Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Чрезвычайно быстрая и специфическая метаболическая маркировка РНК in Vivo с 4-Thiouracil (Ers4tU)

doi: 10.3791/59952 Published: August 22, 2019

Summary

Использование thiolated uracil чувствительно и специально очистить недавно транскрибированной РНК от дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Нуклеотида аналог, 4-тиурацил (4tU), легко берется клетками и включены в РНК, как это транскрибируется in vivo, что позволяет изоляции РНК производится в течение короткого периода маркировки. Это делается путем присоединения биотин moiety к включены тио группы и сродство очистки, с использованием стрептавидин покрытием бисера. Достижение хорошей урожайности чистой, недавно синтезированной РНК, которая свободна от уже существующей РНК, делает возможным более короткое время маркировки и позволяет увеличить временное разрешение в кинетической исследованиях. Это протокол для очень специфической, высокой очистки от синтезированной РНК. В представленном здесь протоколе описывается, как РНК извлекается из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Однако протокол по очищению тиолированной РНК от общей РНК должен быть эффективным с использованием РНК из любого организма после того, как она была извлечена из клеток. Очищенная РНК подходит для анализа многими широко используемыми методами, такими как обратная транскриптаза-qPCR, РНК-сек и SLAM-seq. Специфика, чувствительность и гибкость этого метода позволяют получить беспрецедентное понимание метаболизма РНК.

Introduction

РНК имеет динамический характер; вскоре после того, как он производится много РНК быстро обрабатывается и деградирует. В настоящее время большинство исследований метаболизма РНК анализируют общую клеточную РНК, которая в основном полностью обрабатывается и находится на стабильном уровне. Этот уровень зависит от баланса между темпами транскрипции, посттранскрипционным созреванием и деградацией. Анализ процессов, ведущих к устойчивому равновесию состояния, требует специализированных методов для захвата очень недолговечных видов РНК.

Метаболическая маркировка РНК нуклеотидными аналогами, такими как 4-тиурацил (4tU) или 4-тиуридин (4sU) (см. Duffy et al.1 для отличного обзора), дает возможность изолировать тио-маркированные зарождающиеся РНК и их промежуточные обработки. Тем не менее, опубликованные протоколы включают маркировки раз в несколько минут2,3, что медленно по отношению к скорости производства многих стенограмм. Это занимает порядка одной минуты, чтобы расшифровать средний ген дрожжей, так маркировки дрожжей РНК менее чем за одну минуту можно считать чрезвычайно коротким. Чрезвычайно быстрый и конкретный 4 thiouracil протокол (ers4tU) максимизирует сигнал к шуму соотношение путем максимизации 4tU включения и минимизации восстановления немаркированной, уже существующие РНК делает очень короткие времена маркировки возможно4.

Тио-модифицированная база должна быть импортирована в клетки быстро и в достаточном количестве, чтобы эффективно маркировать недавно синтезированную РНК (nsRNA). Для содействия этому, клетки выращиваются в uracil-свободной среде, и выражение соответствующего permease помогает повысить поглощение 4tU или 4sU (см. Таблица 1 для списка плазмидов, которые несут подходящие пермяки генов и дополнительная цифра1). Растворимость гидроксида натрия 4tU позволяет избежать необходимости в токсичных органических растворителях, необходимых для других нуклеотидных аналогов. К сожалению, растущие культуры в течение длительных периодов с тио-модифицированными нуклеозидов в концентрациях более 50 мкм наблюдается нарушить рибосомы5. Тем не менее, концентрация (10 мкм), используемых здесь, и чрезвычайно короткое время маркировки, свести к минимуму вредные эффекты5 (Рисунок1а),в то же время принося достаточно РНК для анализа.

Этот метод можно комбинировать с быстрым и специфическим auxin-опосредованным истощением протеина цели6,7 (Рисунок2),refer to как «протокол AID 4U, в котором й-эстрадиол отрегулированное выражение auxin индуцируемая система дегрена (AID) сочетается с маркировкой 4tU. При подходе к AID 4U, целевой белок может быть истощен и влияние на метаболизм РНК тщательно контролируется(рисунок 2). Время имеет решающее значение; целесообразно просмотреть сопроводительное видео и обратить пристальное внимание на рисунок 2 и его анимированную форму (см. Дополнительную рисунок 2).

Обработка и деградация РНК должны быть остановлены чрезвычайно быстро для точного разрешения времени. Это достигается с помощью метанола при низкой температуре, который фиксирует содержимое клеток очень быстро и ухудшает клеточной мембраны при сохранении содержания нуклеиновой кислоты8. Извлечение РНК должно быть эффективным и не повредить РНК. Механический лизис эффективен при отсутствии хотропных агентов (часто они содержат тио группы, поэтому следует избегать). Предпочтительным является осадки в хлориде лития РНК, так как тРНК менее эффективно осаждаются. tRNAs быстро транскрибируются и, естественно, thiolated9, так что удаление tRNAs снижает конкуренцию за биотиниляции реагента. Если небольшие, высоко структурированные РНК представляют интерес, рекомендуется использовать методы выпадения РНК на основе спирта.

Для восстановления thiolated РНК, биотин ковалентно прилагается через тио групп, включенных в РНК с 4tU. Использование модифицированного биотина, который крепится через расщепленную дисульфидную связь (например, HPDP-биотин (N-6-(Biotinamido)hexyl-3 --(2 --pyridyldithio)propionamide, ) или MTS-biotin (Метанет тиосульфонат)) как это позволяет высвобождение РНК путем добавления редукта. Биотинилатированная РНК сродство очищается от стрептавидина в сочетании с магнитными бусинами. Этот протокол аналогичен другим перечисленным ранее10, но был интенсивно оптимизирован для уменьшения фона.

Есть два типа тиол маркировки эксперимент, который может быть выполнена, непрерывная и прерывистая маркировка. Каждый из них имеет свои преимущества. При непрерывной маркировке 4tU добавляется к культуре и образцам, взятым через регулярные промежутки времени. Этот тип эксперимента показывает, как рнк обрабатывается и как уровни меняются с течением времени. Примеры включают сравнение мутантов с экспериментами дикого типа и эксперимент омпульс-погони. Эксперименты, показанные на рисунке 3b,c, относятся к этому типу. Для прерывистой маркировки изменение индуцируется в систему и РНК контролируется. После того, как изменение было вызвано культуры должны быть разделены на несколько субкультур, и в определенное время, каждый из них затем thio-маркировки в течение короткого периода. Одним из примеров является q-est AID 4U показано на рисунке 27. Этот тип эксперимента особенно полезен для мониторинга влияния метаболических изменений на обработку РНК (см. рисунок 3d).

Графическое представление эксперимента по маркировке thio представлено на рисунке 4 и рисунке 5, а электронная таблица, которая значительно упрощает производительность протокола, доступна (см. шаблон эксперимента 4tU.xlsx). Помимо этого дополнительная информация содержит обширное руководство по устранению неполадок. Для протокола q-est AID 4U, который интегрирует маркировку 4tU с протоколом истощения auxin, см. Рисунок 2 и Дополнительная диаграмма 2. Смотрите Barrass et al.7 для подробного протокола об истощении AID.

Protocol

1. Рост и тмио-маркировка

ПРИМЕЧАНИЕ: Время завершения этого раздела протокола весьма переменно, в зависимости от темпов роста клеток. Разрешить 1 ч, чтобы подготовить решения и оборудование до thio-маркировки и 30 мин после маркировки для обработки образцов.

  1. Убедитесь, что штамм S. cerevisiae содержит плазмид, кодирующиперскую пермяку (Таблица1), чтобы увеличить импорт 4tU в ячейку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Без импортера, маркировка менее 2 мин вряд ли будет успешным11 (см. Дополнительная рисунок 1). 4tU включение является более эффективным, если рост в среде без uracil, так что штамм должен быть URA3 некоторые из плазмидов в таблице 1 нести URA3 в качестве маркера. Если этот протокол должен быть объединен с истощением7-EST AID, необходимы дополнительные изменения деформации.
  2. Приготовьте среду без YMM, добавив 6,9 г дрожжевой азотной базы без аминокислот, 20 г глюкозы и 1,92 г сксМ-одного отсева (Таблица Материалов) до 1 л воды. Автоклав или фильтр стерилизовать среду роста перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр стерилизации является предпочтительным в качестве пептида / сахара комплексов, производимых автоклавирования совместного осадка с клетками в метаноле, используемом в сборе образцов.
  3. Выращивайте дрожжи в среде без уронила YMM до оптической плотности при 600 нм (OD600) от 0,6 до 0,8. Убедитесь, что культура находится в росте фазы журнала и была, по крайней мере, в два раза. Рост при температуре 30 градусов обычно рекомендуется, но другие температуры могут быть использованы, например, для чувствительных к температуре штаммов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от нагрузки, условий роста и урожайности РНК потребуется около 30 мл пробы. Эта сумма будет излагаться на протяжении всего протокола. 30 мл культуры является наиболее, что будет вписываться в 50 мл центрифуги трубки с 20 мл метанола, так что это удобный объем, чтобы начать оптимизацию. Рассмотрите возможность использования большего объема выборки для ранних точек времени для увеличения восстановления РНК, до 2000 мл используется для более медленных растущих клеток в очень короткое время маркировки (1 мин).
  4. Охладите около 50 мл H2O на льду. Для каждого образца добавьте 200 qL шариков zirconia к трубке 2 mL винт-крышки и охладите на льду. Также положите 20 мл метанола (ПРЕДГВИ), в 50 мл центрифуговых труб, и поместите на сухой лед (CAUTION). Метанол должен быть 1/3 до 2/3 объем образца.
    ВНИМАНИЕ: Метанол токсичен при вдыхании, контакте и потреблении. Распределите большие объемы в дымовом капюшоне, и носить две пары перчаток, как метанол может проникнуть нитрила лабораторных перчаток. Метанол легко воспламеняется, держитесь подальше от всех источников зажигания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как сухой лед может вызвать холодные ожоги при контакте и производит asphixiant газа, использовать перчатки при обработке и использовании в хорошо проветриваемом пространстве.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление бисера в этот момент легче, чем после того, как образец был добавлен, как трубка сухая и при спиннинг вниз клетки гранулы бисер также вращаться подальше от трубки нить экономии некоторое время. Кроме того, это позволяет бусины остыть, прежде чем образец добавляется.
  5. Если s. pombe шип должен быть добавлен в культуру (а не позже), оттаять аликот thiolated S. pombe клеток на льду и вихре тщательно, по крайней мере 30 с, а затем добавить к культуре. Если подготовлено в соответствии с инструкциями ниже, один S. pombe aliquot достаточно для 400 мл культуры (достаточно для двенадцати 30 мл образцов плюс немного, чтобы позволить ошибки в обращении). Если используется более или менее культура, отрегулируйте объем S. pombe, добавленного в культуру.
    1. Вырастите 1 L культуры S. pombe до OD600 до 0.8 точно как описано в протоколе для S. cerevisiae.
    2. Тио-метка как шаг 1.7, но в течение 10 мин.
    3. Исправить всю культуру, используя 400 мл метанола на сухом льду, по существу, как описано в шаге 1.9.
    4. Пелле клетки центрифугации при 3000 х г в течение 3 мин.
    5. Откажитесь от супернатанта и отрепримите клеточные гранулы в 3,3 мл H2O.
    6. Разделите на aliquots по 80 л каждый. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
    7. Используйте все одно аликот для культуры 400 мл или 10 л на 30 мл образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшите объем шипа до 1/10 при выполнении РНК. Не используйте aliquots; отбросить любой неиспользованный шип. Этот всплеск полезен для нормализации и сравнения результатов в различных временных точках и экспериментах.
  6. Для прерывистой маркировки, вызвать необходимые метаболические возмущения (например, условия роста, индукции генов или истощения, такие как q-est AID7 (Рисунок2 и Дополнительная рисунок2), а затем разделить культуру. Убедитесь, что все колбы и носители находятся при необходимой температуре и, по возможности, анейируют среду перед добавлением культуры.
  7. Добавьте 4tU к культуре до концентрации 10 мкми тщательно перемешайте (1 /10000 от объема культуры 100 мМ 4tU, растворенного в 1 M NaOH). Тиол-метка от 15 до 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тридцать секунд является хорошей отправной точкой. Thio-маркировка для меньш чем 20 s дает больше переменных результатов из-за затруднений манипулируя культурой под давлением времени. Однако маркировка более 1 мин уменьшает временное разрешение техники.
  8. Если погоня эксперимент должен быть выполнен; позволяют тио-маркировки для 20'30 s затем погони, добавив 1/200 объем культуры 1 M uridine (не thiolated), до окончательной концентрации 5 мМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уридин предпочтительнее uracil для погони, как уридин является более растворимым для воды позволяет меньший объем, который будет добавлен в культуру и поэтому меньше нарушений роста клеток.
  9. Возьмите образцы культуры через регулярные промежутки времени (не менее 15 с), до конца курса времени. Интервалы выборки короче, чем это трудно выполнить надежно. Добавьте образец в метанол на сухом льду, приготовленный в шаге 1.4. Для удобства добавьте 30 мл культуры в трубку 50 мл, содержащую 20 мл метанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Углекислый газ растворяется в метаноле при холоде; это выходит из раствора на добавление образца и пены энергично при смешивании, в результате чего в пробе потери. Чтобы избежать этого, охладите метанол до злт;-70 градусов по Цельсию в плотно запечатанной трубке до тех пор, пока не будет необходимо, а затем перенесите на сухой лед.
  10. Печать трубки и тщательно перемешать, встряхивая. Поместите образцы на лед. Убедитесь, что ни один из образцов не заморожен; если это так, мягко тепло в руке, инвертируя постоянно. Это лучше всего сделать в руке, так как температура образца может быть оценена, он всегда должен чувствовать себя холодно. Место на льду. Это не точка паузы; как только весь образец жидкости перейти к следующему шагу.
  11. Спин на 3000 х г в течение 2 мин (при 4 градусах по Цельсию, если это возможно), чтобы гранулы клетки. Слейте жидкость и resuspend гранулы, по крайней мере 1 мл ледяной воды, мягко pipetting вверх и вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный метанол в образце гранул способствует повторной приостановке.
  12. Передача на 2 мл винтовая крышка труб, подготовленных в шаге 1.4. Спин кратко (например, 10 с общей время) на йgt;13000 х г, чтобы повторно гранулы клетки, место обратно на лед и удалить жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы могут храниться при от -70 до -80 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.

2. Подготовка общей РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Время завершения составляет 90 минут.

  1. Используйте диэтил-пиробубонат (DEPC) обработанные растворы для защиты РНК от деградации. Aliquot решения с использованием фильтра пипетки советы и носить перчатки в любое время.
    1. К раствору добавьте 1/1000 объем DEPC и перемешать энергичной встряхивания.
    2. Оставьте при комнатной температуре (RT) на 24 ч, затем автоклав.
    3. Решения с группами амина (например, трис) не могут быть обработаны DEPC. Aliquot порошок и хранить специально для работы РНК. Используйте ранее DEPC обработанных H2O, чтобы сделать решение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку тио-группа рнковой РНК фотоактивируется, свести к минимуму воздействие УФ-излучения с этого момента. Хранение должно быть в темноте и инкубации лучше всего делать в машине ПЦР с крышкой.
  2. Если шип S. pombe должен быть добавлен в клетку гранулы, а не культуры (не делать и то и другое), добавить его сейчас. Оттепель aliquot thiolated S. pombe клеток на льду и вихре тщательно, по крайней мере 30 с, прежде чем добавить в гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если подготовлено в соответствии с шагами 1.5.1'1.5.7, 10 qL S. pombe aliquot требуется для одной гранулы, полученной из 30 мл культуры.
  3. Перед тем, как надеть крышку, вращайтесь очень кратко в течение 1 х 2 с, чтобы гарантировать, что ни один серкония бисера не оказались в ловушке между крышкой и трубкой, что может привести к утечке образца и фенола из трубки.
  4. Повторное приостановку клеток в 400 qL ацетата EDTA (AE) буфер (50 мм натрия ацетат рН 5,3, 10 мм EDTA pH 8.0), путем вихря энергично. Добавьте 40 кл. 10% (w/v) сульфат натрия (SDS). Не вихрь, как SDS будет пениться.
  5. Если протокол q-est AID 4U будет использоваться, возьмите 40 qL клеточной суспензии для анализа белка7. Добавьте 40 зЛ АЕ, чтобы сделать объем обратно до 400 л.
  6. Добавьте 800 л фенола (ПРЕЕСТЕРИ) при низком рН и вихре в течение 10 с.
    ВНИМАНИЕ: Фенол является токсичным и коррозионным при вдыхании и контакте. Всегда выполняйте процедуры с участием фенола в дымовом капюшоне и носите две пары перчаток.
  7. Вылажь клетки в гомогенизаторе (например, таблица материалов) в течение трех 2-минутных очередей при самой низкой настройке мощности. Оставьте образцы на льду на 2 мин между импульсами гомогенизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация условий при использовании других гомогенизаторов. Недостаточное встряхивание приведет к плохой урожайности, в то время как чрезмерное встряхивание приводит к очевидной более высокой урожайности, как это определено поглощением на 260 нм (A260), но РНК может быть деградирована. Предпочтительным является гомогенизатор, но горячая очищение РНК 12.
  8. Поместите лисизированный образец на сухой лед в течение 5 мин, пока он не затвердеет, это уменьшает геномную ДНК переноса в РНК. Не замораживайте слишком долго, так как образец не будет оттаивать. Спин 5 мин в микрофуге на 13000 х г на RT; не поддавайтесь искушению сделать это при температуре 4 градусов по Цельсию, так как смесь образца/фенола останется твердой на протяжении всего спина, если она проводится при низкой температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец все еще заморожен в конце спина, повторно спина еще на 5 минут, пока образец полностью размороженные.
  9. Экстракт фенола/хлороформа затем экстракт хлороформа с равным объемом (приблизительно 600 л.с.) фенола: хлороформ 5:1 затем хлороформ (ПРЕСТЕР). Перенесите верхнюю фазу в другую трубку, содержащую фенол: хлороформ 5:1 или хлороформ. Вихрь, затем спина в течение 5 минут в микрофуге на RT. Затем перенесите верхнюю фазу на новую трубку объемом 1,5 мл.
    ВНИМАНИЕ: Хлороформ токсичен при вдыхании и контакте. Всегда выполняйте процедуры с участием хлороформа в капоте дыма и носите две пары перчаток.
  10. Добавьте от трети до половины объема (примерно 300 л) 10 М ЛиКла, и перемешайте, чтобы осаждать РНК. Образец должен идти облачно немедленно, но оставить, по крайней мере 10 мин на льду или на 4 кв (не храните ниже -20 градусов по Цельсию, как он замерзнет), или до осажденного flocculates.
  11. Спин в течение 5 мин на йgt;13000 х г в микрофуге. Удалите жидкость, кратко повторно спина и удалить отбросы. Вымойте гранулы с 300-500 л 70% этанола, спина кратко и удалить оставшиеся этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этих смоекдержать держать гранулы на той же стороне трубки, как первый спин, таким образом, гранулы не будет двигаться и ломаться; если он нарушает некоторые РНК могут быть потеряны случайно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не сушите гранулы; до тех пор, как большая часть жидкости была удалена она не будет вмешиваться в последующие шаги. РНК также может храниться на этом этапе при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев или от -70 до -80 градусов по Цельсию для длительного хранения.
  12. Повторно растворить гранулы РНК в 90 л TE pH 7.0 (10 мм Tris HCl pH 7.0, 1 mM EDTA pH 8.0) путем нагрева при 65 градусах Цельсия при встряхивании, так как гранулы РНК может быть трудно вновь растворить. Это должно быть не более 5 мин, как РНК деградирует при более высоких температурах. Проверьте полную растворимую РНК, а затем перенесите на трубку 0,2 мл. Pipette образец вверх и вниз; не должно быть никаких "комков", и жидкость должна расти и падать плавно в кончике. Это решение является вязким, поэтому окончательное движение трубачирования должно быть медленным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНК может храниться при -20 градусов в темноте на данном этапе; это также может быть полезным для растворимости РНК.

3. Биотинилаация

ПРИМЕЧАНИЕ: Время завершения составляет 60 мин. Следующие шаги удобно выполняются в полоске трубок с цельальными колпачками, так как они имеют меньше тенденции открываться на вихре, чем полоски с отдельными колпачками.

  1. Биотинилат, добавляя вРНК 10 л (1/10 конечного тома) раствора 5 мМ HPDP-биотин (МТС-биотин, который можно использовать точно так же, как HPDP-биотин), в РНК и тщательно перемешать. Разогреть РНК не более чем на несколько секунд при температуре 65 градусов по Цельсию, прежде чем добавить биотин. Инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение 15 минут до максимум 30 мин в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это нагревание требуется, как некоторые партии HPDP осаждается на RT в образце РНК. Блок ПЦР с нагретой крышкой идеально подходит для этого.
  2. Подготовьте небольшой объем смолы, столбец исключения размера(Таблица материалов), чтобы исключить неинкорпорированный биотин. Снимите нижнюю бирку колонны и ослабьте крышку, поместите в центрифугу 2 мл. Спин на 1500 х г в течение 1 мин, чтобы промыть буфер Добавить 0,3 мл TE мягко в верхней части столбца и спина снова. Повторите мыть и спина в два раза больше в общей сложности 3 моет. Наконец, перенесите промытую колонку на свежую трубку 1,5 мл.
  3. После завершения инкубации образца (шаг 3.1) добавьте образец в верхнюю часть столбца. Спин при 1500 х г в течение 2 мин. Биотинилаповый образец РНК в настоящее время находится в нижней части трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мин спина не достаточно, чтобы удлинить весь образец.
  4. Добавьте от трети до половины объема (примерно 40 л) из 10 M LiCl, смешайте, чтобы повторно ускорить РНК в виде шага 2.10. Образец должен быть облачным немедленно, но оставить, по крайней мере 5 мин на льду или на 4 кв. c или до осажденного flocculates; не храните ниже -20 градусов по Цельсию, так как он замерзнет. Centrifuge образец в течение 5 мин на йgt;13000 х г в микрофуге.
  5. Вымойте 80% этанола, 1 ч вращения. Следуйте процедуре в шаге 2.11, чтобы удалить как можно больше жидкости, как это возможно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку HPDP-биотин очень растворим в 80% этанола, это дополнительный шаг очистки.
  6. Повторите 80% этанола мыть, чтобы удалить как можно больше ООН-включены биотин, как это возможно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНК также может храниться на этом этапе при -20 градусов в темноте.

4. Очистка недавно синтезированной РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Время завершения составляет 2 ч.

  1. Повторное растворение РНК в 200 qL DEPC-обработанных H2O (65 градусов по Цельсию инкубации может быть использован, как и процедура в шаге 2.12).
  2. Измерьте концентрацию РНК при A260 с помощью спектрофотометра; образец, возможно, придется разбавлять 1/10, чтобы получить его в линейном диапазоне спектрофотометра. Vortex это разбавление, по крайней мере 10 с для обеспечения вязкой РНК равномерно растворяется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность биотинилации может быть оценена по точечной подогреву13 при необходимости.
  3. Добавьте одинаковое количество РНК в свежую трубку и сделайте до 200 кЛ в DEPC-обработанных H2O. Используйте весь образец с наименьшей концентрацией РНК и используйте соответствующий объем других образцов, чтобы иметь одинаковое количество РНК для каждого.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 4tU эксперимент template.xlsx имеет форму, чтобы помочь этому расчету.
  4. Когда образец находится на RT, добавьте 25 qL 10 x NaTM буфер (0.1 M Tris HCl pH7.0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl 2), 25 qL 1 M NaPi pH 6.8 (0.5 M2PO4 0.5 M Na2HPO4) , и 2,5 л 10% SDS. Тщательно перемешайте и закрутите осторожно (йlt;30 s; приблизительно 100 x g).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать осадков SDS и солей, образцы должны храниться на RT в течение следующих процедур до шага 4.13.
  5. Сделайте буфер бисины, содержащий буфер 1x NaTM, 0,1 M NaPi и 0,1% SDS, 2 мл на образец. Добавьте необходимое количество H2O первого и SDS последнего. Это должно быть сделано свежим каждый раз, как осадок формы после 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать образования осадков, буфер биса должен храниться в RT на протяжении следующих процедур. Не DEPC лечить или автоклав.
  6. Добавьте 50 л стрептавидина в трубку с низким удержанием 1,5 мл. Поместите трубку на магнитную стойку, подождите, пока бусинки осядут, а затем удалите жидкость
  7. Вымойте стрептавидинбидские бусы.
    1. Добавьте 200 л буфера биса и вихря до тех пор, пока гранулы из биса не будут полностью восстановлены. Обычно 3'5 s это все, что требуется. Для смок до РНК образец добавляется достаточно, чтобы повернуть трубки вокруг так бусы путешествия через трубку на другую сторону. Затем поверните трубы обратно в исходную сторону, чтобы бисер путешествия по трубе еще раз.
    2. Спин трубки на низкой скорости (примерно 100 х г) для максимум 5 с, чтобы спина вниз жидкости, но не бисер.
    3. Поместите в магнитную стойку, чтобы шарики были захвачены магнитом.
    4. Удалить жидкость путем аспирации для небольшого числа образцов; слить жидкость, если много образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С большим количеством образцов, удаление всей жидкости чисто аспирации может быть проблематичным, так как бусы в первом образце могут быть высушены до последнего образца закончена, это увеличивает фон. Мытье может быть ускорено путем заливки жидкости из всех образцов сразу в то время как на магните. Они должны быть оставлены немного дольше на магнит перед заливкой и небольшое количество жидкости, которая остается должен быть аспирированы прочь, но, в целом, это означает меньше времени на магнит и без жидкости. Таким образом, можно сделать 24 или более извлечений быстро.
  8. Блок с буфером биса 200 л, 10 мг/мл гликогена и 2,5 л 5 мг/мл tRNA, 20 мин вращающийся конец над концом на умеренной скорости на RT. Вращение заключается в том, чтобы держать бисер в подвеске. После того, как блокировка будет завершена, удалите жидкость в виде шагов 4.7.2-4.7.4 и снова промойте, как шаги в разделе 4.7.
  9. Отреприжите бусинки в образце. Инкубировать на RT с вращением в течение 30 мин.
  10. Во время инкубации приготовьте свежую трубку 1,5 мл для каждого образца. Добавьте 1/10 объем (примерно 10 л) 3 M ацетат ацетата натрия рН 5,3 и 20 мкг гликогена, и спина примерно на 100 х г в течение 3 с. Хранить в стойке до необходимости.
  11. Удалите несвязанную РНК из бисера, как шаги 4.7.2-4.4.4. Несвязанная РНК может быть упорно в свежей трубке, но соли и SDS сделать его очень трудно очистить. Затем мыть бисер, как раздел 4.7 с вихрем, как минимум от 3 до максимум 5 раз.
  12. После окончательной стирки позаботьтесь о том, чтобы заасить всю жидкость; вернуться к каждой трубке и аспирировать отбросы буфера еще раз.
  13. Чтобы утилизировать РНК, добавьте 50 qL свежеприготовленного 0,7 М-меркаптоэтанола(ЗМЕ) в бисер (1 /20 разбавления коммерчески поставляемого раствора). Вихрь и спина кратко, как шаги 4.7.1 и 4.7.2. Поместите суспензию в магнитную стойку и пипетку РНК, содержащую раствор, в 1,5 мл центрифуги трубки, подготовленной в шаге 4.10.
  14. Elute еще раз, как шаг 4.13 для восстановления остаточной РНК из бисера и добавить eluted образца в трубку, содержащую первый elution из этих бусин.
  15. Удалите остаточные бусы из электора, поместив образец обратно в магнитную стойку и переведя жидкость в свежую, низкую связывающую 0,5 мл центрифуги.
  16. Смешайте образец, а затем осаждает nsRNA, добавляя 2,5x объемы (280 л) этанола и еще раз перемешайте. Оставьте на 1 ч на ночь при -20 градусах Цельсия. Спин в предварительно охлажденной центрифуге (4 кВ) в течение 20 минут на максимальной скорости (не менее 13 000 х г).
  17. Тщательно вымойте 200 л 70% этанола при -20 градусов по Цельсию. Как остаточный ЗМЕ будет препятствовать вниз по течению приложений, спина на каждом шагу, чтобы удалить как можно больше отбросов, как это возможно; в конце образца не следует пахнуть ЗМЕ.
  18. Повторно растворить в 10-20 л DEPC-обработанных 1x TE с эквивалентом 0,005 Л L RNase ингибитор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы должны быть выполнены на льду.
  19. Измерьте концентрацию РНК и чистоту.
    1. Измерьте A260 и A225 в спектрофотометре низкого объема образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимум абсорбции вблизи 225 нм происходит от неизбежного загрязнения из бисера. При отсутствии РНК сигнал от загрязняющей снизилась до 35% при 260 нм. Таким образом, фактическое количество РНК приблизительно по формуле: (A260-(A2250,35))
    2. Кроме того, проанализируйте образец на системе электрофореза микрожидкости, такой как биоанализатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ предпочтительнее использовать спектрофотометр, как РНК целостности может быть оценена, загрязнитель не вмешивается в количественную оценку и меньше образца не требуется.
  20. Проанализируйте nsRNA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, конкретные РНК могут быть количественно стандартными методами обратной транскриптазы qPCR. РНК, подготовленная таким образом, совместима с библиотечной подготовкой к РНК-секу. Удаление РНК не требуется для маркировки менее 5 мин. Рекокодирование SLAMseq14 также может быть выполнено на этой РНК.

Representative Results

Типичные урожаи для nsRNA восстановлены с помощью этого протокола ers4tU отображаются на рисунке 1b, это было произведено биоанализатором и след показывает выход РНК по сравнению с размером (нуклеотиды . Обратите внимание, как в биоанализаторе следа и всетальный график, что восстановление РНК от точки времени 0 очень небольшая часть, что оправился от более длинных точек времени - примерно 0,3 мкг РНК восстановлены из примерно 109 клеток по сравнению с более чем в два раза больше после всего 30 с маркировки (0,8 мкг нрнк) из того же количества клеток. Восстановление РНК на 15 с является более переменной, поскольку небольшие различия в выполнении выборки оказывают пропорционально большее влияние на восстановление РНК. В биоанализаторе, прекурсоры rRNA можно рассматривать как пик около 1000 nt и дублет пиков на 1700-1800 nt. Обилие этих промежуточных увеличивается, как тиоляция продолжается.

Thio-маркировка была использована для количественной оценки сращивания стенограммы ACT1 (рисунок 3). Тиолация была проведена и пробы взяты с интервалом в 15 с начала тио маркировки и обработки ACT1 РНК мониторинга(рисунок 3a, b). Как видно, pre-mRNA генерируется (по транскрипции), и лариаты (на первом этапе сращивания из предварительной мРНК), даже после всего 15 с маркировки. Примерно через 45 с до 1 мин, количество лариатов и предварительном mRNA достичь равновесия с такой же большей частью этих видов РНК создается транскрипции, как обрабатываются прочь путем сплайсинга.

Для получения данных, показанных на рисунке 3c штамм был импульсный с 4tU для 25 с, а затем преследовали с уридином. Выработка предмРНК и лариатов достигает максимума в 1 минуту. Это хорошо сравнивается с рисунком 3b; максимум достигается после 45 с для достижения равновесия плюс 25 с маркировки. После пика, уровни снижаются, как тио-маркированные РНК преследуются через процесс сращивания.

Рисунок 3d показывает истощение фактора сращивания белка и его влияние на метаболизмРНК, используя систему q-est AID 4U 6,7. Здесь, Prp16p уменьшается с почти физиологических уровней до 5% от этого уровня после 25 минут истощения. Prp16p является важным фактором сращивания для второй ступени сращивания15. Lariats удаляются во время второго этапа сращивания(рисунок 3a), но здесь они увеличиваются выше уровня pre-mRNA, как Prp16 становится ограничивающим. В более поздние времена истощения, другие факторы становятся ограниченными из-за вторичных эффектов, так что уровни лариата уменьшаются, и уровни до мРНК возрастает. Уровень сращивания мРНК снижается.

Figure 1
Рисунок 1: Рост восстановления 4tU и РНК. (a) 4-thiouracil влияет на рост. Увеличение концентрации 4tU в среде роста yMM отсева без uracil увеличивает время удвоения S. cerevisiae (BY4741) нося плазмид p4Fui-PEST. Рост четырех культур репликации контролировался при 30 градусах Цельсия в Tecan Infinite Pro 200. Все культуры были в бревенчатой фазе во всем, с OD600 между 0.1 и 0.6. Mock — это культура управления с эквивалентным количеством добавленных NaOH, что само по себе не меняет темпы роста. Этот график показывает, что thio-маркировка является компромиссом между быстрой маркировкой и повреждением ячейки. Бары ошибок являются стандартной ошибкой 4 репликатов. (b) урожайность nsRNA увеличивается линейно примерно с 15 с маркировки. Основная фигура показывает биоанализаторные следы очищенной, nsRNA от 0 (не thiolated) до 2 мин после добавления 4tU с интервалом 15 с. Обратите внимание, что 15-й образец не показан, так как он был неотличим от немаркированного образца. Два больших пика соответствуют рибосомным РНК (РНК). Прекурсоры и промежуточные rRNA видны как несколько пиков при большем молекулярном весе, чем зрелые RRNA. Восстановление этих прекурсоров и промежуточных увеличивается со временем. Показаны результаты одного репрезентативного эксперимента. График вставок показывает восстановление nsRNA с увеличением инкубации с 4tU. Урожайность nsRNA увеличивается с увеличением времени роста с 4tU. Восстановление удивительно линейно (R2 и 0,934) на протяжении всего срока проведения этого эксперимента и показывает небольшое увеличение на фоне даже при маркировке 15 с 4tU, хотя и не отличается от немаркированной выборки глазом от биоанализа Трассировки. Ошибки баров показать стандартную ошибку для трех биологических репликатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: графический протокол q-est AID 4U-est AID 4U. Графическое резюме протокола протокола q-est AID 4U. - эстрадиол (я-est) способствует выражению вспомогательной индуцируемой системы дегрена (AID), которая, в свою очередь, истощает тегами целевого белка AID, обратитесь к Barrass et al.7 для детального протокола. В этом случае экспрессия дегронной системы инициируется за 25 минут до начала деградации белка и тиолация в каждой временной точке составляет 1 мин. Образцы берутся до индукции и каждые 2 минуты во время истощения. Анимированная версия появляется в дополнительной фигуре 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Прекурсоры и промежуточные сращивания РНК ACT1. Сращивание стенограмм ACT1 до мРНК отслеживалось количественной обратной транскрипцией PCR16. Уровни прекурсора ACT1 (пре-мРНК), промежуточного лариат-экзон2 (Lariat) и сращивания продукта (мРНК) проявляются нормализованы по отношению к уровню ACT1 Exon2 и стабильным уровням состояния этих РНК. () Расположение продуктов qPCR на стенограмме ACT1. Схема расположения продуктов qPCR, используемых для оценки уровней прекурсоров, промежуточных и продуктов сращивания реакции стенограмм ACT1 16. Экзоны представлены ящиками, интроном в виде линии и продуктами qPCR в виде линий с бриллиантами на обоих концах, цвет соответствует тем, которые используются в графиках. ПЦР до мРНК специфичен для предварительной мРНК, а не для каких-либо промежуточных сращивания, поскольку этот продукт пересекает точку ветви, которая нарушается после первого шага сращивания. Lariat PCR обнаружит продукт первой ступени сращивания и вырезанный лариат, произведенный после второго. ПЦР mRNA специфичен для продукта сплайсинга, мРНК. Результаты экзона ПЦР (присутствуют во всех прекурсорах, промежуточных и продуктах, за исключением вырезанного лариата) не показаны на графиках, так как это было использовано для нормализации данных и поэтому всегда равно 1. (b) Непрерывная тиомаркировка. Количество pre-mRNA увеличивается с течением времени, как 4tU включен транскрипции и, после короткой задержки, сращивание преобразует его в lariat-exon2 промежуточных и сплайсированных продуктов. Уровни этих видов pre-mRNA и lariat обнаруживаются выше фона после всего лишь 15 с роста с 4tU и достигают максимума после примерно 45 с непрерывной маркировки с 4tU, после чего их производство уравновешивается путем преобразования в сращивание мРНК и/или деградации. Значения нормализуются до их устойчивого состояния (левая самая точка графика), и экзон 2 уровней, чтобы показать их внешний вид и обработки по сравнению с транскрипцией экзона 2. Поскольку РНК сплайсинг ACT1 в значительной степени совместно транскрипционального4,17 сращивания мРНК быстро становится наиболее распространенным видом, его уровень похож на экзон 2. Стандартная ошибка трех биологических репликаций, каждая из которых была повторена в тройном. (c) Пульс/погоня. Тиолация пульс 25 секунд с погоней с уридином. По сравнению с устойчивым уровнем состояния этих РНК (самая левая точка), они изначально очень обильны ею в недавно синтезированном пуле. Уровни постепенно снижаются по мере их обработки в мРНК (или деградированных), приближающихся к уровням, очень похожим на стабильные уровни состояния на 5 мин. Стандартная ошибка трех биологических репликаторов, каждая из которых была рассмотрена в тройном. (d) нсРНК и истощение белка. Сращивание стенограмм ACT1 до мРНК контролируется количественной обратной транскрипции ПЦР, как в панели (a) при истощении белка Prp16 с использованием системы auxin degron, как описано на рисунке 2. Уровни белка Prp16 также отображаются на графике, построенном на фоне второй оси Y в процентах от уровней до истощения auxin. Prp16 является жизненно важным компонентом spliceosome, особенно важно для второгошага сращивания показано в панели (a ), после чего lariats деградируют. Когда этот шаг становится ограничивающим lariats накапливаются первоначально. В более позднее время сращивания точек полностью не удается, lariats больше не производятся и до мРНК уровни поднимаются. Ошибки баров являются стандартной ошибкой трех биологических репликаций, каждый анализ в тройной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Графическое резюме разделов протокола от 1 до 3. Клетки тиокулируются с 4tU и позволили расти, чтобы включить модифицированный нуклеотид в РНК. Thiolated S. pombe шип может быть добавлен, чтобы позволить нормализации через временные точки и экспериментов. Пульс 4tU можно преследовать с помощью оон-thiolated уридин. Маркировка может быть выполнена непрерывно от добавления 4tU или от изменения к условиям роста, разделению культуры и 4tU добавленным к культурам на увеличивая временах от изменения условия роста, но каждая маркировка только на краткое время. Клетки собираются, и РНК подготовлены из клеток, предпочтительно с использованием гомогенизатора и фенола основе методов. РНК биоинцинатируется, а затем биоинтинилационная РНК очищается от неинкорпорированного биотина с помощью столбца исключения размера. НСРНК теперь готова к очищению стрептавидином бисером (раздел 4, рисунок5). Номера в красном соответствуют числам шагов в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Графическое резюме раздела 4 протокола. Далее из разделов 1 до 3(Рисунок4), стрептавидин бисер блокируется и биотинилация РНК образец добавляется в подготовленные бусы. Биотинилапотированная РНК связывается с стрептавидиновыми бусинами и небиотинилатной РНК удалены и промываются. Биотинилатированная РНК вымывается из бисера с помощью ЗМЭ и осаждается готовой к дальнейшим исследованиям. Номера в красном соответствуют числам шагов в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная диаграмма 1: Улучшение восстановления nsRNA из дрожжевых клеток с и без дополнительных копий импортера на 1 и 3 минуты thio-маркировки. Обратите внимание, что Fui1 является собственным промоутером дрожжей, выраженным из 2 мкм плазмида. Геномная копия этого гена присутствует в обоих этих штаммах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная рисунок 2: Анимированная версия графического протокола q-est AID 4U-est AID 4U. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: 4tU-experiment-template.xltx. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Плазмида имя Импортер/пермяки Маркер Комментарий
p4Fui S. cerevisiae Fui1 URA3 Fui1 импортирует Uracil и Uridine, что делает его идеальным для экспериментов пульса/погони.
pAT2 S. cerevisiae Fui1 LEU2
p4Fui-ЗПЕСТ S. cerevisiae Fui1 URA3 Мотив PEST Fui1 был деактивирован, поэтому пермяк и не деградирует, когда имеется достаточно внутриклеточного урацила для нужд клетки. Работает хорошо в маркировке экспериментов и улучшает импульс / погони производительности.
p4Fur S. cerevisiae Fur4 URA3 Урацил пермяки
YEpEBI311 H. Sapiens ENT1 LEU2 Миллер и др.11. Также содержит ген thymidine киназы HSV.
(эквилибриативный нуклеозидный транспортер)
Все плазмиды на основе 2 мкм. Все плазмиды p4 и PAT основаны на pRS16 серии плазмидов. FUI1 и FUR4 выражаются от собственных эндогенных промоутеров.

Таблица 1: Плазмиды, используемые в этом протоколе.

Discussion

Эта статья представляет протокол для чрезвычайно быстрой и конкретной маркировки 4tU, для восстановления зарождающейся, недавно синтезированной РНК от S. cerevisiae после всего лишь 15 с маркировки, с очень низким загрязнением немаркированной РНК.

Пользователь всегда должен заботиться о поддержании целостности РНК с помощью низких температур и DEPC обработанных реагентов. Очистка грядки стрептавидина, как правило, надежна; однако, буфер биса трудн для того чтобы отрегулировать; он должен быть сделан заново, с его компонентами добавлены в правильном порядке, а не охлажденным или автоматически. Общие недостатки включают РНК неполно растворяется после выпадения шагов, и поэтому либо не биотиниляции или иным образом потеряли во время обработки шагов. Существует обширная помощь по устранению неполадок в дополнительном материале.

Есть некоторые ограничения, чтобы быть в курсе в ers4tU. Один из уже упомянутых является то, что 4tU замедляет рост дрожжей(Рисунок 1a). Помимо эндогенно thiolated РНК9, только РНК, которые были транскрибированы в период маркировки могут быть очищены с помощью этого метода. Полимеразы, приостановленные на генах на протяжении всего времени тиолации, не будут производить thiolated транскрипты, которые могут быть очищены, хотя транскрипты, которые частично помечены из-за полимеразы ввода или оставить приостановленное состояние во время тиолации могут быть восстановлены. Штаммы, которые транскрибируют плохо, либо из-за мутации или условия роста, производят мало nsRNA, хотя методы, используемые здесь, тем не менее улучшить восстановление nsRNA по сравнению с другими методами. Более длительные времена и увеличение объема культуры могут быть необходимы в этих штаммов и условий. Обратите внимание, что uracil является хорошим источником азота и поэтому этот метод должен быть опробован перед использованием для исследований, связанных с голодом азота.

Протокол ers4tU особенно полезен для анализа недолговечных РНК, многие из которых настолько быстро деградируют, что их невозможно идентифицировать без нанесения поврачного механизма деградации. Примеры включают загадочные нестабильные стенограммы (CUTs)4, и короткие стенограммы, подготовленные преждевременного прекращения или промоутер проксимальной паузы18 и антисмысл транскрипции "вверх по течению" от промоутера (PROMPTs)19. Промежуточные, производимые при обработке стабильных видов РНК, также преходящи, но могут быть обогащены с помощью транскрипции ers4tU4. Таким образом, протокол ers4tU является исключительным в разрешении высокопреходящих видов РНК, которые будут проанализированы и захвачены в почти физиологических условиях, что является огромным преимуществом по сравнению с другими методами. Этот метод был использован для изучения транскрипции и вниз по течению РНК обработки кинетики в РНК-полимеразы мутантов, которые удлиняют быстрее или медленнее, чем обычно20.

Тиоляция также совместима с РНК-сек и SLAM-seq21, что позволяет все РНК производится в течение очень короткого времени, чтобы быть охарактеризованы в изысканных деталей.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Wellcome финансирования JB (104648). Работа в Wellcome Центр клеточной биологии поддерживается Wellcome основного финансирования (092076). Авторы признают членов лаборатории за их помощь: Белла Модлин, Эмануэла Сани, Сюзанна Де Лукас-Ариас и Shiney Джордж. Авторы также хотели бы поблагодарить Патрика Крамера за плазменных YEpEBI31111.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol (βME) Sigma-Aldrich M3148 CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use
Chloroform Sigma-Aldrich 25668 CAUTION toxic
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave
DMF (N,N-dimethylformamide)  Sigma-Aldrich 227056 CAUTION toxic
EDTA Sigma-Aldrich 3609 Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide
Ethanol Sigma-Aldrich 29221
EZ-link HPDP Biotin Thermo scientific 21341 Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend.
Glucose Fisher Scientific  G/0500/60
Glycogen [20 mg/mL] Sigma-Aldrich 10901393001 Store at -20 °C
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel Thermo Scientific 77712 Optional
LiCl Sigma-Aldrich 793620 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 63033 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.
Methanol Fisher Scientific M/4000/PC17 CAUTION Toxic and flammable
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139 Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264
NaCl Sigma-Aldrich S9888-M 5 M solution
Phenol, low pH.   Sigma-Aldrich P4682 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.  Sigma-Aldrich P1944 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Pierce Spin Columns Thermo Scientific 69702 Optional
SCSM single drop-out –ura Formedium  DSCS101
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 32318-M Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429 CAUTION corrosive
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Sigma-Aldrich 436143 CAUTION irritant, do not inhale
Streptavidin Magnetic beads NEB 1420S Store at 4°C 
SUPERase-In, RNase inhibitor Life technologies  AM2696 Store at -20°C
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike See section 1.7 of the protocol
4-thiouracil (4tU)  ACROS ORGANICS 359930010 Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. 
Tris base Sigma-Aldrich 93362 1 M solutions at various pH
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001 5mg/ml, store at -20°C
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.
Yeast nitrogen base without amino acids  with amonium sulphate Formedium CYN0410
Zeba Columns 0.5ml Thermo Scientific 89882 Store at 4 °C 
Zirconia beads Thistle Scientific 110791052
Equipment and Consumables
Beadbeater Biospec 112011EUR Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g 
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist 
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end 
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended 
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL Eppendorf H179467N
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL Ambion AM12350
Tubes, centrifuge, 50 mL  Sarstedt 62.547.004 Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss
Tubes, centrifuge, 15 mL  Sarstedt 62.554.001
Tubes, 2 mL, screw cap Greiner 723361
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids Brand 781332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10, (1), e1513 (2018).
  2. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).
  3. Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).
  4. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  5. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).
  6. Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast. Yeast (Chichester England). 36, (1), 75-81 (2018).
  7. Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  8. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  9. Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression. Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).
  10. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).
  13. Rädle, B., et al. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  14. Herzog, V. A., et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).
  15. Ohrt, T., et al. Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system. RNA. 19, 902-915 (2013).
  16. Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
  17. Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast. RNA. 23, 601-610 (2017).
  18. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).
  19. Preker, P., et al. RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters. Science. 322, 1851-1854 (2008).
  20. Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast. Genome Research. 28, 203-213 (2018).
  21. Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding. Nature Methods. 15, 221-225 (2018).
Чрезвычайно быстрая и специфическая метаболическая маркировка РНК in Vivo с 4-Thiouracil (Ers4tU)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).More

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter