Användningen av thiolated uracil att känsligt och specifikt rena nyligen transkriberade RNA från jästen Saccharomyces cerevisiae.
Nukleotidanalog, 4-thiouracil (4tU), är lätt tas upp av celler och införlivas i RNA som det transkriberas in vivo, vilket möjliggör isolering av RNA som produceras under en kort period av märkning. Detta görs genom att fästa en biotin-enhet till den inkorporerade Thio-gruppen och affinitetsrening med hjälp av konjugerat belagda pärlor. Att uppnå en god avkastning av rent, nyligen syntetiserade RNA som är fritt från befintligt RNA gör kortare märknings tider möjliga och medger ökad temporala upplösning i kinetiska studier. Detta är ett protokoll för mycket specifika, hög avkastning rening av nyligen syntetiserade RNA. Det protokoll som presenteras här beskriver hur RNA utvinns ur jästen Saccharomyces cerevisiae. Emellertid, protokollet för rening av thiolated RNA från totalt RNA bör vara effektiva med hjälp av RNA från någon organism när den har extraherats från cellerna. Det renade RNA lämpar sig för analys av många allmänt använda tekniker, såsom omvänt transkriptas-qPCR, RNA-SEQ och SLAM-SEQ. Specificiteten, känsligheten och flexibiliteten hos denna teknik möjliggör oöverträffad insikt i RNA-metabolism.
RNA har en dynamisk karaktär; strax efter det produceras mycket RNA snabbt bearbetas och degraderas. För närvarande, de flesta studier av RNA-metabolism analysera det totala cellulära RNA, som är mestadels helt bearbetas och på steady state nivå. Denna nivå beror på balansen mellan överföringshastigheter, posttranskriptionell mognad och nedbrytning. Analys av de processer som leder till steady state jämvikt kräver specialiserade tekniker för att fånga mycket kortlivade RNA-arter.
Metabolisk märkning av RNA med nukleotidanaloger såsom 4-thiouracil (4tU) eller 4-tiouridin (4sU) (se Duffy et al.1 för en utmärkt översyn), erbjuder förmågan att isolera Thio-märkta begynnande rnas och deras bearbetning intermediärer. Publicerade protokoll omfattar dock märknings tider på flera minuter, varav2,3, vilket är långsamt i förhållande till produktionstakten för många utskrifter. Det tar i storleksordningen en minut att transkribera den genomsnittliga jästgenen, så märkning jäst RNA för mindre än en minut kan anses extremt kort. Den extremt snabba och specifika 4 thiouracil Protocol (ers4tU) maximerar signalen till brus förhållandet genom att maximera 4tU inkorporering och minimera återhämtningen av omärkta, redan existerande RNA gör mycket korta märknings tider möjligt4.
Den Thio-modifierade basen måste importeras till cellerna snabbt och i tillräcklig mängd för att effektivt märka det nya syntetiserade RNA (nsRNA). För att främja detta, celler odlas i uracil-fritt medium, och uttryck för en lämplig permease bidrar till att öka 4tU eller 4sU upptag (se tabell 1 för en lista över plasmider som bär lämpliga permease gener och kompletterande figur 1). 4Tuär löslighet i natriumhydroxid undviker behovet av giftiga organiska lösningsmedel som krävs av andra nukleotidanaloger. Tyvärr har odlingskulturer under långa perioder med tio-modifierade nukleosider vid koncentrationer som är större än 50 μM observerats för att störa ribosomerna5. Men den koncentration (10 μM) som används här, och de extremt korta märknings tiderna, minimerar skadliga effekter5 (figur 1a), samtidigt som det ger tillräckligt med RNA för analys.
Denna teknik kan kombineras med snabb och specifik auxin-medierad utarmning av ett målprotein6,7 (figur 2), kallat “β-Est Aid 4U”-protokollet, där β-estradiol reglerade uttrycket av auxin inducerbara degron (Aid) systemet kombineras med 4tu märkning. Med β-Est AID 4U-metoden kan ett målprotein töms och effekten på RNA-metabolismen övervakas noggrant (figur 2). Tidpunkten är kritisk; Det är tillrådligt att se den medföljande videon och ägna mycket uppmärksamhet åt figur 2 och dess animerade form (se kompletterande figur 2).
Bearbetning och nedbrytning av RNA måste stoppas extremt snabbt för noggrann tidsupplösning. Detta uppnås med hjälp av metanol vid låg temperatur, vilket fixar cellinnehållet mycket snabbt och försämrar cellmembranet samtidigt som nukleinsyrthalten bibehålls8. RNA-extraktionen ska vara effektiv och inte skada RNA. Mekanisk Lys är effektiv i avsaknad av chaotropic agenter (ofta dessa innehåller Thio grupper, så bör undvikas). Litium klo RID utfällning av RNA föredras, eftersom tRNAs är mindre effektivt utfälld. tRNAs är snabbt transkriberade och naturligt tiolated9, så att ta bort tRNAs minskar konkurrensen om biotinylering reagens. Om små, mycket strukturerade RNAs är av intresse, rekommenderas alkoholbaserade RNA-utfällnings metoder.
För att återvinna det thiolated RNA, biotin är kovalent fäst via Thio grupper införlivas i RNA med 4tU. Användning av modifierad biotin, som fäster via en klyvbar disulfid obligation (t. ex., HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)propionamid,) eller MTS-biotin (metan tiosulfonat)) rekommenderas som det tillstånd frigörare av RNA vid tillägg av ett reducerande medel. Den en RNA är affinitet renas på konjugerat kopplad till magnetiska pärlor. Detta protokoll liknar andra som listas tidigare10 men har intensivt optimerats för att minska bakgrunden.
Det finns två typer av tiol-märkning experiment som kan utföras, kontinuerlig och diskontinuerlig märkning. Var och en har sina egna fördelar. Vid kontinuerlig märkning läggs 4tU till i kulturen och proverna tas med jämna mellanrum. Den här typen av experiment visar hur RNA bearbetas och hur nivåerna ändras över tid. Exempel på detta är jämförelse av Mutant med Wild-Type experiment och ett puls-Chase experiment. Experimenten som visas i figur 3b, c är av denna typ. För diskontinuerlig märkning framkallas en ändring in i systemet, och RNA övervakade. När förändringen har inducerats måste kulturen delas upp i flera subkulturer, och vid bestämda tidpunkter är var och en sedan tio-märkt under en kort period. Ett exempel är β-Est AID 4U som visas i figur 27. Denna typ av experiment är särskilt användbart för att övervaka effekten av en metabolisk förändring på RNA-bearbetning (se figur 3D).
En grafisk representation av en Thio-märkning experiment presenteras i figur 4 och figur 5, och ett kalkylblad som förenklar protokollets prestanda är tillgänglig (se 4tu experiment Template. xlsx). Förutom detta innehåller tilläggsinformationen en omfattande felsökningsguide. För det β-Est AID 4U-protokoll som integrerar 4tU-märkning med auxin-utarmningsprotokollet, se figur 2 och kompletterande figur 2. Se Barrass et al.7 för detaljerad hjälp utarmning protokoll.
Denna artikel presenterar ett protokoll för extremt snabb och specifik 4tU märkning, för återvinning av begynnande, nyligen syntetiserade RNA från S. cerevisiae efter så lite som 15 S av märkning, med mycket låg förorening av OMÄRKTA RNA.
Användaren bör alltid vara noga med att bibehålla integriteten hos RNA genom användning av kalla temperaturer och DEPC-behandlade reagenser. Streptavidin pärla rening är i allmänhet tillförlitlig; dock är pärlbufferten svår att hantera; Det måste göras nytt, med dess delar som tillfogas i det rätt beställer, och inte kylt eller autoklaverat. Vanliga brister inkluderar RNA är ofullständigt upplöst efter nederbörden steg, och så är antingen inte en eller på annat sätt förlorat under bearbetningen steg. Det finns omfattande felsökningshjälp i tilläggsmaterialet.
Det finns vissa begränsningar att vara medveten om i ers4tU. En redan nämnt är att 4tU saktar tillväxten av jästen (figur 1a). Bortsett från den endogent tiolerade rnas9kan endast rnas som har transkriberats under märknings perioden renas med denna metod. Polymeraser som pausas på gener under tiolationstid kommer inte att producera tiolerade utskrifter som kan renas, även om utskrifter som är delvis märkta på grund av polymeraser som kommer in i eller lämnar ett pausat tillstånd under tiolation kan återvinnas. Stammar som transkribera dåligt, antingen på grund av mutation eller tillväxtförhållanden, producera lite nsRNA, även om de tekniker som används här kommer ändå att förbättra återhämtningen av nsRNA jämfört med andra metoder. Längre tider och ökade kultur volymer kan vara nödvändiga i dessa stammar och villkor. Observera att uracil är en bra källa till kväve och därför bör denna metod trialed innan den används för studier med kväve svält.
Protokollet ers4tU är särskilt användbart för analys av kortlivade RNAs, av vilka många är så snabbt försämrade att de inte kan identifieras utan att nedbrytande maskineriet förlamats. Exempel är kryptiska instabila utskrifter (nedskärningar)4, och korta utskrifter som produceras av förtida uppsägning eller promotor proximalt pausa18 och antisense transkription “uppströms” från en promotor (prompter)19. Intermediaterna som produceras under bearbetningen av stabila RNA-arter är också övergående men kan berikas med ers4tU transkription4. Protokollet ers4tU är därför exceptionellt när det tillåter mycket övergående RNA-arter att analyseras och fångas under nära fysiologiska förhållanden, vilket är en stor fördel jämfört med andra metoder. Denna teknik har använts för att studera transkription och nedströms RNA bearbetning kinetik i RNA-polymeras mutanter som elongate snabbare eller långsammare än normalt20.
Thiolation är också kompatibel med RNA-SEQ och SLAM-SEQ21, vilket gör att alla RNA produceras inom en mycket kort tid fönster för att kännetecknas i utsökt detalj.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Wellcome-finansiering till JB [104648]. Arbetet i Wellcome centrum för cell bio Logi stöds av Wellcome Core-finansiering [092076]. Författarna erkänner medlemmarna i labbet för deras hjälp: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias och SHINEY George. Författarna skulle också vilja tacka Patrick Cramer för plasmid YEpEBI31111.
β-mercaptoethanol (βME) | Sigma-Aldrich | M3148 | CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 25668 | CAUTION toxic |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave |
DMF (N,N-dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | 227056 | CAUTION toxic |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 29221 | |
EZ-link HPDP Biotin | Thermo scientific | 21341 | Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend. |
Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
Glycogen [20 mg/mL] | Sigma-Aldrich | 10901393001 | Store at -20 °C |
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel | Thermo Scientific | 77712 | Optional |
LiCl | Sigma-Aldrich | 793620 | 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly. |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63033 | 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly. |
Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-M | 5 M solution |
Phenol, low pH. | Sigma-Aldrich | P4682 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH. | Sigma-Aldrich | P1944 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
Pierce Spin Columns | Thermo Scientific | 69702 | Optional |
SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | 32318-M | Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | CAUTION corrosive |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Sigma-Aldrich | 436143 | CAUTION irritant, do not inhale |
Streptavidin Magnetic beads | NEB | 1420S | Store at 4°C |
SUPERase-In, RNase inhibitor | Life technologies | AM2696 | Store at -20°C |
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike | See section 1.7 of the protocol | ||
4-thiouracil (4tU) | ACROS ORGANICS | 359930010 | Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. |
Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | 1 M solutions at various pH |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | 5mg/ml, store at -20°C |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C. |
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 | |
Zeba Columns 0.5ml | Thermo Scientific | 89882 | Store at 4 °C |
Zirconia beads | Thistle Scientific | 110791052 | |
Equipment and Consumables | |||
Beadbeater | Biospec | 112011EUR | Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established. |
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA. | |||
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible. | |||
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g | |||
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist | |||
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark. | |||
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end | |||
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended | |||
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL | Eppendorf | H179467N | |
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL | Ambion | AM12350 | |
Tubes, centrifuge, 50 mL | Sarstedt | 62.547.004 | Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss |
Tubes, centrifuge, 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 | |
Tubes, 2 mL, screw cap | Greiner | 723361 | |
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids | Brand | 781332 |