Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

מהירה מאוד וספציפית תיוג מטבולי של RNA ב Vivo עם 4-Thiouracil (Ers4tU)

doi: 10.3791/59952 Published: August 22, 2019

Summary

השימוש העצמי אורציל לטיהור ברגישות ובמיוחד לטהר את ה-RNA החדש שהועתק מן השמרים סכביסיטאה.

Abstract

נוקלאוטיד אנלוגי, 4-thiouracil (4tU), הוא נלקח בקלות על ידי תאים שולבו ל-RNA כפי שהוא מופק ב vivo, המאפשר בידוד של RNA המיוצר בתקופה קצרה של תיוג. הדבר נעשה על-ידי הצמדת ביוטין moiety לקבוצת thio המשולבת ולטיהור אהדה, תוך שימוש בחרוזים streptavidin מצופים. השגת תשואה טובה של רנ א טהור, מסונתז לאחרונה, כי הוא ללא מקדם RNA קיים מבצע התוויות קצר יותר פעמים האפשרי והיתרים מוגברת ברזולוציה הטמפורלית במחקרים קינטית. זהו פרוטוקול עבור מאוד ספציפי, תשואה גבוהה לטיהור של RNA מסונתז לאחרונה. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר כיצד ה-RNA מופק מתוך שמרים סרביסים cerevisiae. עם זאת, את הפרוטוקול לטיהור של RNA thiolated מ-RNA הכולל צריך להיות יעיל באמצעות RNA מכל אורגניזם ברגע שהוא חולץ מן התאים. רנ א מטוהרים מתאים לניתוח על ידי טכניקות רבות בשימוש נרחב, כגון הפוכה transcriptase-qPCR, RNA-seq ו סלאם-seq. הספציפיות, הרגישות והגמישות של טכניקה זו מאפשרים תובנות ללא תחרות לחילוף החומרים של RNA.

Introduction

RNA יש אופי דינאמי; זמן קצר לאחר מכן מופק הרבה RNA הוא מעובד במהירות ומושפל. כיום, רוב המחקרים של מטבוליזם RNA לנתח את ה-RNA הסלולר הכולל, אשר ברובו מעובד באופן מלא ברמת המצב יציב. רמה זו תלויה באיזון שבין שיעורי התמלול, התבגרות והשפלה שלאחר ההמרה. ניתוח התהליכים המובילים לאיזון המצב היציב דורש טכניקות מיוחדות ללכידת מינים של RNA מאוד קצר.

התיוג המטבולית של RNA עם נוקלאוטיד מקבילים כגון 4-thiouracil (4tU) או 4-תיורידין (4Tu) (לראות דאפי ואח '1 לקבלת סקירה מצוינת), מציע את היכולת לבודד את ה-rnas המתהווה מתויג ועיבוד intermediates. עם זאת, פרוטוקולים שפורסמו כוללים זמני תוויות של מספר דקות2,3, שהוא איטי יחסית לקצב הייצור של תעתיקים רבים. זה לוקח את הסדר של דקה אחת לתעתור את הגן שמרים הממוצע, כך שמרים התוויות RNA עבור פחות מדקה אחת יכול להיחשב קצר מאוד. הפרוטוקול המהיר והספציפי ביותר 4 תיואורציל (ers4tU) מגדיל את האות ליחס הרעש על ידי הגדלת 4tu התאגדות ולמזער את ההתאוששות של ללא תווית, RNA הקיימים מראש עושה פעמים מאוד קצר תוויות אפשרי4.

הבסיס thio שונה חייב להיות מיובא לתוך התאים במהירות בכמות מספקת כדי לתייג ביעילות את ה-RNA החדש מסונתז (nsRNA). כדי לקדם את זה, התאים גדלים במדיום uracil, וביטוי של חדירות המתאים מסייע להגביר את ספיגת 4tU או 4Tu (לראות את שולחן 1 עבור רשימה של פלמידים הנושאים הגנים חדירות מתאים ואיור המשלים 1). מסיסות 4tU's ב הידרוקסיד הנתרן מונעת את הצורך ממיסים אורגניים רעילים הנדרשים על ידי נוקלאוטיד אחרים מקבילים. למרבה הצער, גידול תרבויות לתקופות ארוכות עם thio שונה נוקלאוטידים בריכוזים גדול יותר מ-50 μM נצפתה לשבש את הריבוזומים5. עם זאת, את הריכוז (10 μM) משמש כאן, ואת פעמים התוויות קצר מאוד, למזער את ההשפעות למחיקה5 (איור 1a), ואילו עדיין מניב RNA מספיק לניתוח.

טכניקה זו יכולה להיות משולבת עם הדילול מהירה וספציפית מתווך של חלבון היעד6,7 (איור 2), המכונה "β-est סיוע 4u" פרוטוקול, שבו β-estradiol מוסדר ביטוי של האוקאין inducible degron (סיוע) מערכת משולב עם התוויות 4tU. עם β-est סיוע 4U הגישה, חלבון היעד יכול להיות מרוקן את ההשפעה על מטבוליזם של RNA במעקב צמוד (איור 2). העיתוי הוא קריטי; רצוי לצפות בסרטון הנלווה ולשים לב לאיור 2 ולצורתו המונפשת (ראו איור משלים 2).

עיבוד והשפלה של RNA חייב להיעצר במהירות רבה לפתרון זמן מדויק. זה מושגת באמצעות מתנול בטמפרטורה נמוכה, אשר מתקן את תוכן התא במהירות רבה ומבזה את קרום התא תוך שמירה על התוכן חומצות גרעין8. החילוץ RNA צריך להיות יעיל ולא לפגוע RNA. הפירוק המכני יעיל בהעדר סוכני chaotropic (לעתים קרובות אלה מכילים קבוצות thio, כך יש להימנע). ליתיום כלוריד משקעים של RNA הוא המועדף, כמו tRNAs הם פחות מזירז ביעילות. tRNAs מועתק במהירות, באופן טבעי מאוד9, ולכן הסרת trnas מפחית את התחרות עבור מגיב biotinylation. אם RNAs קטנים ומובנים מאוד, מומלץ לעשות שיטות משקעים מבוססות-RNA לאלכוהול.

כדי לשחזר את RNA thiolated, ביוטין מצורף באמצעות קבוצות thio שולבו RNA עם 4tu. השימוש בביוטין שונה, המתחבר באמצעות בונד דיגופרתי (למשל, HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 השני-(2 זה-pyridyldithio)propionamide,) או MTS-biotin (מתאן thioate)) מומלץ כפי שהיא מאפשרת שחרור של ה-RNA בתוספת של סוכן מפחית. רנ א biotinylated הוא אהדה מטוהרים על streptavidin מצמידים לחרוזים מגנטיים. פרוטוקול זה דומה לאחרים המפורטים בעבר10 אבל כבר ממוטב באופן אינטנסיבי כדי להפחית את הרקע.

ישנם שני סוגים של ניסוי thiol-התוויות שניתן לבצע, רציפה ולא רציפה תוויות. לכל אחד יש יתרונות משלו. בתוויות רצופות, 4tU מתווסף לתרבות ולדגימות שצולמו במרווחי זמן קבועים. סוג זה של ניסוי מראה כיצד RNA מעובד וכיצד רמות משתנות לאורך זמן. הדוגמאות כוללות השוואה בין המוטציות לבין ניסויים פראיים וניסוי מרדף דופק. הניסויים המוצגים באיור 3b, c הם מסוג זה. עבור תוויות בלתי רציפה שינוי מושרה למערכת ו-RNA מנוטרים. לאחר שנוצר השינוי, יש לפצל את התרבות לכמה תתי-תרבויות, ובזמנים מסוימים, כל אחד מהם מתויג לתקופה קצרה. אחת הדוגמאות היא β הסיוע 4U המוצג באיור 27. סוג זה של ניסוי שימושי במיוחד עבור ניטור ההשפעה של שינוי מטבולית על עיבוד RNA (ראה איור 3d).

ייצוג גרפי של ניסוי thio-התוויות מוצג באיור 4 ובאיור 5, וגיליון אלקטרוני המפשט מאוד את ביצועי הפרוטוקול זמין (ראה 4tu הניסוי תבנית. xlsx). בנוסף לכך, המידע המשלים מכיל מדריך מקיף לפתרון בעיות. עבור פרוטוקול 4U β-est המשלב תיוג 4U עם הכלי העזר בפרוטוקול המחסור, ראה איור 2 ומשלים איור 2. ר' ברז ואח '7 עבור פרוטוקול מחסור בסיוע מפורט.

Protocol

1. צמיחה ו-thio-התוויות

הערה: הזמן להשלמת קטע זה של הפרוטוקול הוא משתנה מאוד, בהתאם לקצב צמיחת התאים. אפשר 1 h כדי להכין את הפתרונות והציוד לפני thio-התוויות ו -30 דקות לאחר התיוג כדי לעבד דגימות.

  1. ודא את המתח S. cerevisiae ס מכיל הקידוד הפלסאז (שולחן 1) כדי להגביר את הייבוא 4tu לתוך התא.
    הערה: ללא יבואן, התוויות עבור פחות מ-2 דקות לא סביר להצליח11 (ראה איור משלים 1). 4tU שילוב יעיל יותר אם הצמיחה היא בינונית ללא uracil, כך המתח חייב להיות URA3+; כמה מהפלמידים שבטבלה 1 נושאים URA3 כסמן. אם פרוטוקול זה הוא להיות משולב עם מחסור β-est הסיוע7, שינויים מאמץ נוסף נדרשים.
  2. להכין את YMM uracil-מדיום חינם על-ידי הוספת 6.9 g של בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם של גלוקוז, ו 1.92 g של SCSM בודד החוצה-out (טבלת חומרים) ל 1 L של מים. אוטוקלב או מסנן לעקר את מדיום הצמיחה לפני השימוש.
    הערה: מסנן עיקור מעדיף כמו פפטיד/סוכר מתחמי המיוצר על ידי אוטוקלינג שיתוף מזרז עם התאים במתנול בשימוש באוסף לדוגמה.
  3. לגדל שמרים ב-YMM uracil-בינונית חינם לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600) של 0.6-0.8. ודא שהתרבות היא בצמיחה של שלב הרישום והיא הייתה לפחות שני טווח. גידול ב -30 ° c מומלץ בדרך כלל, אבל בטמפרטורות אחרות ניתן להשתמש, למשל, עבור זנים רגישים לטמפרטורה.
    הערה: בהתאם למתח, תנאי צמיחה ו-RNA תשואה, כ 30 מ"ל נפח לדוגמה יהיה צורך. סכום זה ייחשב לאורך כל הפרוטוקול. 30 מ ל של התרבות היא הטובה ביותר שתתאים שפופרת צנטריפוגה 50 mL עם 20 מ ל של מתנול, כך הוא נפח נוח להתחיל אופטימיזציה. שקול להשתמש בנפח לדוגמה יותר עבור נקודות זמן מוקדם כדי להגדיל את שחזור RNA, עד 2000 mL כבר שימש לתאים הגדלים לאט יותר בזמני תוויות קצרים באמת (< 1 דקות).
  4. להירגע על 50 mL של H2O על הקרח. עבור כל דוגמה, להוסיף 200 μL של חרוזי זירקונים לצינור בורג 2 מ"ל ולצנן על קרח. כמו כן לשים 20 מ ל של מתנול (זהירות), לתוך צינורות צנטריפוגה 50 mL, ומניחים על קרח יבש (זהירות). המתנול צריך להיות 1/3 עד 2/3 נפח המדגם.
    התראה: מתנול הוא רעיל על ידי אינהלציה, מגע וצריכה. מחלק נפחים גדולים בתוך מכסה המנוע, ולובשים שני זוגות כפפות, כפי שמתנול יכולים לחדור לכפפות מעבדה ניטריל. מתנול הוא דליק מאוד, להתרחק מכל מקורות ההצתה.
    הערה: כמו קרח יבש יכול לגרום כוויות קרות על קשר ומייצרת גז asphixiant, להשתמש בכפפות בעת טיפול ולהשתמש בחלל מאוורר היטב.
    הערה: הוספת החרוזים בנקודה זו היא קלה יותר מאשר לאחר המדגם התווסף כמו הצינור יבש וכאשר מסתובבים במורד הגלולה תא החרוזים הם גם הסתובב ברור של חוט הצינור חוסך זמן. בנוסף, הדבר מאפשר לחרוזים להתקרר לפני הוספת המדגם.
  5. אם ספייק S. ביקוע הוא להתווסף לתרבות (ולא במועד מאוחר יותר), הפשרת מעלה של התאים האלה של תאי . פומבה על קרח ומערבולת ביסודיות, לפחות 30 s, ולאחר מכן להוסיף לתרבות. אם הוכנו על פי ההוראות להלן, אחד S. ביקוע סדרת מחלקים מספיק עבור 400 mL של התרבות (מספיק עבור 12 30 הדגימות ml פלוס קצת כדי לאפשר שגיאות בטיפול). אם נעשה שימוש ביותר או פחות בתרבות, התאימו את עוצמת ה-S. ביקוע לתרבות.
    1. לגדול 1 L of S. פומבה תרבות כדי OD600 כדי 0.8 בדיוק כפי שמתואר בפרוטוקול עבור S. cerevisiae ס.
    2. Thio-תווית כצעד 1.7, אבל עבור 10 דקות.
    3. תקן את כל התרבות באמצעות 400 mL של מתנול על קרח יבש, ביסודו של דבר כפי שמתואר בשלב 1.9.
    4. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 3000 x g עבור 3 דקות.
    5. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב3.3 mL של H2O.
    6. התפצלו לתוך שהציטוטים של 80 μL כל אחד. חנות ב-80 ° c.
    7. השתמש בכל אחד ליטר עבור התרבות 400 mL או 10 μL לדוגמה 30 mL.
      הערה: הפחת את נפח הדקר ל- 1/10 אם הביצועים מבצעים. אל תעשה שימוש חוזר בציטוטים; למחוק כל יתד שאינו בשימוש. ספייק זה שימושי לנרמל ולהשוות תוצאות על פני נקודות זמן וניסויים.
  6. לתיוג בלתי רציף, יש לזרז את הטיפול בחילוף החומרים הנדרש (למשל, תנאי גדילה, השראה גנטית או דלדול כגון הסיוע β-est7 (איור 2 ומשלים איור 2), ואז לפצל את התרבות. להבטיח כל מבחנות ומדיה נמצאים בטמפרטורה הנדרשת, אם אפשר, לאוורר את המדיום לפני הוספת התרבות.
  7. להוסיף 4tU אל התרבות ריכוז של 10 μmM ו לערבב במרץ (1/10,000 של נפח התרבות של 100 מ"מ 4tu הומס 1 M naoh). תיול-תווית עבור 15 עד 5 דקות.
    הערה: שלושים שניות היא נקודת התחלה טובה. Thio-התוויות עבור פחות מ -20 s נותן תוצאות משתנה יותר בשל קשיים לתמרן את התרבות תחת לחץ זמן. עם זאת, התוויות עבור יותר מ-1 דקות מפחיתה את הרזולוציה הטמפורלית של הטכניקה.
  8. אם יש לבצע ניסוי מרדף; אפשר thio-התוויות עבור 20 על 30 לאחר מכן מרדף על ידי הוספת 1/200 תרבות נפח של 1 M uridine (לא thiolated), לריכוז הסופי של 5 מ"מ.
    הערה: uridine עדיפה אורציל עבור המרדף, כפי uridine הוא מסיס מים יותר המאפשר נפח קטן יותר להתווסף לתרבות ולכן יש פחות הפרעה לצמיחת התאים.
  9. קחו דגימות של תרבות במרווחי זמן קבועים (לפחות 15 s), עד סוף קורס הזמן. מרווחי דגימה קצרים יותר מאשר זה קשה לבצע באופן אמין. הוסיפו את הדגימה למתנול על הקרח היבש שהוכן בשלב 1.4. לנוחות, להוסיף 30 מ ל של התרבות לצינור 50 mL המכיל 20 מ ל של מתנול.
    הערה: פחמן דו-חמצני נמס במתנול כאשר קר; זה יוצא הפתרון על תוספת של המדגם ומפואמים במרץ על ערבוב – וכתוצאה מכך אובדן לדוגמה. כדי למנוע זאת, לצנן את מתנול כדי <-70 ° c בצינור אטום היטב עד קרוב לזמן הדרוש, ואז להעביר לקרח יבש.
  10. לאטום את הצינור ולערבב ביסודיות על ידי טלטול. . הניחו את הדגימות על הקרח בדוק שאף אחד מדגימות לא קפא; אם כן, חם בעדינות ביד, משתנה ללא הרף. זה הטוב ביותר נעשה ביד כמו טמפרטורה של המדגם ניתן להעריך, זה צריך תמיד להרגיש קר. . מקום על הקרח זוהי אינה נקודת הפסקה; כאשר כל המדגם הוא נוזל להמשיך לשלב הבא.
  11. ספין ב 3000 x g עבור 2 דקות (ב 4 ° צ' אם אפשרי) כדי לצנפה את התאים. יוצקים את הנוזל ומשבים את הגלולה לפחות 1 מ ל של מים קרים-על-ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה.
    הערה: השאריות מתנול בגלולה לדוגמא מסייעת להשעיה מחדש.
  12. העברה 2 מ ל צינורות כובע בורג כמוכן בשלב 1.4. ספין בקצרה (למשל, 10 הזמן הכולל) ב > 13000 x g כדי מחדש הגלולה התאים, המקום חזרה על הקרח ולהסיר נוזל.
    הערה: ניתן לאחסן את הגלולה הסלולרית ב-70 עד 80 ° c במשך מספר חודשים.

2. הכנת ה-RNA הכולל

הערה: הזמן להשלמת הוא 90 דקות.

  1. השתמש דיאתיל פירוקרבונט (depc)-פתרונות מטופלים כדי להגן על RNA מפני השפלה. מחלקים את הפתרונות בעזרת מסנני פיפטה ולובשים כפפות כל הזמן.
    1. לפתרון להוסיף 1/1000 נפח של depc ולערבב על ידי טלטול נמרץ.
    2. לעזוב בטמפרטורת החדר (RT) עבור 24 h, ולאחר מכן החיטוי.
    3. פתרונות עם קבוצות של אמין (כגון טריס) לא יכולים להיות מטופלים DEPC. מחלקים את אבקת ולאחסן במיוחד עבור העבודה RNA. השתמש בעבר DEPC התייחס H2O כדי להפוך את הפתרון.
      הערה: כמו הקבוצה thio-על ה-RNA הוא פוטוטייטאייבל, למזער את החשיפה לאור UV מנקודה זו והלאה. האחסון צריך להיות בחשיכה והדגירה הטובה ביותר נעשה במכונת ה-PCR עם מכסה.
  2. אם יש להוסיף יתד S. ביקוע לגלולה הסלולרית ולא לתרבות (לא לעשות את שניהם), הוסיפו אותה כעת. הפשרת מעטה של התאים האלה להתאים את הקרח מערבולת ביסודיות, לפחות 30 S, לפני הוספת הגלולה.
    הערה: אם הוכנו בהתאם לשלבים 1.5.1-1.5.7, 10 μl של S. ביקוע סדרת מחלקים נדרש עבור גלולה אחת נגזר 30 מ ל של התרבות.
  3. לפני לשים על כובע, ספין לזמן קצר מאוד עבור 1-2 כדי להבטיח כי אין חרוזים זירקונים לכודים בין הכובע ואת הצינור, אשר יכול לגרום למדגם ו פנול לדלוף מהצינור.
  4. השהה מחדש את התאים ב-400 μL של מאגר EDTA אצטט (AE) (50 mM אצטט נתרן pH 5.3, 10 mM EDTA pH 8.0), על ידי vortexing במרץ. הוסף 40 μL של 10% (w/v) נתרן dodecyl סולפט (SDS). לא מערבולת, כמו SDS יהיה קצף.
  5. אם הפרוטוקול 4U β-est יש להשתמש, לקחת 40 μL של השעיית התא עבור ניתוח חלבון7. הוסף 40 μL של AE כדי להפוך את עוצמת הקול לגיבוי 400 μL.
  6. הוסף 800 μL של פנול (זהירות) ב-pH נמוך ומערבולת עבור 10 s.
    התראה: פנול הוא רעיל ומלא מאכל באמצעות אינהלציה ומגע. תמיד לבצע הליכים הכרוכים פנול בתוך מכסה וללבוש שני זוגות של כפפות.
  7. לאחר מכן התאים בתוך הומוגניצר (למשל, טבלת חומרים) לשלוש התפרצויות 2 דקות במסגרת הכוח הנמוכה ביותר. השאירו את הדגימות על הקרח במשך 2 דקות בין פולסים של הומוגון.
    הערה: מטב את התנאים אם משתמשים בהומוזים אחרים. טלטול מספיק יגרום לתשואות עניות, בעוד שהטלטול מוגזם נובע מתשואה גבוהה לכאורה, כפי שנקבע על-ידי ספיגת ב260 nm (A260), אך ה-RNA עלול להיות מפורק. הומוגניצר הוא המועדף, אבל חם פנול RNA טיהור12 ניתן להשתמש.
  8. מניחים את המדגם lysed על קרח יבש עבור 5 דקות, עד שהוא מתגבש, זה מפחית את ה-DNA גנומית לשאת על לתוך RNA. אל תקפא במשך זמן רב מדי כאשר המדגם לא יהפשיר. ספין 5 דקות ב microfuge ב > 13000 x g ב RT; אין להתפתות לעשות זאת ב -4 ° c, מאחר שערבוב המדגם/פנול יישאר מלא לאורך כל הסיבוב אם יבוצע בטמפרטורה נמוכה.
    הערה: אם המדגם עדיין קפוא בסוף הספין, הסתובב מחדש למשך 5 דקות נוספות עד שהדוגמה הופרה לחלוטין.
  9. פנול/כלורופורם תמצית לאחר מכן לחלץ כלורופורם עם נפח שווה (כ 600 μL) של פנול: כלורופורם 5:1 ולאחר מכן כלורופורם (זהירות). העבר את השלב העליון לצינורית אחרת המכילה פנול: כלורופורם 5:1 או כלורופורם. מערבולת, ואז ספין עבור 5 דקות בmicrofuge ב RT. ואז להעביר את השלב העליון לצינור חדש 1.5 mL.
    התראה: כלורופורם רעיל באמצעות אינהלציה ומגע. תמיד לבצע הליכים הכרוכים כלורופורם בתוך מכסה המנוע וללבוש שני זוגות של כפפות.
  10. הוסף שליש לחצי נפח (כ 300 μL) של 10 מטרים ליטר, ולערבב כדי לזרז את ה-RNA. המדגם צריך להיות מעונן מיד, אבל להשאיר 10 דקות לפחות על הקרח או ב 4 ° צ' (לא לאחסן למטה-20 ° c כפי שהוא יקפא), או עד הזרז לאתר.
  11. ספין עבור 5 דקות ב > 13000 x g בmicrofuge. להסיר את הנוזל, בקצרה להסתחרר מחדש ולהסיר את החלאות. לשטוף את הגלולה עם 300-500 μL של 70% אתנול, להסתובב בקצרה ולהסיר אתנול הנותרים.
    הערה: במהלך שוטף אלה לשמור את הגלולה באותו צד של הצינור כמו ספין הראשון, בדרך זו הגלולה לא יזוז ולשבור; אם הוא שובר חלק RNA יכול להיות איבד בטעות.
    הערה: אל תייבש את הגלולה; כל עוד מרבית הנוזלים הוסרו, הוא לא יפריע לצעדים הבאים. ה-RNA יכול גם להיות מאוחסן בשלב זה ב-20 ° c במשך כמה חודשים או-70 ל-80 ° c לאחסון לטווח ארוך.
  12. לפזר מחדש את הגלולה RNA ב-90 μL של TE pH 7.0 (10 מ"מ הHCl של מילימטר ב7.0, 1 mM EDTA pH 8.0) על ידי חימום ב 65 ° c עם טלטול כמו גלולה RNA יכול להיות קשה להמיס מחדש. זה חייב להיות במשך לא יותר מ 5 דקות כמו RNA משמינים בטמפרטורות גבוהות יותר. בדוק את פתרונות ה-RNA המלאים ולאחר מכן העבר לצינור 0.2 mL. מצנט את המדגם למעלה ולמטה; לא צריך להיות "גושים", והנוזל צריך לעלות וליפול בצורה חלקה בקצה. הפתרון הזה הוא צמיגי אז התנועה. הסופית צריכה להיות איטית
    הערה: ה-RNA יכול להיות מאוחסן ב-20 ° c בחשכה בשלב זה; זה יכול גם להועיל מסיסות RNA.

3. ביוטילציה

הערה: הזמן להשלמת הוא 60 דקות. השלבים הבאים נעשים בנוחות ברצועה של צינורות עם כובעים אינטגרלי כפי שיש להם פחות נטייה לפתוח על vortexing מאשר רצועות עם כובעים נפרדים.

  1. Biotinylate אוחר על ידי הוספת 10 μL (1/10 כמות סופית) של פתרון 5 מ"מ hpdp-biotin (MTS-biotin ניתן להשתמש בדיוק באותו אופן כמו hpdp-BIOTIN), RNA ו לערבב ביסודיות. מחממים את ה-RNA למשך לא יותר מכמה שניות ב-65 ° c לפני הוספת הביוטין. מודקון ב 65 ° c עבור 15 דקות עד מקסימום של 30 דקות בחושך.
    הערה: חימום זה נדרש כמו כמה אצוות HPDP מזרז ב-RT במדגם RNA. בלוק PCR עם מכסה מחומם. הוא אידיאלי בשביל זה
  2. הכנת נפח שרף קטן, עמודה הדרה בגודל (טבלה של חומרים) כדי להוציא את הביוטין בלתי משולב. הסר את התגית התחתונה של העמודה ושחרר את המכסה, המקום בשפופרת צנטריפוגה של 2 מ ל. ספין ב 1500 x g עבור 1 דקות כדי לרוקן את המאגר להוסיף 0.3 ML של TE בעדינות לחלק העליון של הטור ולסובב שוב. חזור על הכביסה ולסובב פעמיים יותר עבור סך של 3 שוטף. לבסוף להעביר את הטור שטף לצינור חדש 1.5 mL.
  3. ברגע שהדגירה הדגימה (שלב 3.1) תושלם, הוסף את המדגם לראש הטור. ספין ב 1500 x g עבור 2 דקות. דגימת ה-RNA הביוטיבמית נמצאת כעת בתחתית הצינורית.
    הערה: מהדורה של 1 דקות אינה מספיקה כדי למלא את המדגם כולו.
  4. הוסף שליש למחצית אמצעי האחסון (כ 40 μL) של 10 מ ' LiCl, לערבב מחדש את ה-RNA כצעד 2.10. המדגם צריך להיות מעונן מיד, אבל לנסוע לפחות 5 דקות על הקרח או ב-4 ° צ' או עד המהירות מבטאת; לא לאחסן למטה-20 ° צ' כפי שהוא יקפא. צנטריפוגה את המדגם עבור 5 דקות ב > 13000 x g ב microfuge.
  5. לשטוף עם 80% אתנול, ≤ 1 h מסתובבת. בצע את ההליך בשלב 2.11 כדי להסיר את הנוזל ככל האפשר.
    הערה: כ-HPDP-biotin מסיס מאוד ב-80% אתנול, זהו צעד טיהור נוסף.
  6. חזור על 80% אתנול לשטוף כדי להסיר ביוטין בלתי משולב הרבה ככל האפשר.
    הערה: ה-RNA יכול גם להיות מאוחסן בשלב זה ב-20 ° c בחשכה.

4. טיהור של רנ א מסונתז החדש

הערה: הזמן להשלמת הוא 2 h.

  1. לפזר מחדש את ה-RNA ב 200 μL של DEPC מטופלים H2O (הדגירה 65 ° c יכול לשמש, בדומה להליך בשלב 2.12).
  2. למדוד את הריכוז RNA ב A260 באמצעות ספקטרוסקופיה; המדגם יכול להיות מדולל 1/10 כדי לקבל אותו בתוך טווח ליניארי של ספקטרוסקופיה. מערבולת זה דילול לפחות 10 s כדי להבטיח RNA צמיגה היא התפרקה באופן שווה.
    הערה: ניתן להעריך את היעילות של הביוטילציה באמצעות נקודה בעלת כתמי היתר13 אם יש צורך בכך.
  3. הוסף כמויות שוות של RNA לצינור טרי ולעשות עד 200 μL ב-DEPC שטופלו H2O. השתמש בכל המדגם עם ריכוז RNA הנמוך ביותר ולהשתמש בנפח המתאים של דגימות אחרות יש כמות דומה של RNA עבור כל.
    הערה: הגיליון האלקטרוני 4Tu ניסוי תבנית. xlsx כולל טופס לסיוע בחישוב זה.
  4. כאשר המדגם הוא ב RT, להוסיף 25 μL של 10 x NaTM מאגר (0.1 M טריס HCl pH 7.0, 2 M הנאל, 250 מ"מ MgCl2), 25 μl של 1 m Napi pH 6.8 (0.5 m נה2פו4 0.5 m Na2hpo4) , ו-2.5 μL של 10% SDS. מערבבים ביסודיות ומסתובבים בעדינות (< 30 s; כ 100 x g).
    הערה: כדי למנוע משקעים של ה-SDS ומלחים, יש לשמור את הדגימות ב-RT במהלך ההליכים הבאים עד שלב 4.13.
  5. להפוך את מאגר חרוז המכיל 1 x NaTM מאגר, 0.1 M NaPi, ו 0.1% SDS, 2 מ ל לכל מדגם. הוסף את הסכום הנדרש של H2O הראשון ו-sds אחרון. זה חייב להיות טרי בכל פעם כמו מזרז טפסים לאחר 24 שעות.
    הערה: כדי למנוע את היווצרות הזרז, יש לשמור על מאגר החרוזים ב-RT במהלך ההליכים הבאים. אין לטפל DEPC או החיטוי.
  6. הוסף 50 μL של חרוזי streptavidin לשמירה נמוכה 1.5 mL שפופרת. הניחו את השפופרת על המדף המגנטי, המתינו לחרוזים להתיישב ולאחר מכן הסירו את הנוזל
  7. . שטוף את החרוזים הstreptavidin
    1. הוסף 200 μL של מאגר חרוזים ומערבולת עד הגלולה חרוז הוא מושעה לחלוטין. בדרך כלל 3 עד 5 s הוא כל מה שנדרש. עבור שוטף לפני לדוגמה RNA מתווסף זה מספיק כדי להפוך את הצינורות סביב כך החרוזים לנסוע ברחבי הצינור לצד השני. ואז להפוך את הצינורות בחזרה לצד המקורי כך החרוזים לנסוע על פני הצינור שוב.
    2. ספין הצינור במהירות נמוכה (כ 100 x g) עבור מקסימום של 5 s כדי לסובב את הנוזל, אבל לא את החרוזים.
    3. מקום במדף המגנטי כדי לאפשר את החרוזים להילכד על ידי המגנט.
    4. להסיר את הנוזל על ידי השאיפה עבור מספר קטן של דגימות; יוצקים את הנוזל אם הרבה דגימות.
      הערה: עם מספר רב של דגימות, הסרת כל נוזל גרידא על ידי השאיפה יכול להיות בעייתי, כמו החרוזים במדגם הראשון עשוי להתייבש לפני המדגם האחרון הוא סיים, זה מגביר את הרקע. הכביסה יכולה להיות מואצת על ידי שפיכת הנוזל מכל הדגימות בבת אחת בעוד על המגנט. הם צריכים להיות קצת יותר זמן על המגנט לפני לשפוך את כמות קטנה של נוזל שנשאר צריך להיות מנושמות אבל, הכולל, זה אומר פחות זמן על המגנט וללא נוזל. בדרך זו, ניתן לעשות 24 או יותר עקירות במהירות.
  8. בלוק עם 200 μL מאגר חרוז, 10 μL 20 מ"ג/mL הגליקוגן, ו 2.5 μL 5 מ"ג/mL tRNA, 20 דקות מסתובבת בסוף במהירות מתונה ב RT. הסיבוב הוא לשמור את החרוזים בהשעיה. לאחר חסימת החסימה להסיר את הנוזל כמו צעדים 4.7.2-4.7.4 ולשטוף שוב, כמו השלבים בסעיף 4.7.
  9. השהה מחדש את החרוזים במדגם. דגירה ב RT עם סיבוב עבור 30 דקות.
  10. במהלך הדגירה, להכין שפופרת טריים 1.5 mL עבור כל מדגם. הוסף נפח 1/10 (כ 10 μl) של 3 M נתרן אצטט pH 5.3 ו 20 μg של הגליקוגן, ו ספין ב כ 100 x g עבור 3 s. Store בארון תקשורת עד הצורך.
  11. הסר את ה-RNA הלא מאוגד מהחרוזים, כצעדים 4.7.2-4.7.4. RNA לא מאוגד יכול להיות מנותק בצינור טרי, אבל המלחים SDS להקשות מאוד לטהר. ואז לשטוף את החרוזים, כמו סעיף 4.7 עם vortexing, עבור מינימום של 3 עד מקסימום 5 פעמים.
  12. לאחר השטיפה האחרונה לנקוט טיפול מיוחד לטפי את כל הנוזל; חזור לכל צינור ומלא את הפסולת של המאגר פעם נוספת.
  13. כדי להוסיף את ה-RNA, הוסף 50 μL של טרי מוכן 0.7 M β-mercaptoethanol (βME) לחרוזים (1/20 דילול של פתרון מניות סיפק מסחרית). מערבולת ולהסתובב בקצרה, כמו צעדים 4.7.1 ו 4.7.2. מניחים את הבאבל בארון המגנטי ופיפטה את ה-RNA המכיל פתרון לתוך צינור הצנטריפוגה 1.5 mL שהוכן בשלב 4.10.
  14. Elute פעם נוספת כמו שלב 4.13 כדי לשחזר RNA שיורית מן החרוזים ולהוסיף את המדגם לנקז את הצינור המכיל את הימנעות הראשון מחרוזים אלה.
  15. הסר חרוזים שיורית מן ה-RNA השדרתי על-ידי הצבת הדגימה חזרה בארון המגנטי והעברת הנוזל לשפופרת צנטריפוגה טרייה ומחייבת 0.5 mL.
  16. לערבב את המדגם ולאחר מכן מזרז את nsRNA על ידי הוספת 2.5 x אמצעי אחסון (280 μL) של אתנול ולערבב פעם נוספת. השאירו המשך 1 h עד הלילה ב-20 ° c. ספין בצנטריפוגה טרום מקורר (4 ° c) עבור 20 דקות במהירות המירבית (לפחות 13,000 x g).
  17. שטוף ביסודיות עם 200 μL של 70% אתנול ב-20 ° c. כמו βME שיורית יהיה לעכב את יישומים במורד הזרם, להסתובב בכל שלב כדי להסיר כמה שיותר חלאות ככל האפשר; בסוף המדגם לא צריך להריח של βME.
  18. התמוססות מחדש ב 10 עד 20 μL של DEPC מטופלים 1x TE עם המקבילה של 0.005 μL RNase מעכב.
    הערה: כל השלבים הבאים יש לבצע על קרח.
  19. למדוד את ריכוז RNA וטוהר.
    1. מדוד את A260 ו-a225 ב כמות מדגם נמוך ספקטרוסקופיה.
      הערה: ספיגה מקסימלית בקרבת λ = 225 ננומטר היא מזיהום בלתי נמנע מן החרוזים. בהעדר RNA האות מפני הזיהום מסרב ל 35% ב λ = 260 ננומטר. לכן, כמות בפועל של RNA מתקרבת על ידי הנוסחה: (A260-(a225* 0.35)) * 40 ng/μl.
    2. לחילופין, לנתח את המדגם על מערכת אלקטרופורזה מיקרו-פלואידיקה כגון bioanalyzer.
      הערה: ניתוח זה עדיף להשתמש ספקטרוסקופיה כמו שלמות RNA ניתן להעריך, הזיהום אינו מפריע לכמת ופחות מדגם נדרש.
  20. . לנתח את הנסרנ
    הערה: לדוגמה, ניתן לכמת את RNAs ספציפיים באמצעות שיטות qPCR הפוכה סטנדרטיות. RNA שהוכן בדרך זו תואם להכנה של הספרייה ל-RNA-seq. הסרת rRNA אינה נחוצה לעתים בתוויות של פחות מ-5 דקות . ביטול הפעולה של הפקודה ' כיצד לבצע ' ב-rna זה.

Representative Results

תשואה אופיינית עבור nsRNA התאושש באמצעות פרוטוקול ers4tU זה מוצגים באיור 1b, זה כבר הופק על ידי bioanalyzer ומעקב מראה התשואה של RNA לעומת גודל (נוקלאוטידים [nt]). הערה, הן במעקב bioanalyzer ואת הגרף הכניסה, כי התאוששות RNA מנקודת זמן 0 הוא חלק קטן מאוד מאשר התאושש מנקודות זמן ארוכות יותר-כ 0.3 μg של RNA התאושש כ 109 תאים לעומת יותר פי שניים לאחר רק 30 s של תוויות (0.8 μg של nsRNA) ממספר זהה של תאים. התאוששות RNA ב 15 s הוא משתנה יותר כמו הבדלים קטנים בביצוע הדגימה יש השפעה גדולה יחסית על התאוששות RNA. ב-bioanalyzer מעקב, rRNA מראש ניתן לראות כשיא ליד 1000 nt ו בספק של פסגות בשנת 1700-1800 nt. השפע של הintermediates האלה גדל כמו המשיכה.

תיוו-תוויות שימשו לכמת שחבור של התמליל ACT1 (איור 3). Thiolation התבצע ודגימות שנלקחו במרווחי 15 s מתחילתו של thio-התוויות ועיבוד של ACT1 RNA במעקב (איור 3a, b). כפי שניתן לראות, pre-mRNA נוצר (על ידי תמלול), ו לאריטים (על ידי הצעד הראשון של החדרת pre-mRNA), גם לאחר רק 15 s של תיוג. לאחר כ 45 s עד 1 דקות, כמויות של לאריטס ו-mRNA להגיע לשיווי משקל עם הרבה מינים אלה RNA שנוצר על ידי שעתוק כמו מעובד משם על ידי שחבור.

כדי להפיק את הנתונים המוצגים באיור 3 ג המתח היה פעמו עם 4tu עבור 25 s ולאחר מכן רדפו עם uridine. הדור של טרום mRNA ולאריטס מגיע למקסימום בדקה אחת. זה משתווה היטב עם איור 3b; מקסימום להיות מושגת לאחר 45 s להגיע לשיווי משקל בתוספת 25 s של התוויות. לאחר השיא, הירידה ברמות כאשר RNAs המסומנת מתויג הם רדפו בתהליך החדרת.

איור 3d מראה דלדול של גורם החדרת חלבון והשפעתו על מטבוליזם RNA, באמצעות מערכת הסיוע β-est 4u6,7. כאן, Prp16p מופחת מרמות פיזיולוגיות הסמוך ל 5% ברמה זו לאחר 25 דקות של דלדול. Prp16p הוא גורם החדרת מהותי לשלב השני של החדרת15. לאריטס יוסרו במהלך השלב השני של שחבור (איור 3a), אבל כאן הם מגבירים מעל רמה של Pre-Mrna כמו Prp16 הופך הגבלת. במועד מאוחר יותר דלדול פעמים, גורמים אחרים הופכים הגבלה בשל השפעות משניות, כך רמות של לאריב ירידה, ו-mRNA רמות עלייה. רמת הסדר של מחלקת משולבים.

Figure 1
איור 1: צמיחה ב-4tU ו-RNA התאוששות. (a) 4-thiouracil משפיע על הצמיחה. הגדלת הריכוז של 4tu in מדיום הירידה ymm הצמיחה ללא אורציל מגביר את זמן ההכפלה של S. cerevisiae ס (BY4741) נושאת את p4FuiΔPEST פלמיד. צמיחה של ארבע תרבויות שכפול היה תחת פיקוח 30 ° צ' ב Tecan אינסוף Pro 200. כל התרבויות היו בשלב היומן ברחבי, עם OD600 בין 0.1 ו 0.6. ללעוג היא תרבות שליטה עם כמות שוות ערך של NaOH הוסיף, אשר לא על ידי עצמו לשנות את קצב הצמיחה. גרף זה מדגים כי התוויות הוא פשרה בין תוויות מהירות ונזק לתא. קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של 4 שכפול. (ב) התפוקה של המאה ה-rna מגדילה ליניארי מ-15 שנות תוויות. הדמות העיקרית מראה את העקבות הביומנתח של מטוהרים, nsRNA מ -0 (לא thiolated) כדי 2 דקות לאחר התוספת של 4tU במרווחי זמן של 15. שים לב שדגימת 15 הs אינה מוצגת, מאחר שהיא לא היתה זהה למדגם שאינו מתויג. שתי הפסגות הגדולות מתאימות לריבוזומאלה RNAs (rRNAs). הסמנים הפרדיים והintermediates של rRNA גלויים כמספר פסגות במשקל מולקולרי גדול יותר מאשר Rrna בוגרת. ההתאוששות של אלה מintermediates ומגדיל עם הזמן. תוצאות מניסוי מייצג אחד מוצגות. גרף הכניסה מראה את ההתאוששות של nsRNA עם דגירה הגוברת עם 4tU. התשואה של nsRNA גדל עם הגדלת זמן הצמיחה עם 4tU. ההחלמה היא לינארית במידה ניכרת (R2 = 0.934) לאורך ציר הזמן של הניסוי הזה ומראה עלייה קלה על הרקע אפילו על התוויות 15 s עם 4tu גם אם לא להבדיל מן המדגם בלתי מתויג על ידי עין מן הביומנתח עקב. קווי שגיאה מציגים שגיאה סטנדרטית עבור שלושה משכפל ביולוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: β-Est 4U סיוע β-EST עזר הפרוטוקול הגרפי 4u. סיכום גרפי של הפרוטוקול של פרוטוקול 4U הβ ביותר לסיוע. β-estradiol (β-est) מקדם את הביטוי של המכשיר inducible degron (סיוע) מערכת אשר בתורו מרוקן את הסיוע * מתויג מטרה חלבון, מתייחסים ברז ואח '7 עבור פרוטוקול מפורט. במקרה זה, ביטוי מערכת degron הוא יזם 25 דקות לפני השפלה החלבון מתחיל ו-thiolation בכל נקודת זמן היא עבור 1 דקות. דגימות נלקחים לפני האינדוקציה כל 2 דקות במהלך דלדול. גירסה מונפשת מופיעה באיור המשלים 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: סמנים מוקדמים וintermediates של שחבור ACT1 RNA. שחבור של ACT1 Pre-mrna התעתיקים היה מפוקח על ידי שעתוק הפוכה כמותית PCR16. רמות של ACT1 קודמן (Pre-mrna), ביניים לאריב-exon2 (לאריב) מוצר משולבים (mrna) מוצגים מנורמל נגד רמת ACT1 exon2 ורמות המצב יציב של rnas אלה. (א) מיקום מוצרי qpcr בתעתיק ACT1. סכמטית של המיקומים של מוצרי qPCR המשמשים כדי לטפל ברמות של טרום סמנים, intermediates ומוצרים של התגובה החדרת של התעתיקים ACT1 16. Exons מיוצגים על ידי תיבות, אינטרון כמו קו ואת מוצרי qpcr כקווים עם יהלומים בכל קצה, הצבע תואם אלה המשמשים את הגרפים. הPCR pre-mRNA הוא ספציפי עבור pre-mRNA ולא כל intermediates של שחבור כמוצר זה חוצה את נקודת ההסתעפות אשר מופרת לאחר השלב הראשון של החדרת. לאריב ה-PCR יזהה את התוצר של השלב הראשון של החבור ושל האריאריוס המגורש שהופק לאחר השניה. המרכז לייצור מוצרים מיוחדים. תוצאות ה-PCR (הקיים בכל הסמנים, הintermediates והמוצרים, למעט הארילון) אינו מוצג בגרפים, משום שנעשה שימוש בכדי לנרמל את הנתונים ולכן הוא שווה תמיד ל -1. (ב) רצף שוטף. כמות pre-mRNA עולה עם הזמן כמו 4tU משולב על ידי תמלול, לאחר עיכוב קצר, החדרת ממיר אותו לתוך מוצרים ביניים משולבים exon2. רמות אלה pre-mRNA ו-לאריב מינים מזיהוי מעל הרקע לאחר כמה שפחות 15 s של צמיחה עם 4tU ולהגיע מקסימום לאחר כ 45 s של תיוג רציף עם 4tU, שבו הייצור שלהם מאוזנת על ידי המרה כדי משולבים mRNA ו/או השפלה. הערכים מנורמלות למצב הקבוע שלהם (הנקודה השמאלית ביותר של הגרף), ו-2 רמות להציג את המראה והעיבוד שלהם בהשוואה לתמלול של אקסון 2. כמו שחבור RNA של ACT1 הוא בעיקר co-transcript4,17 משולבים mrna במהירות הופך מינים שופע ביותר, הרמה שלה דומה לזה של אקסון 2. , שגיאה סטנדרטית של שלושה משכפל ביולוגי. כל אחד נכנס לטריפליאט (ג) דופק/צ'ייס. . דופק של 25 שניות ואחריו צ'ייס עם אורידיין לעומת רמות המצב היציב של RNAs אלה (שמאל ביותר הנקודה), הם בתחילה בשפע מאוד בבריכה החדשה מסונתז. רמות הירידה בהדרגה כאשר הם מעובדים ב-mRNA (או מושפל), רמות מתקרבות דומה מאוד רמות המצב יציב על ידי 5 דקות. שגיאה סטנדרטית של שלושה משכפל ביולוגי, כל אחד מגיע בטרילקאט. (ד) nsrna ומחסור בחלבון. שחבור של ACT1 Pre-mrna התעתיקים בפיקוח על ידי שעתוק הפוכה כמותית PCR כמו פאנל (א) על דלדול של חלבון Prp16 באמצעות המערכת degron מערכת כמתואר באיור 2. רמות החלבון Prp16 מוצגות גם בגרף המותוות כנגד ציר Y השני כאחוז של רמות לפני הדילול. Prp16 הוא מרכיב חיוני של הספאריאוחלק, חשוב במיוחד לשלב השני של החדרת הלוח (א), לאחר שלאריטים מושפל. כאשר צעד זה הופך להיות הגבלת לאריטס להצטבר בתחילה. בשלב מאוחר יותר נקודות החבור נכשלת לחלוטין, לאריטים אינם מיוצרים עוד ורמות pre-mRNA עלייה. קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית של שלושה משכפל ביולוגי, כל אחד ממנו בטרילקאט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: סיכום גרפי של מקטעי הפרוטוקול 1 עד 3. התאים הם thiolated עם 4tU ומותר לגדול כדי לשלב את נוקלאוטיד שונה לתוך RNA. ניתן להוסיף מיכל שחור של משחת שתיה כדי לאפשר נורמליזציה ברחבי נקודות זמן וניסויים. הדופק של 4tU יכול להיות נרדף באמצעות לא-thiolated uridine. ניתן לבצע את התיוג ברציפות מתוספת של 4tU או משינוי לתנאי הגדילה, התרבות ספליט ו-4tU הוסיף לתרבויות בתקופות הגדלות משינוי מצב הגדילה, אבל כל התוויות רק לזמן קצר. התאים נאספים, ו-RNA המוכנים מהתאים, רצוי להשתמש בשיטות הומוגניטוגרפיות והמבוססות על פנול. רנ א הוא biotinylated ולאחר מכן rna biotinylated מטוהרים מתוך ביוטין משולב באמצעות עמודה הדרה גודל. NsRNA הוא כעת מוכן לטיהור עם חרוזים streptavidin (סעיף 4, איור 5). מספרים באדום מקבילים למספרי השלבים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: סיכום גרפי של מקטע הפרוטוקול 4. בהמשך מסעיפים 1 עד 3 (איור 4), החרוזים הstreptavidin חסומים ומדגם ה-RNA הביוטיליס שנוסף לחרוזים המוכנים. רנ א biotinylated נקשר החרוזים הstreptavidin ו RNA בלתי biotinylated הוסר ושטף. רנ א biotinylated הוא חומק מן החרוזים באמצעות βME וזירז מוכן למחקר נוסף. מספרים באדום מקבילים למספרי השלבים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: שיפור של התאוששות nsRNA מתאי שמרים עם וללא עותקים נוספים של היבואן בשעה 1 ו 3 דקות של התוויות thio-. שים לב כי Fui1 הוא היזם העצמי של שמרים מתבטאת 2 יקרומטר פלמיד. העותק גנומית של הגן הזה קיים בשני זנים אלה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: גרסה מונפשת של β-Est 4U סיוע β-est הפרוטוקול הגרפי 4u. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1:4X_ ניסויים בתבנית. xltx. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 

שם פלמיד יבואן/פרמאז סמן תגובה
p4Fui ס. cerevisiae ס Fui1 URA3 Fui1 יבוא Uracil ו Uridine, מה שהופך אותו אידיאלי עבור ניסויים הדופק/מרדף.
pAT2 ס. cerevisiae ס Fui1 LEU2
p4Fui-ΔPEST ס. cerevisiae ס Fui1 URA3 מוטיב המזיק של Fui1 כבר בוטלה, כך חדירות אינו מושפל כאשר יש מספיק מתאיים אורציל עבור הצרכים של התא. עובד היטב בניסויים בתוויות ומשפר את ביצועי הדופק/מרדף.
p4Fur ס. cerevisiae ס Fur4 URA3 קואכאיל פרמאז
YEpEBI311 ה. ספיינס ENT1 LEU2 מילר ואח '11. מכיל גם גן HSV מידנין קינאז.
. אני מבין
כל הפלמידים הם 2 יקרומטר מבוסס. כל p4 פלמידים ו פאט מבוססים על pRS16 סדרה של פלמידים. FUI1 ו FUR4 מבוטא מן היזמים האנדוגניים שלהם.

שולחן 1: פלמידים המשמשים את הפרוטוקול הזה.

Discussion

מאמר זה מציג פרוטוקול עבור התוויות 4tU מהירה ביותר וספציפי, להתאוששות של המתהווה, RNA מסונתז לאחרונה מ -S. cerevisiae ס לאחר כמה שפחות 15 S של תוויות, עם זיהום נמוך מאוד על ידי RNA ללא תווית.

המשתמש צריך תמיד לדאוג לשמור על היושרה של ה-RNA על ידי שימוש בטמפרטורות קרות ו-DEPC מטופלים ריאגנטים. טיהור Streptavidin חרוז הוא אמין בדרך כלל; עם זאת, מאגר חרוז קשה לטפל; זה חייב להיות טרי, עם המרכיבים שלה הוסיף בסדר הנכון, ולא מקורר או באוטוקלבד. הכישלונות הנפוצים כוללים את ה-RNA שאינו מומס לחלוטין לאחר צעדי המשקעים, ולכן לא ביולוגית או אבודה באופן אחר במהלך שלבי העיבוד. קיימת עזרה נרחבת לפתרון בעיות בחומר המשלים.

יש כמה מגבלות להיות מודעים ב ers4tU. אחד כבר הזכיר כי 4tU מאט את הצמיחה של שמרים (איור 1a). פרט ל-RNAs9, רק rnas ששועתק במהלך תקופת התיוג יכול להיות מטוהר על ידי שיטה זו. הפלסים הושהה בגנים לאורך הזמן המלא לא יפיק תעתיקים של התמלילים שניתן לטהר, למרות שהתעתיקים הינם מתויג חלקית בשל הזנת המצב או היציאה מהמצב המושהה במהלך התהליך הניתן לשחזור. זנים כי לתעאם גרוע, או בגלל תנאי מוטציה או צמיחה, לייצר nsRNA קטן, למרות הטכניקות המשמשות כאן יהיה בכל זאת לשפר את ההתאוששות של nsRNA לעומת שיטות אחרות. פעמים ארוכות יותר וכרכים תרבותיים מוגברת עשויים להיות נחוצים בזנים ובתנאים אלה. שימו לב כי אורציל הוא מקור טוב של חנקן ולכן שיטה זו צריכה להיות מלאה לפני השימוש למחקרים מעורבים רעב חנקן.

הפרוטוקול ers4tU שימושי במיוחד לניתוח של RNAs קצרי-חיים, שרבים מהם מושפל כל כך במהירות, כי הם לא יכולים להיות מזוהים מבלי לשתק את מכונות השפלה. דוגמאות כוללות תעתיקים לא יציב מוזר (חתכים)4, ותעתיקים קצרים המיוצרים על ידי סיום מוקדם או יזם הקרוב משהה18 ו-antisense שעתוק "במעלה" מיזם (הנחיות)19. Intermediates המיוצר במהלך העיבוד של מינים יציבים RNA הם גם ארעי אבל יכול להיות מועשר באמצעות ers4tU תמלול4. הפרוטוקול ers4tU ולכן הוא יוצא דופן במתיר מינים זמניים מאוד ארעי להיות מנותח ונלכד תחת התנאים הפיזיולוגיים הסמוכים, אשר הוא יתרון עצום על פני שיטות אחרות. טכניקה זו שימש לחקר תמלול והזרם RNA לעיבוד קינטיקה ב RNA מוטציות פולימראז שהאריך מהר יותר או איטי יותר מאשר20נורמלי.

Thiolation תואם גם עם RNA-seq ו סלאם-seq21, המאפשר כל RNA המיוצר בתוך חלון זמן קצר מאוד כדי להיות מאופיין בפירוט מעולה.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מימון ברוך הבא ל-JB [104648]. העבודה במרכז ברוך הבא לביולוגיה סלולרית נתמכת על ידי מימון ברוכים המרכזיים [092076]. המחברים מכירים בחברי המעבדה על עזרתם: בלה מאולין, עמנואלה סאני, סוזנה דה לוקאס-אריאס ושייני ג'ורג '. המחברים גם רוצה להודות פטריק קרמר עבור פלYEpEBI31111.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol (βME) Sigma-Aldrich M3148 CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use
Chloroform Sigma-Aldrich 25668 CAUTION toxic
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave
DMF (N,N-dimethylformamide)  Sigma-Aldrich 227056 CAUTION toxic
EDTA Sigma-Aldrich 3609 Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide
Ethanol Sigma-Aldrich 29221
EZ-link HPDP Biotin Thermo scientific 21341 Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend.
Glucose Fisher Scientific  G/0500/60
Glycogen [20 mg/mL] Sigma-Aldrich 10901393001 Store at -20 °C
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel Thermo Scientific 77712 Optional
LiCl Sigma-Aldrich 793620 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 63033 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.
Methanol Fisher Scientific M/4000/PC17 CAUTION Toxic and flammable
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139 Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264
NaCl Sigma-Aldrich S9888-M 5 M solution
Phenol, low pH.   Sigma-Aldrich P4682 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.  Sigma-Aldrich P1944 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Pierce Spin Columns Thermo Scientific 69702 Optional
SCSM single drop-out –ura Formedium  DSCS101
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 32318-M Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429 CAUTION corrosive
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Sigma-Aldrich 436143 CAUTION irritant, do not inhale
Streptavidin Magnetic beads NEB 1420S Store at 4°C 
SUPERase-In, RNase inhibitor Life technologies  AM2696 Store at -20°C
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike See section 1.7 of the protocol
4-thiouracil (4tU)  ACROS ORGANICS 359930010 Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. 
Tris base Sigma-Aldrich 93362 1 M solutions at various pH
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001 5mg/ml, store at -20°C
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.
Yeast nitrogen base without amino acids  with amonium sulphate Formedium CYN0410
Zeba Columns 0.5ml Thermo Scientific 89882 Store at 4 °C 
Zirconia beads Thistle Scientific 110791052
Equipment and Consumables
Beadbeater Biospec 112011EUR Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g 
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist 
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end 
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended 
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL Eppendorf H179467N
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL Ambion AM12350
Tubes, centrifuge, 50 mL  Sarstedt 62.547.004 Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss
Tubes, centrifuge, 15 mL  Sarstedt 62.554.001
Tubes, 2 mL, screw cap Greiner 723361
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids Brand 781332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10, (1), e1513 (2018).
  2. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).
  3. Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).
  4. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  5. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).
  6. Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast. Yeast (Chichester England). 36, (1), 75-81 (2018).
  7. Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  8. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  9. Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression. Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).
  10. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).
  13. Rädle, B., et al. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  14. Herzog, V. A., et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).
  15. Ohrt, T., et al. Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system. RNA. 19, 902-915 (2013).
  16. Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
  17. Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast. RNA. 23, 601-610 (2017).
  18. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).
  19. Preker, P., et al. RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters. Science. 322, 1851-1854 (2008).
  20. Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast. Genome Research. 28, 203-213 (2018).
  21. Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding. Nature Methods. 15, 221-225 (2018).
מהירה מאוד וספציפית תיוג מטבולי של RNA ב Vivo עם 4-Thiouracil (Ers4tU)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).More

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter