers4tU) maksimerer signal til støj ratio ved at maksimere 4tU inkorporering og minimere inddrivelse af ikke-mærket, præ-eksisterende RNA gør meget kort mærkning gange muligt4.

Den thio-modificerede base skal importeres til cellerne hurtigt og i tilstrækkelig mængde til effektivt at mærke det nyligt syntetiserede RNA (nsRNA). For at fremme dette, celler dyrkes i uracil-fri medium, og udtryk for en passende permease hjælper med at øge 4tU eller 4sU optagelse (Se tabel 1 for en liste over plasmider, som bærer egnede permease gener og supplerende figur 1). 4tU's Opløselighed i natriumhydroxid undgår behovet for giftige organiske opløsningsmidler, der kræves af andre nukleotidanaloger. Desværre er dyrkning af kulturer i lange perioder med thio-modificerede Nukleosider ved koncentrationer større end 50 μM blevet observeret for at forstyrre ribosomer5. Men den koncentration (10 μM), der anvendes her, og de ekstremt korte mærknings tider, minimerer skadelige virkninger5 (figur 1a), mens den stadig giver tilstrækkelig RNA til analyse.

Denne teknik kan kombineres med hurtig og specifik auxin-medieret nedbrydning af et målprotein på6,7 (figur 2), benævnt "β-Est Aid 4U"-protokollen, hvor β-estradiol-reguleret ekspression af auxin- inducerbar degron (støtte) system kombineres med 4tU mærkning. Med β-Est AID 4U-tilgangen kan et målprotein være opbrugt, og virkningen på RNA-metabolismen overvåges nøje (figur 2). Timingen er kritisk; Det er tilrådeligt at se den medfølgende video og være meget opmærksom på figur 2 og dens animerede form (Se supplerende figur 2).

Behandling og nedbrydning af RNA skal stoppes ekstremt hurtigt for nøjagtig tidsopløsning. Dette opnås ved hjælp af methanol ved lav temperatur, som fikserer celleindholdet meget hurtigt og nedbryder cellemembranen, samtidig med at nukleinsyre indholdet bevares8. RNA-ekstraktionen skal være effektiv og ikke beskadige RNA. Mekanisk lysis er effektiv i fravær af chaotropic agenter (ofte disse indeholder thio grupper, så bør undgås). Litium klorid udfældning af RNA foretrækkes, da tRNAs er mindre effektivt fældet. trnas er hurtigt transkriberet og naturligt lerede9, så fjerner trnas reducerer konkurrencen om biotinylering reagens. Hvis små, meget strukturerede RNAs er af interesse, alkohol-baserede RNA nedbør metoder anbefales.

For at genvinde det thiolerede RNA, biotin er kovalent fastgjort via thio grupper indarbejdet i RNA med 4tU. Anvendelse af modificeret biotin som binder via en spalte disulfid obligation (f. eks hpdp-biotin (N-[6-(biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)propionamid,) eller MTS-biotin (methan thiosulfonat)) anbefales da det tillader frigivelse af RNA ved tilsætning af et reduktionsmiddel. Det biotinylerede RNA er affinitet renset på streptavidin koblet til magnetiske perler. Denne protokol er magen til andre nævnt tidligere10 , men er blevet intensivt optimeret til at reducere baggrunden.

Der findes to typer af thiol-mærknings forsøg, der kan udføres, kontinuerlig og diskontinuerlig mærkning. Hver har sine egne fordele. I kontinuerlig mærkning tilsættes 4tU kulturen og prøverne tages med jævne mellemrum. Denne type eksperiment viser, hvordan RNA behandles, og hvordan niveauerne ændres over tid. Som eksempler kan nævnes sammenligning af mutant med vilde-type eksperimenter og et impuls-Chase eksperiment. De eksperimenter, der er vist i figur 3b, c, er af denne type. For diskontinuerlig mærkning induceres en ændring i systemet, og RNA overvåges. Når ændringen er blevet induceret kulturen skal opdeles i flere sub-kulturer, og på bestemte tidspunkter, hver enkelt er derefter thio-mærket for en kort periode. Et eksempel er β-Est AID 4U vist i figur 27. Denne type eksperiment er især nyttig til at overvåge virkningen af en metabolisk ændring på RNA-behandling (Se figur 3D).

En grafisk gengivelse af et thio-mærknings eksperiment er præsenteret i figur 4 og figur 5, og et regneark, der i høj grad forenkler protokollens ydeevne, er tilgængelig (Se 4tu Experiment template. xlsx). De supplerende oplysninger indeholder også en omfattende fejlfindingsvejledning. For den β-Est AID 4U-protokol, der integrerer 4tU-mærkning med auxin-nedfiskningsprotokollen, se figur 2 og supplerende figur 2. Se Barrass et al.7 for detaljeret Aid depletering protokol.

Protocol

1. vækst og thio-mærkning

Bemærk: tid til færdiggørelse af denne del af protokollen er meget variabel, afhængigt af cellevækst rate. Lad 1 h forberede løsningerne og udstyret før thio-mærkningen og 30 min efter mærkning til behandling af prøver.

  1. Sørg for, at S. cerevisiae -stammen indeholder en plasmid-kodning af en permease (tabel 1) for at øge 4tu-importen i cellen.
    NB: uden en importør er det usandsynligt, at en mærkning på mindre end 2 minutter vil blive vellykket11 (Se supplerende figur 1). 4tU inkorporering er mere effektiv, hvis væksten er i medium uden uracil, så stammen skal være URA3+; flere af plasmiderne i tabel 1 bærer URA3 som markør. Hvis denne protokol skal kombineres med β-Est støtte udtømning7, kræves der yderligere belastningsændringer.
  2. Forbered YMM uracil-fri medium ved at tilføje 6,9 g gær nitrogen base uden aminosyrer, 20 g glucose, og 1,92 g SCSM enkelt Drop-out − ura (tabel over materialer) til 1 L vand. Autoklave eller filter sterilisere vækstmediet før brug.
    Bemærk: filter sterilisering foretrækkes som peptid/sukker komplekser fremstillet ved autoklavering Co-udfældning med cellerne i methanol, der anvendes i prøveopsamling.
  3. Dyrk gær i YMM uracil-fri medium til en optisk tæthed ved 600 nm (OD600) på 0,6 − 0,8. Sikre kulturen er i log fase vækst og har været i mindst to doublings. Det anbefales normalt at anvende en vækst ved 30 °C, men andre temperaturer kan fx anvendes til temperaturfølsomme stammer.
    Bemærk: afhængigt af stammen, vækstbetingelserne og RNA-udbyttet vil der være behov for ca. 30 mL prøvevolumen. Dette beløb vil blive antaget i hele protokollen. 30 mL af kulturen er den mest, der vil passe ind i et 50 mL centrifugeglas med 20 mL methanol, så det er en bekvem volumen til at starte optimering. Overvej at bruge mere prøvevolumen til tidlige tidspunkter for at øge RNA-genfinding, op til 2000 mL er blevet brugt til langsommere vækst celler ved virkelig korte mærknings tider (< 1 min).
  4. Chill ca. 50 mL H2O på is. For hver prøve tilsættes 200 μL zirconiumperler til et 2 mL skruelåg og afkøler på is. Læg også 20 mL methanol (forsigtighed) i 50 mL centrifugeglas, og Anbring på tøris (forsigtighed). Methanol skal være 1/3 til 2/3 volumen af prøven.
    Forsigtig: methanol er giftigt ved indånding, kontakt og indtagelse. Udsæt store mængder i en stinkhætte, og bær to par handsker, da methanol kan trænge ind i laboratorie handsker af nitril. Methanol er meget brandfarlig, holdes væk fra alle antændelseskilder.
    Bemærk: da tøris kan forårsage kulde forbrændinger ved kontakt og frembringer asphixiant gas, skal der anvendes handsker ved håndtering og brug i et godt ventileret rum.
    Bemærk: tilsætning af perlerne på dette tidspunkt er lettere end efter prøven er blevet tilføjet som røret er tørt og når spinding ned i cellen pellet perlerne er også spundet fri af røret tråd spare lidt tid. Derudover gør dette det muligt for perlerne at køle af, før prøven tilsættes.
  5. Hvis en s. pombe Spike skal tilsættes til kulturen (snarere end senere), tø en alikvot af lerede S. pombe celler på is og vortex grundigt, mindst 30 S, derefter føje til kulturen. Hvis den tilberedes i henhold til instruktionerne nedenfor, er en S. pombe alikvot tilstrækkelig til 400 ml kultur (nok til 12 30 ml prøver plus lidt til at give mulighed for fejl i håndteringen). Hvis der anvendes mere eller mindre kultur, justeres mængden af S. pombe tilsat til kulturen.
    1. Vokse 1 L af s. pombe kultur til OD600 til 0,8 præcis som beskrevet i protokollen for s. cerevisiae.
    2. Thio-label som trin 1,7, men i 10 min.
    3. Fix hele kulturen ved hjælp af 400 mL methanol på tøris, i det væsentlige som beskrevet i trin 1,9.
    4. Pellet cellerne ved centrifugering ved 3000 x g i 3 min.
    5. Supernatanten kasseres, og celle pellet opslæmmes i 3,3 mL H2O.
    6. Opdeles i aliquoter på 80 μL hver. Opbevares ved-80 °C.
    7. Brug alle en alikvot til 400 mL kultur eller 10 μL pr. 30 mL prøve.
      Bemærk: Reducer mængden af Spike til 1/10 , hvis du udfører rnaseq. Genanvend ikke aliquoter; Kassér ubrugt spids. Denne stigning er nyttig til at normalisere og sammenligne resultater på tværs af tidspunkter og eksperimenter.
  6. Ved diskontinuerlig mærkning inducerer man den påkrævede metaboliske forstyrrelse (f. eks. vækstbetingelser, geninduktion eller udtømning, såsom β-Est-støtte7 (figur 2 og supplerende figur 2), og derefter opdeles kulturen. Sørg for, at alle kolber og medier er ved den ønskede temperatur og, hvis det er muligt, at luse mediet, før du tilføjer kulturen.
  7. Tilsæt 4tU til kulturen til en koncentration på 10 μmM og bland kraftigt (1/10.000 af kultur volumen på 100 mm 4tu opløst i 1 M NaOH). Thiol-etiket i 15 s til 5 min.
    Bemærk: tredive sekunder er et godt udgangspunkt. Thio-mærkning for mindre end 20 s giver flere variable resultater på grund af vanskeligheder med at manipulere kulturen under tidspres. Men mærkning i mere end 1 min reducerer den tidsmæssige opløsning af teknikken.
  8. Hvis der skal udføres et Chase-eksperiment Tillad thio-mærkning for 20 − 30 s derefter Chase ved at tilføje 1/200 kultur volumen på 1 M uridin (ikke thiolated), til en endelig koncentration på 5 mm.
    Bemærk: Uridine er at foretrække frem for uracil til jagten, da Uridine er mere vandopløselige, hvilket gør det muligt at tilføje en mindre mængde til kulturen, så der er mindre forstyrrelse af cellernes vækst.
  9. Tag prøver af kulturen med jævne mellemrum (mindst 15 s), til slutningen af tidsforløbet. Prøvetagnings intervaller kortere end dette er svære at udføre pålideligt. Prøven tilsættes til methanol på tøris fremstillet i trin 1,4. For nemheds skyld tilsættes 30 mL kultur til et 50 mL rør, der indeholder 20 mL methanol.
    Bemærk: carbondioxid opløses i methanol, når det er koldt; Dette kommer ud af opløsningen ved tilsætning af prøven og skum kraftigt efter blanding-hvilket resulterer i prøvens tab. For at undgå dette skal du slappe af methanol for at <-70 °C i et tætlukket rør indtil tæt på den tid, det er nødvendigt, og derefter overføre til tøris.
  10. Forsegl røret og bland grundigt ved at ryste. Placer prøverne på is. Kontrollere, at ingen af prøverne har frosset; Hvis ja, forsigtigt varm i hånden, invertering konstant. Dette gøres bedst i hånden, da prøvens temperatur kan vurderes, bør den altid føles kold. Sted på is. Dette er ikke et pausepunkt; Når alle prøven er flydende gå videre til næste trin.
  11. Spin ved 3000 x g i 2 min (ved 4 °c om muligt) for at pille cellerne. Hæld væsken af, og Opsæt pellet i mindst 1 mL iskold vand ved forsigtigt at pipettere op og ned.
    Bemærk: rest methanol i prøve pillestøtten resuspension.
  12. Overfør til 2 mL skruelåg som forberedt i trin 1,4. Spin kortvarigt (f. eks. 10 s samlet tid) på > 13000 x g for at re-pellet cellerne, Placer tilbage på isen og fjern væsken.
    Bemærk: celle pellet kan opbevares ved-70 til-80 °C i flere måneder.

2. klargøring af total RNA

Bemærk: tidspunktet for færdiggørelse er 90 min.

  1. Brug diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlede opløsninger til at beskytte RNA mod nedbrydning. Aliquot opløsninger med filter pipettespidser og slid handsker på alle tidspunkter.
    1. Til en løsning tilsættes 1/1000 volumen af depc og blandes ved kraftig rystning.
    2. Lad ved stuetemperatur (RT) for 24 h, derefter autoklave.
    3. Opløsninger med Amin grupper (såsom Tris) kan ikke behandles med DEPC. Alikvot pulver og opbevares specielt til RNA-arbejde. Brug tidligere DEPC-behandlet H2O til at lave opløsningen.
      Bemærk: da thio-gruppen på RNA er fotoaktivatable, minimerer du eksponeringen for UV-lys fra dette punkt. Opbevaring skal være i mørke og inkubation er bedst udført i en PCR maskine med et låg.
  2. Hvis en S. pombe Spike skal tilsættes til celle pellet snarere end kulturen (ikke gøre begge dele), tilføje det nu. Tø en alikvot af thiolerede S. pombe celler på is og vortex grundigt, mindst 30 S, før tilsætning til pellet.
    Bemærk: Hvis det tilberedes i henhold til trin 1.5.1-1.5.7, kræves 10 μl af S. pombe alikvot for én pellet, der er afledt af 30 ml kultur.
  3. Før du sætter hætten på, spin meget kort for 1 − 2 s at sikre, at ingen zirkoner perler er fanget mellem hætten og røret, som kan forårsage prøve og phenol at lække fra røret.
  4. Cellerne opslæmmes i 400 μL acetat EDTA (AE) buffer (50 mM natriumacetat pH 5,3, 10 mM EDTA pH 8,0), ved at vortexning kraftigt. Tilsæt 40 μL 10% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS). Må ikke vortex, som SDS vil skum.
  5. Hvis den β-Est AID 4U-protokol skal anvendes, skal der tages 40 μL af cellesuspensionen til proteinanalyse7. Tilsæt 40 μL AE for at få lydstyrken op til 400 μL.
  6. Tilsæt 800 μL phenol (forsigtighed) ved lav pH-værdi og vortex i 10 s.
    Forsigtig: phenol er giftigt og ætsende ved indånding og kontakt. Udfør altid procedurer, der involverer phenol i en stinkhætte, og bær to par handsker.
  7. Lysere cellerne i en homogenisator (f. eks. en tabel over materialer) i tre 2-minutters udbrud ved den laveste effektindstilling. Læg prøverne på is i 2 min. mellem pulser af homogenisering.
    Bemærk: Optimer betingelserne, hvis du bruger andre homogenisatorer. Utilstrækkelig rystning vil resultere i dårlige udbytter, hvorimod overdreven rystning resulterer i et tilsyneladende højere udbytte, som bestemmes af absorbans ved 260 nm (A260), men RNA kan nedbrydes. En homogenisator foretrækkes, men varm phenol RNA rensning12 kan anvendes.
  8. Placer den lyserede prøve på tøris i 5 min, indtil det størkner, dette reducerer genomisk DNA overføres til RNA. Må ikke fryses for længe, da prøven ikke vil tø. Spin 5 min i Micro fuge på > 13000 x g på rt; må ikke være fristet til at gøre dette ved 4 °C, da prøven/phenol mix vil forblive solid i hele spin, hvis de udføres ved lav temperatur.
    Bemærk: Hvis prøven stadig er frosset i slutningen af spin, skal du dreje igen i yderligere 5 minutter, indtil prøven er helt optøet.
  9. Phenol/chloroform ekstrakt derefter chloroform ekstrakt med samme volumen (ca. 600 μL) phenol: chloroform 5:1 derefter chloroform (forsigtighed). Den øverste fase overføres til et andet rør, der indeholder phenol: chloroform 5:1 eller chloroform. Vortex, derefter spinne i 5 minutter i en mikrofuge på RT. Derefter overføres den øverste fase til et nyt 1,5 mL rør.
    Forsigtig: chloroform er giftigt ved indånding og kontakt. Udfør altid procedurer, der involverer chloroform i en stinkhætte, og bær to par handsker.
  10. Tilsæt en tredjedel til halv volumen (ca. 300 μL) af 10 M LiCl, og bland for at udfælde RNA. Prøven skal straks være uklar, men mindst 10 min på is eller ved 4 °C (må ikke opbevares under-20 °C, som den fryser), eller indtil udfældet flokkulerer.
  11. Spin i 5 minutter ved > 13000 x g i en mikrofuge. Fjern væsken, drej kortvarigt igen og fjern dregs. Vask pellet med 300 − 500 μL 70% ethanol, spin kortvarigt og fjern den resterende ethanol.
    Bemærk: under disse vasker holde pellet på samme side af røret som det første spin, på denne måde pellet vil ikke bevæge sig og bryde; Hvis det bryder nogle af RNA kunne gå tabt ved et uheld.
    Bemærk: tør ikke pellet; så længe det meste af væsken er blevet fjernet, vil det ikke forstyrre efterfølgende trin. RNA kan også opbevares på dette stadie ved-20 °C i et par måneder eller-70 til-80 °C for langtidsopbevaring.
  12. RNA-pellets opløses i 90 μL TE pH 7,0 (10 mM Tris HCl pH 7,0, 1 mM EDTA pH 8,0) ved opvarmning ved 65 °C med omrystning, da RNA-pellet kan være svær at opløse igen. Dette må ikke være mere end 5 min som RNA nedbrydes ved højere temperaturer. Kontroller for fuld RNA solubilisering og derefter overføre til en 0,2 ml rør. Afpipetteres prøven op og ned der bør ikke være nogen "klumper", og væsken skal stige og falde jævnt i spidsen. Denne løsning er viskøs, så den endelige pipette Rings bevægelse skal være langsom.
    Bemærk: RNA kan opbevares ved-20 °C i mørke på dette stadie; Dette kan også være gavnlig for RNA opløselighed.

3. biotinylering

Bemærk: tidspunktet for færdiggørelse er 60 min. Følgende trin er bekvemt udført i en strimmel af rør med Integral hætter, da de har mindre tendens til at åbne på vortexning end strimler med separate hætter.

  1. Biotinylat ved tilsætning af 10 μL (1/10 endelig volumen) af en 5 mm hpdp-biotin opløsning (MTS-biotin kan anvendes på nøjagtig samme måde som hpdp-biotin), til RNA og blandes grundigt. Du forvarmer RNA i højst et par sekunder ved 65 °C, før du tilføjer biotin. Inkuber ved 65 °C i 15 min til maksimalt 30 minutter i mørke.
    Bemærk: denne opvarmning er nødvendig, da nogle HPDP-batcher bundfælder ved RT i RNA-prøven. En PCR-blok med et opvarmet låg er ideel til dette.
  2. Forbered en lille harpiks volumen, størrelses udelukkelse kolonne (tabel over materialer) for at udelukke den uinkorporerede biotin. Fjern kolonnens nederste tag, og Løsn hætten, og Placer den i et 2 mL centrifugeglas. Spin ved 1500 x g i 1 min til at skylle ud bufferen tilsæt 0,3 ml te forsigtigt til toppen af søjlen og drej igen. Gentag vask og spin to gange mere for i alt 3 vaske. Endelig overføre den vaskede kolonne til en frisk 1,5 mL rør.
  3. Når prøve inkubationen (trin 3,1) er fuldført, skal du tilføje eksemplet øverst i kolonnen. Spin ved 1500 x g i 2 min. Den biotinylerede RNA-prøve er nu i bunden af røret.
    Bemærk: et 1 min. spin er ikke tilstrækkeligt til at elueres hele prøven.
  4. Tilsæt en tredjedel til halv volumen (ca. 40 μL) af 10 M LiCl, bland for at re-bundfælde RNA som trin 2,10. Prøven skal omgående være uklar, men må ikke være i mindst 5 minutter på is eller ved 4 °C eller indtil udfældet flocculater. må ikke opbevares under-20 °C, da det vil fryse. Prøven centrifugeres i 5 min. ved > 13000 x g i en mikrofuge.
  5. Vask med 80% ethanol, ≤ 1 h roterende. Følg proceduren i trin 2,11 for at fjerne så meget af væsken som muligt.
    Bemærk: da HPDP-Biotin er meget opløseligt i 80% ethanol, er dette et yderligere rensningstrin.
  6. Gentag 80% ethanol Wash for at fjerne så meget un-indarbejdet biotin som muligt.
    Bemærk: RNA kan også opbevares på dette stadie ved-20 °C i mørke.

4. rensning af det nyligt syntetiserede RNA

Bemærk: tiden for færdiggørelse er 2 h.

  1. RNA genopløses i 200 μL DEPC-behandlet H2O (65 °c inkubation kan anvendes, svarende til proceduren i trin 2,12).
  2. Mål RNA-koncentrationen ved en260 ved hjælp af et spektrofotometer; prøven skal muligvis fortyndes 1/10 for at få den inden for spektrofotometrets lineære område. Vortex denne fortynding i mindst 10 s for at sikre, at det viskøse RNA er jævnt opløst.
    Bemærk: effektiviteten af biotinylering kan vurderes ved prik blot13 , hvis det er nødvendigt.
  3. Tilsæt lige store mængder RNA til et friskt rør og lav op til 200 μL i DEPC-behandlet H2O. Brug hele prøven med den laveste RNA-koncentration, og brug en passende mængde af de andre prøver til at have en tilsvarende mængde RNA for hver.
    Bemærk: regnearks 4Tu-eksperiment skabelonen. xlsx har en formular til at støtte denne beregning.
  4. Når prøven er på RT, tilsættes 25 μL 10 x NaTM buffer (0,1 M Tris HCl pH 7,0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl2), 25 μl af 1 m napi pH 6,8 (0,5 m Nah2po4 0,5 m na2HPO4) og 2,5 μL 10% SDS. Bland grundigt og drej forsigtigt (< 30 s; ca. 100 x g).
    Bemærk: for at undgå udfældning af SDS og salte skal prøverne opbevares i RT under følgende procedurer op til trin 4,13.
  5. Lav perle bufferen med 1x NaTM buffer, 0,1 M NaPi og 0,1% SDS, 2 mL pr. prøve. Tilsæt den nødvendige mængde H2O først og SDS sidst. Dette skal gøres frisk hver gang som et bundfald former efter 24 h.
    Bemærk: for at undgå dannelse af bundfald skal vulst bufferen opbevares ved RT i følgende procedurer. Må ikke DEPC behandle eller autoklave.
  6. Tilsæt 50 μL streptavidin perler til en lav retention 1,5 mL tube. Placer røret på den magnetiske rack, vente på perlerne til at bosætte sig og derefter fjerne væsken
  7. Vask streptavidin perler.
    1. Tilsæt 200 μL perle buffer og vortex indtil perle pellet er helt ophængt. Normalt 3 − 5 s er alt, hvad der kræves. Til vask før RNA prøven tilsættes er det tilstrækkeligt at dreje rørene rundt, så perlerne rejser overrøret til den anden side. Drej derefter rørene tilbage til den oprindelige side, så perlerne rejser på tværs af røret igen.
    2. Drej røret ved lav hastighed (ca. 100 x g) i højst 5 s for at spinne væsken, men ikke perlerne.
    3. Placer i magnet stativet for at gøre det muligt for perlerne at blive fanget af magneten.
    4. Fjern væsken ved aspiration for et lille antal prøver; Hæld væsken af, hvis mange prøver.
      Bemærk: med et stort antal prøver, fjerne alle væsken udelukkende ved aspiration kan være problematisk, da perlerne i den første prøve kan tørres ud, før den sidste prøve er færdig, dette øger baggrunden. Vask kan fremskyndes ved at hælde fra væsken fra alle prøver på én gang, mens på magneten. De bør stå lidt længere på magneten før hælde og den lille mængde væske, der er tilbage, skal aspireres væk, men generelt betyder det mindre tid på magneten og uden væske. På denne måde er det muligt at gøre 24 eller flere ekstraktioner hurtigt.
  8. Blok med 200 μL perle buffer, 10 μL 20 mg/mL glykogen, og 2,5 μL 5 mg/mL tRNA, 20 min roterende ende ved moderat hastighed ved RT. Rotationen er at holde perlerne i suspension. Når blokeringen er fuldført, skal du fjerne væsken som trin 4.7.2 − 4.7.4 og vaske igen som trinene i afsnit 4,7.
  9. Resuspendere perlerne i prøven. Inkuber ved RT med rotation i 30 min.
  10. Under inkubationen forberedes et frisk 1,5 mL rør til hver prøve. Tilsæt 1/10 volumen (ca. 10 μl) 3 M natriumacetat pH 5,3 og 20 μg glykogen, og spin ved ca 100 x g for 3 s. opbevares i et rack, indtil det er nødvendigt.
  11. Fjern det ubundne RNA fra perlerne som trin 4.7.2 − 4.7.4. Det ubundne RNA kan udskilles i et friskt rør, men salte og SDS gør det meget vanskeligt at rense. Derefter vaskes perlerne, som afsnit 4,7 med vortexing, for mindst 3 til højst 5 gange.
  12. Efter den sidste vask tage særlig omhu for at aspirere alle væsken; Vend tilbage til hvert rør og Aspirer igen fremstilling af bufferen.
  13. For at eluere RNA tilsættes 50 μL frisklavet 0,7 M β-mercaptoethanol (βME) til perlerne (1/20 fortynding af den kommercielt leverede stamopløsning). Vortex og spin kort, som trin 4.7.1 og 4.7.2. Opslæmningen placeres i magnet stativet, og den RNA-holdige opløsning afpipetteres i 1,5 mL centrifugeglasset fremstillet i trin 4,10.
  14. Elute endnu en gang som trin 4,13 for at genvinde residualrna fra perlerne og tilsæt elueret prøven til røret, der indeholder den første eluering fra disse perler.
  15. Fjern de resterende perler fra det eluede RNA ved at placere prøven tilbage i magnet stativet og overføre væsken til et frisk, lavt bindende 0,5 mL centrifugeglas.
  16. Bland prøven, og udfæld derefter nsRNA ved at tilføje 2,5 x volumen (280 μL) ethanol og bland en gang mere. Lad i 1 time til natten ved-20 °C. Spin i en præ-kølet centrifuge (4 °C) i 20 min ved den maksimale hastighed (mindst 13.000 x g).
  17. Vask grundigt med 200 μL 70% ethanol ved-20 °C. Som resterende βme vil hæmme downstream-applikationer, spin ved hvert trin for at fjerne så meget af fremstilling som muligt; i slutningen af prøven bør ikke lugte af βME.
  18. Opløses igen i 10 − 20 μL DEPC-behandlet 1x TE med ækvivalent til 0,005 μL Rnasehæmmer.
    Bemærk: alle efterfølgende etaper skal udføres på is.
  19. Mål RNA koncentrationen og renhed.
    1. Mål A260 og a225 i en lav prøvevolumen Spektrofotometer.
      Bemærk: en absorbans maksimum nær λ = 225 nm er fra et uundgåeligt forurenende stof fra perlerne. I fravær af RNA falder signalet fra kontaminanten til 35% ved λ = 260 nm. Derfor er den faktiske mængde af RNA tilnærmere ved formlen: (A260-(a225* 0,35)) * 40 ng/μl.
    2. Alternativt kan du analysere prøven på et Micro-fluidics elektroforese system, såsom en bioanalysator.
      Bemærk: denne analyse er at foretrække frem for at bruge et spektrofotometer, da RNA-integriteten kan vurderes, kontaminanten ikke interfererer med kvantitation og mindre prøve er påkrævet.
  20. Analysér nsRNA.
    Bemærk: for eksempel kan specifikke RNAs kvantificeres ved standard reverse transkriptase qPCR-teknikker. RNA udarbejdet på denne måde er kompatibel med bibliotek forberedelse til RNA-SEQ. fjernelse af rRNA er ikke nødvendig for mærknings tider på mindre end 5 min. der kan også udføres omspolning af SLAMseq14 på dette RNA.

Representative Results

Typiske udbytter for nsRNA genvundet ved hjælp af denne ers4tU-protokol vises i figur 1b, dette er blevet produceret af en bioanalysator, og sporingen viser UDBYTTET af RNA versus Size (nucleotides [NT]). Bemærk, at RNA-genvinding fra tidspunkt 0 er en meget lille del af det, der er genvundet fra længere tidspunkter-ca. 0,3 μg RNA genvundet fra ca. 109 celler sammenlignet med over dobbelt så meget efter blot 30 s mærkning (0,8 μg nsRNA) fra det samme antal celler. RNA opsving på 15 s er mere variabel som små forskelle i udførelsen af prøvetagning har en forholdsmæssigt større effekt på RNA opsving. I bioanalysator sporet kan rRNA-prækursorer ses som et højdepunkt nær 1000 NT og en tvivlet på toppe ved 1700-1800 NT. Den overflod af disse mellemprodukter stiger som tiolation fortsætter.

Thio-mærkning blev anvendt til at kvantificere splejsning af ACT1 transskriptionen (figur 3). Thiolation blev udført, og prøver taget med 15 s intervaller fra starten af thio-mærkningen og behandlingen af ACT1 RNA overvåges (figur 3a, b). Som det kan ses, præ-mRNA genereres (ved transskription), og lariats (ved det første trin af splejset fra præ-mRNA), selv efter blot 15 s af mærkning. Efter ca 45 s til 1 min, mængden af lariats og præ-mRNA nå ligevægt med så meget af disse RNA arter bliver skabt af transskription som behandles væk ved splejning.

For at fremstille de data, der er vist i figur 3c , blev stammen pulseret med 4tu for 25 s og derefter jaget med uridine. Den generation af præ-mRNA og lariats når et maksimum på 1 minut. Dette sammenlignes godt med figur 3b; det maksimale opnås efter 45 s at nå ligevægt plus 25 s af mærkningen. Efter toppen falder niveauerne, når de thio-mærkede RNAs jages gennem splejnings processen.

Figur 3D viser nedbrydningen af en protein splejnings faktor og dens virkning på RNA-metabolismen ved hjælp af β-Est-støtte 4U-systemet6,7. Her, Prp16p er reduceret fra nær fysiologiske niveauer til 5% af dette niveau efter 25 min af udtømning. Prp16p er en essentiel splejnings faktor for andet trin i splejsning15. Lariats fjernes under det andet trin i splejsning (figur 3a), men her stiger de over niveauet af præ-mRNA som Prp16 bliver begrænsende. Ved senere udtynding gange, andre faktorer bliver begrænsende på grund af sekundære virkninger, således at niveauet af Lariat falde, og præ-mRNA niveauer stige. Niveauet af splejset mRNA falder.

Figure 1
Figur 1: vækst i 4tU og RNA opsving. (a) 4-thiouracil påvirker væksten. Øge koncentrationen af 4tU i YMM Drop-out vækstmedium uden uracil øger fordoblingen tid af S. cerevisiae (BY4741) transporterer p4FuiΔPEST plasmid. Vækst i fire replikate kulturer blev overvåget ved 30 °C i en Tecan Infinite Pro 200. Alle kulturer var i log fase hele vejen igennem, med OD600 mellem 0,1 og 0,6. Mock er en kontrolkultur med et tilsvarende beløb af NaOH tilsat, som ikke i sig selv ændre vækstraten. Denne graf viser, at thio-mærkningen er et kompromis mellem hurtig mærkning og beskadigelse af cellen. Fejllinjer er standardfejl på 4 replikater. (b) nsrna-udbyttet stiger lineært fra ca. 15 s mærkning. Den vigtigste figur viser bioanalysator spor af renset, nsRNA fra 0 (ikke thiolated) til 2 min efter tilsætning af 4tU ved 15 s intervaller. Bemærk, at 15 s-prøven ikke er vist, da den ikke kunne skelnes fra den ikke-mærkede prøve. De to store toppe svarer til ribosomale RNAs (rRNAs). RRNA-prækursorer og mellemprodukter er synlige som flere toppe med større molekylvægt end modne rRNAs. Genopretningen af disse prækursorer og mellemprodukter stiger med tiden. Resultaterne fra et repræsentativt eksperiment vises. Den indsatte graf viser genopretning af nsRNA med stigende inkubation med 4tU. Afkastet af nsRNA stiger med stigende tid for vækst med 4tU. Opsvinget er bemærkelsesværdigt lineær (R2 = 0,934) i hele tidsskalaen af dette eksperiment og viser en lille stigning i baggrunden selv ved 15 s mærkning med 4tu, selv om det ikke adskiller sig fra den ikke-mærkede prøve i øjet fra bioanalysator Spore. Fejllinjer viser standardfejl for tre biologiske replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: β-Est Aid 4U β-Est støtte 4U grafisk protokol. Et grafisk Resumé af protokollen for β-Est AID 4U-protokollen. β-estradiol (β-EST) fremmer ekspression af det auxin inducerbare degron (støtte) system, som til gengæld udtømmer en støtte * Tagged Target protein, henvises til Barrass et al.7 for en detaljeret protokol. I dette tilfælde initieres degron system Expression 25 min før protein nedbrydning påbegyndes og thiolation på hvert tidspunkt er i 1 min. prøverne tages før induktion og hvert 2. En animeret version vises i det supplerende figur 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: prækursorer og mellemprodukter af ACT1 RNA-splicing. Splicing af ACT1 præ-mRNA-transskriptioner blev overvåget af kvantitativ reverse TRANSSKRIPTION PCR16. Niveauerne af ACT1 forløber (præ-mRNA), intermediært Lariat-exon2 (Lariat) og splejset produkt (mRNA) vises normaliseret mod niveauet af ACT1 exon2 og Steady State niveauer af disse RNAs. a) placeringen af qPCR-produkter på ACT1 udskriften. Skematisk placering af de qPCR-produkter, der anvendes til analyse af niveauerne af prækursorer, mellemprodukter og præparater af splejsning-reaktionen fra ACT1 -transskriptioner16. Exons er repræsenteret af kasser, intron som en linje og qPCR produkter som linjer med diamanter i begge ender, farven matcher dem, der anvendes i graferne. Den præ-mRNA PCR er specifik for præ-mRNA og ikke nogen mellemprodukter af splejsning som dette produkt krydser filial punkt, som er forstyrret efter det første trin af splejsning. Lariat PCR vil detektere produktet af det første trin i splejsning og den fjernede Lariat produceret efter den anden. MRNA PCR er specifik for produktet af splicing, mRNA. Resultater fra exon PCR (til stede i alle prækursorer, mellemprodukter og varer, bortset fra den fjernede Lariat) er ikke vist i graferne, da dette blev brugt til at normalisere dataene og er derfor altid lig med 1. b) kontinuerlig thiolmærkning. Mængden af præ-mRNA stiger med tiden som 4tu er indarbejdet ved transkriptionen og, efter en kort forsinkelse, splejsning konverterer det til Lariat-exon2 Intermediate og splejset produkter. Niveauerne af disse præ-mRNA og Lariat arter er detekterbare over baggrund efter så lidt som 15 s af vækst med 4tu og nå et maksimum efter ca. 45 s kontinuerlig mærkning med 4tu, på hvilket tidspunkt deres produktion er afbalanceret ved omdannelse til splejset mRNA og/eller nedbrydning. Værdier normaliseret til deres Steady State (venstre-mest punkt i grafen), og exon 2 niveauer for at vise deres udseende og behandling i forhold til transkriptionen af exon 2. Som RNA splejsning af ACT1 er stort set Co-transkriptional4,17 splejset mRNA hurtigt bliver den mest rigelige arter, dens niveau er magen til den af exon 2. Standard fejl af tre biologiske replikater, hver analyseret i tretre. (c) puls/Chase. Tiolation puls på 25 sekunder efterfulgt af Chase med uridine. Sammenlignet med Steady State niveauer af disse RNAs (venstre-mest punkt), de er i første omgang meget rigelige i den nysyntetiserede pulje. Niveauerne gradvist falde, da de er forarbejdet til mRNA (eller forringet), nærmer sig niveauer meget lig Steady State niveauer med 5 min. standard fejl af tre biologiske replikater, hver analyseret i tre eksemplarer. d) nsrna og protein udtømning. Splicing af ACT1 præ-mRNA-udskrifter overvåget ved kvantitativ reverse transkriptionspcr som i panel (a) ved udtømning af Prp16 proteinet ved hjælp af auxin degron-systemet som beskrevet i figur 2. De Prp16 protein niveauer vises også i grafen afbildet mod den anden Y-akse som procentdel af niveauer før auxin nedbrydning. Prp16 er en vital bestanddel af spliceosome, især vigtigt for det andet trin i splejsning vist i panel (a), hvorefter lariats nedbrydes. Når dette trin bliver begrænsende lariats ophobes i første omgang. På et senere tidspunkt splejsning fejler helt, lariats er ikke længere produceres og præ-mRNA niveauer stige. Fejllinjer er standardfejl i tre biologiske replikater, der hver er analyseret i triplicate. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: grafisk oversigt over protokollens afsnit 1 til 3. Cellerne er lerede med 4tu og lov til at vokse til at indarbejde den modificerede nucleotid i RNA. En lerede S. pombe Spike kan tilføjes for at tillade normalisering på tværs af tidspunkter og eksperimenter. Pulsen på 4tU kan jages ved hjælp af un-thiolated uridine. Mærkningen kan enten udføres kontinuerligt fra 4tU tilføjelse eller fra en ændring til vækstbetingelser, kultur Split og 4tU føjet til kulturer i stigende tider fra vækst betingelsen forandring, men hver mærkning kun for en kort tid. Cellerne opsamles, og RNA fremstilles fra cellerne, fortrinsvis ved hjælp af en homogenisator og phenol-baserede metoder. RNA er biotinyleret og derefter biotinyleret RNA renset fra uindarbejdet biotin ved hjælp af en størrelses udelukkelse kolonne. NsRNA er nu klar til rensning med streptavidin perler (afsnit 4, figur 5). Tal i rødt svarer til trin numrene i protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: grafisk oversigt over protokollens afsnit 4. Som følge af punkt 1 til 3 (figur 4) blokeres streptavidin-perlerne, og den biotinylerede RNA-prøve tilsættes de tilberedte perler. Den biotinylerede RNA binder sig til streptavidin perler og un-biotinylated RNA fjernet og vasket. Den biotinylerede RNA er elueret fra perlerne ved hjælp af βME og udfældede klar til yderligere forskning. Tal i rødt svarer til trin numrene i protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: forbedring af nsRNA-genvinding fra gærceller med og uden yderligere kopier af importøren på 1 og 3 minutter af thio-mærkningen. Bemærk, at Fui1 er gæren egen promotor udtrykt fra en 2 μm plasmid. Den genomiske kopi af dette gen er til stede i begge disse stammer. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: animeret version af den β-Est Aid 4U β-Est støtte 4U grafisk protokol. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1:4tU_experiment_template. xltx. Venligst klik her for at downloade denne fil. 

Plasmid navn Importør/permease Markør Kommentar
p4Fui S. cerevisiae Fui1 URA3 Fui1 importerer uracil og Uridine, hvilket gør den ideel til puls/Chase eksperimenter.
pAT2 S. cerevisiae Fui1 LEU2
p4Fui-ΔPEST S. cerevisiae Fui1 URA3 SKADEDYRS motivet i Fui1 er blevet deaktiveret, så permeasen nedbrydes ikke, når der er tilstrækkelig intracellulær uracil til cellens behov. Fungerer godt i mærkningen eksperimenter og forbedrer puls/Chase præstation.
p4Fur S. cerevisiae Fur4 URA3 Uracil permease
YEpEBI311 H. sapiens ENT1 LEU2 Miller et al.11. Indeholder også et HSV thymidinkinase-gen.
(equilibrative nukleosid-transporter)
Alle plasmider er 2 μm baseret. Alle P4 plasmider og pAT er baseret på pRS16 -serien af plasmid'er. FUI1 og FUR4 udtrykkes fra deres egne, endogene initiativtagere.

Tabel 1: Plasmid'er, der anvendes med denne protokol.

Discussion

Denne artikel præsenterer en protokol for ekstremt hurtig og specifik 4tU mærkning, for genopretning af spirende, nyligt syntetiseret RNA fra S. cerevisiae efter så lidt som 15 S af mærkning, med meget lav kontaminering af umærkede RNA.

Brugeren skal altid sørge for at opretholde integriteten af RNA ved brug af kolde temperaturer og DEPC-behandlede reagenser. Streptavidin perle rensning er generelt pålidelig; Men, vulst buffer er vanskeligt at håndtere; Det skal gøres frisk, med dets komponenter tilsættes i den rigtige rækkefølge, og ikke kølet eller autoklave. Fælles mangler omfatter RNA er ufuldstændigt opløst efter nedbøren trin, og så er enten ikke biotinylated eller på anden måde tabt under behandlingen trin. Der er omfattende fejlfindingshjælp i det supplerende materiale.

Der er nogle begrænsninger at være opmærksom på i ers4tU. En allerede nævnt er, at 4tU bremser væksten af gær (figur 1a). Bortset fra endogent lerede RNAs9, kun RNAs, der er blevet transskriberet i mærknings perioden kan renses ved denne metode. Polymeraser sat på pause på gener i hele thiolationstid vil ikke frembringe de tiolerede udskrifter, der kan renses, selv om udskrifter, der er delvist mærket på grund af polymeraser, som kommer ind i eller forlader en pausetilstand under thiolation, kan inddrives. Stammer, der transskribere dårligt, enten på grund af mutation eller vækstbetingelser, producere lille nsRNA, selv om de teknikker, der anvendes her, vil ikke desto mindre forbedre genopretning af nsRNA i forhold til andre metoder. Længere tid og øget kultur volumen kan være nødvendigt i disse stammer og betingelser. Bemærk, at uracil er en god kilde til kvælstof og så denne metode bør ved, før de anvendes til undersøgelser, der involverer kvælstof sult.

Ers4tU-protokollen er især nyttig til analyse af kortvarige RNAs, hvoraf mange er så hurtigt forringet, at de ikke kan identificeres uden at lamme nedbrydnings maskinerne. Eksempler omfatter kryptiske ustabile udskrifter (nedskæringer)4, og korte udskrifter produceret af for tidlig opsigelse eller promotor proksimale pauser18 og antisense transkriptionen "upstream" fra en promotor (prompter)19. De mellemprodukter, der produceres under behandling af stabile RNA-arter, er også forbigående, men kan beriges ved hjælp af ers4tU transskription4. Ers4tU-protokollen er derfor usædvanlig i at tillade meget forbigående RNA-arter, der skal analyseres og fanges under nær fysiologiske forhold, hvilket er en enorm fordel i forhold til andre metoder. Denne teknik er blevet brugt til at studere transkriptionen og downstream-RNA-behandling kinetik i RNA-polymerase-mutanter, der forlænges hurtigere eller langsommere end normalt20.

Thiolation er også kompatibel med RNA-SEQ og SLAM-SEQ21, så alle RNA produceret inden for en meget kort tid vindue, der skal karakteriseres i udsøgte detaljer.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Wellcome-finansiering til JB [104648]. Arbejdet i Wellcome Center for Cell Biology understøttes af Wellcome Core-finansiering [092076]. Forfatterne anerkender medlemmerne af laboratoriet for deres hjælp: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias og shiney George. Forfatterne vil også gerne takke Patrick Cramer for plasmid YEpEBI31111.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol (βME) Sigma-Aldrich M3148 CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use
Chloroform Sigma-Aldrich 25668 CAUTION toxic
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave
DMF (N,N-dimethylformamide)  Sigma-Aldrich 227056 CAUTION toxic
EDTA Sigma-Aldrich 3609 Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide
Ethanol Sigma-Aldrich 29221
EZ-link HPDP Biotin Thermo scientific 21341 Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend.
Glucose Fisher Scientific  G/0500/60
Glycogen [20 mg/mL] Sigma-Aldrich 10901393001 Store at -20 °C
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel Thermo Scientific 77712 Optional
LiCl Sigma-Aldrich 793620 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 63033 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.
Methanol Fisher Scientific M/4000/PC17 CAUTION Toxic and flammable
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139 Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264
NaCl Sigma-Aldrich S9888-M 5 M solution
Phenol, low pH.   Sigma-Aldrich P4682 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.  Sigma-Aldrich P1944 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Pierce Spin Columns Thermo Scientific 69702 Optional
SCSM single drop-out –ura Formedium  DSCS101
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 32318-M Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429 CAUTION corrosive
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Sigma-Aldrich 436143 CAUTION irritant, do not inhale
Streptavidin Magnetic beads NEB 1420S Store at 4°C 
SUPERase-In, RNase inhibitor Life technologies  AM2696 Store at -20°C
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike See section 1.7 of the protocol
4-thiouracil (4tU)  ACROS ORGANICS 359930010 Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. 
Tris base Sigma-Aldrich 93362 1 M solutions at various pH
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001 5mg/ml, store at -20°C
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.
Yeast nitrogen base without amino acids  with amonium sulphate Formedium CYN0410
Zeba Columns 0.5ml Thermo Scientific 89882 Store at 4 °C 
Zirconia beads Thistle Scientific 110791052
Equipment and Consumables
Beadbeater Biospec 112011EUR Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g 
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist 
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end 
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended 
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL Eppendorf H179467N
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL Ambion AM12350
Tubes, centrifuge, 50 mL  Sarstedt 62.547.004 Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss
Tubes, centrifuge, 15 mL  Sarstedt 62.554.001
Tubes, 2 mL, screw cap Greiner 723361
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids Brand 781332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10, (1), e1513 (2018).
  2. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).
  3. Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).
  4. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  5. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).
  6. Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast. Yeast (Chichester England). 36, (1), 75-81 (2018).
  7. Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  8. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  9. Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression. Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).
  10. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).
  13. Rädle, B., et al. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  14. Herzog, V. A., et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).
  15. Ohrt, T., et al. Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system. RNA. 19, 902-915 (2013).
  16. Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
  17. Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast. RNA. 23, 601-610 (2017).
  18. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).
  19. Preker, P., et al. RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters. Science. 322, 1851-1854 (2008).
  20. Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast. Genome Research. 28, 203-213 (2018).
  21. Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding. Nature Methods. 15, 221-225 (2018).
Ekstremt hurtig og specifik metabolisk mærkning af RNA in vivo med 4-thiouracil (Ers4tU)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).More

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter