Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Extremt snabb och specifik metabolisk märkning av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)

doi: 10.3791/59952 Published: August 22, 2019

Summary

Användningen av thiolated uracil att känsligt och specifikt rena nyligen transkriberade RNA från jästen Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Nukleotidanalog, 4-thiouracil (4tU), är lätt tas upp av celler och införlivas i RNA som det transkriberas in vivo, vilket möjliggör isolering av RNA som produceras under en kort period av märkning. Detta görs genom att fästa en biotin-enhet till den inkorporerade Thio-gruppen och affinitetsrening med hjälp av konjugerat belagda pärlor. Att uppnå en god avkastning av rent, nyligen syntetiserade RNA som är fritt från befintligt RNA gör kortare märknings tider möjliga och medger ökad temporala upplösning i kinetiska studier. Detta är ett protokoll för mycket specifika, hög avkastning rening av nyligen syntetiserade RNA. Det protokoll som presenteras här beskriver hur RNA utvinns ur jästen Saccharomyces cerevisiae. Emellertid, protokollet för rening av thiolated RNA från totalt RNA bör vara effektiva med hjälp av RNA från någon organism när den har extraherats från cellerna. Det renade RNA lämpar sig för analys av många allmänt använda tekniker, såsom omvänt transkriptas-qPCR, RNA-SEQ och SLAM-SEQ. Specificiteten, känsligheten och flexibiliteten hos denna teknik möjliggör oöverträffad insikt i RNA-metabolism.

Introduction

RNA har en dynamisk karaktär; strax efter det produceras mycket RNA snabbt bearbetas och degraderas. För närvarande, de flesta studier av RNA-metabolism analysera det totala cellulära RNA, som är mestadels helt bearbetas och på steady state nivå. Denna nivå beror på balansen mellan överföringshastigheter, posttranskriptionell mognad och nedbrytning. Analys av de processer som leder till steady state jämvikt kräver specialiserade tekniker för att fånga mycket kortlivade RNA-arter.

Metabolisk märkning av RNA med nukleotidanaloger såsom 4-thiouracil (4tU) eller 4-tiouridin (4sU) (se Duffy et al.1 för en utmärkt översyn), erbjuder förmågan att isolera Thio-märkta begynnande rnas och deras bearbetning intermediärer. Publicerade protokoll omfattar dock märknings tider på flera minuter, varav2,3, vilket är långsamt i förhållande till produktionstakten för många utskrifter. Det tar i storleksordningen en minut att transkribera den genomsnittliga jästgenen, så märkning jäst RNA för mindre än en minut kan anses extremt kort. Den extremt snabba och specifika 4 thiouracil Protocol (ers4tU) maximerar signalen till brus förhållandet genom att maximera 4tU inkorporering och minimera återhämtningen av omärkta, redan existerande RNA gör mycket korta märknings tider möjligt4.

Den Thio-modifierade basen måste importeras till cellerna snabbt och i tillräcklig mängd för att effektivt märka det nya syntetiserade RNA (nsRNA). För att främja detta, celler odlas i uracil-fritt medium, och uttryck för en lämplig permease bidrar till att öka 4tU eller 4sU upptag (se tabell 1 för en lista över plasmider som bär lämpliga permease gener och kompletterande figur 1). 4Tuär löslighet i natriumhydroxid undviker behovet av giftiga organiska lösningsmedel som krävs av andra nukleotidanaloger. Tyvärr har odlingskulturer under långa perioder med tio-modifierade nukleosider vid koncentrationer som är större än 50 μM observerats för att störa ribosomerna5. Men den koncentration (10 μM) som används här, och de extremt korta märknings tiderna, minimerar skadliga effekter5 (figur 1a), samtidigt som det ger tillräckligt med RNA för analys.

Denna teknik kan kombineras med snabb och specifik auxin-medierad utarmning av ett målprotein6,7 (figur 2), kallat "β-Est Aid 4U"-protokollet, där β-estradiol reglerade uttrycket av auxin inducerbara degron (Aid) systemet kombineras med 4tu märkning. Med β-Est AID 4U-metoden kan ett målprotein töms och effekten på RNA-metabolismen övervakas noggrant (figur 2). Tidpunkten är kritisk; Det är tillrådligt att se den medföljande videon och ägna mycket uppmärksamhet åt figur 2 och dess animerade form (se kompletterande figur 2).

Bearbetning och nedbrytning av RNA måste stoppas extremt snabbt för noggrann tidsupplösning. Detta uppnås med hjälp av metanol vid låg temperatur, vilket fixar cellinnehållet mycket snabbt och försämrar cellmembranet samtidigt som nukleinsyrthalten bibehålls8. RNA-extraktionen ska vara effektiv och inte skada RNA. Mekanisk Lys är effektiv i avsaknad av chaotropic agenter (ofta dessa innehåller Thio grupper, så bör undvikas). Litium klo RID utfällning av RNA föredras, eftersom tRNAs är mindre effektivt utfälld. tRNAs är snabbt transkriberade och naturligt tiolated9, så att ta bort tRNAs minskar konkurrensen om biotinylering reagens. Om små, mycket strukturerade RNAs är av intresse, rekommenderas alkoholbaserade RNA-utfällnings metoder.

För att återvinna det thiolated RNA, biotin är kovalent fäst via Thio grupper införlivas i RNA med 4tU. Användning av modifierad biotin, som fäster via en klyvbar disulfid obligation (t. ex., HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)propionamid,) eller MTS-biotin (metan tiosulfonat)) rekommenderas som det tillstånd frigörare av RNA vid tillägg av ett reducerande medel. Den en RNA är affinitet renas på konjugerat kopplad till magnetiska pärlor. Detta protokoll liknar andra som listas tidigare10 men har intensivt optimerats för att minska bakgrunden.

Det finns två typer av tiol-märkning experiment som kan utföras, kontinuerlig och diskontinuerlig märkning. Var och en har sina egna fördelar. Vid kontinuerlig märkning läggs 4tU till i kulturen och proverna tas med jämna mellanrum. Den här typen av experiment visar hur RNA bearbetas och hur nivåerna ändras över tid. Exempel på detta är jämförelse av Mutant med Wild-Type experiment och ett puls-Chase experiment. Experimenten som visas i figur 3b, c är av denna typ. För diskontinuerlig märkning framkallas en ändring in i systemet, och RNA övervakade. När förändringen har inducerats måste kulturen delas upp i flera subkulturer, och vid bestämda tidpunkter är var och en sedan tio-märkt under en kort period. Ett exempel är β-Est AID 4U som visas i figur 27. Denna typ av experiment är särskilt användbart för att övervaka effekten av en metabolisk förändring på RNA-bearbetning (se figur 3D).

En grafisk representation av en Thio-märkning experiment presenteras i figur 4 och figur 5, och ett kalkylblad som förenklar protokollets prestanda är tillgänglig (se 4tu experiment Template. xlsx). Förutom detta innehåller tilläggsinformationen en omfattande felsökningsguide. För det β-Est AID 4U-protokoll som integrerar 4tU-märkning med auxin-utarmningsprotokollet, se figur 2 och kompletterande figur 2. Se Barrass et al.7 för detaljerad hjälp utarmning protokoll.

Protocol

1. tillväxt och tio-märkning

Obs: tiden för slutförandet av detta avsnitt av protokollet är mycket varierande, beroende på celltillväxt takt. Låt 1 h förbereda lösningarna och utrustningen före tio-märkningen och 30 min efter märkning för att bearbeta proverna.

  1. Se till att S. cerevisiae stammen innehåller en Plasmid kodning en permease (tabell 1) för att öka 4tu importera till cellen.
    Anmärkning: utan importör är det osannolikt att märkningen för mindre än 2 minuter kommer att lyckas11 (se kompletterande figur 1). 4tU inkorporering är effektivare om tillväxten är i medium utan uracil, så stammen måste vara URA3+; flera av plasmiderna i tabell 1 bär URA3 som markör. Om detta protokoll ska kombineras med β-Est-stöd utarmning7, krävs ytterligare stam ändringar.
  2. Förbered YMM uracil-fritt medium genom att tillsätta 6,9 g jäst kväve bas utan aminosyror, 20 g glukos, och 1,92 g av SCSM enda Drop-out − URA (tabell över material) till 1 L vatten. Autoklav eller filter sterilisera odlingsmediet före användning.
    Obs: filter sterilisering är att föredra som peptid/socker komplex som produceras av Autoklavera samfällning med cellerna i metanol som används i provinsamling.
  3. Odla jäst i YMM uracil-fritt medium till en optisk densitet vid 600 Nm (OD600) på 0,6 − 0,8. Se till att kulturen är i log fas tillväxt och har varit för minst två doublings. Tillväxt vid 30 ° c rekommenderas normalt, men andra temperaturer kan användas, till exempel för temperaturkänsliga stammar.
    Anmärkning: beroende på stam, tillväxtförhållanden och RNA-kapacitet kommer det att behövas cirka 30 mL provvolym. Detta belopp kommer att antas genom hela protokollet. 30 mL kultur är det mest som kommer att passa in i en 50 mL Centrifugera röret med 20 mL metanol, så är en bekväm volym för att starta optimering. Överväg att använda mer provvolym för tidiga tidpunkter för att öka RNA-återhämtning, upp till 2000 mL har använts för långsammare växande celler vid riktigt korta märknings tider (< 1 min).
  4. Chill ca 50 mL H2O på is. För varje prov, tillsätt 200 μL zirconia pärlor till en 2 mL skruv-Cap röret och kyla på isen. Också sätta 20 mL metanol (försiktighet), i 50 mL Centrifugera rör, och placera på torris (försiktighet). Metanol bör vara 1/3 till 2/3 volymen av provet.
    FÖRSIKTIGHET: metanol är giftigt vid inandning, kontakt och konsumtion. Fördela stora volymer i en draghuv och Använd två par handskar, eftersom metanol kan penetrera nitrilhandskar. Metanol är mycket brandfarlig, Förvaras åtskilt från alla antändningskällor.
    Obs: eftersom torris kan orsaka köld brännskador vid kontakt och producerar asfixiant gas, Använd handskar vid hantering och användning i ett väl ventilerat utrymme.
    Notera: att lägga till pärlorna vid denna punkt är lättare än efter provet har lagts till som röret är torrt och när spinning ner cellen pellet pärlorna är också spunnet klart av röret tråden spara lite tid. Dessutom, detta gör att pärlorna svalna innan provet läggs.
  5. Om en s. pombe Spike skall läggas till kulturen (snarare än senare), Tina en alikvot av tiolated s. pombe celler på is och Vortex grundligt, minst 30 S, sedan lägga till kulturen. Om en S. pombe -alikvot bereds enligt nedanstående instruktioner räcker det för 400 ml kultur (tillräckligt för 12 30 ml-prover plus lite för att möjliggöra fel vid hantering). Om mer eller mindre kultur används, justera volymen av S. pombe läggas till kulturen.
    1. Odla 1 L av s. pombe kultur till OD600 till 0,8 exakt som beskrivs i protokollet för s. cerevisiae.
    2. Thio-Label som steg 1,7, men för 10 min.
    3. Fix all kulturen med 400 mL metanol på torris, i huvudsak som beskrivs i steg 1,9.
    4. Pelleten cellerna genom centrifugering vid 3000 x g i 3 min.
    5. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 3,3 mL H2O.
    6. Delas upp i alikvoter på 80 μL vardera. Förvaras vid-80 ° c.
    7. Använd hela en alikvot för 400 mL-odling eller 10 μL per 30 mL-prov.
      Obs: minska volymen av Spike till 1/10 om du utför rnaseq. Återanvänd inte alikvoter; Kassera all oanvänd spik. Den här spetsen är användbar för att normalisera och jämföra resultat över tidspunkter och experiment.
  6. För icke-kontinuerlig märkning, framkalla den metaboliska störning som krävs (t. ex. tillväxtförhållanden, gen induktion eller utarmning såsom β-Est AID7 (figur 2 och kompletterande figur 2) och dela sedan upp kulturen. Se till att alla flaskor och media är vid erforderlig temperatur och, om möjligt, lufta mediet innan du lägger till kulturen.
  7. Tillsätt 4tU till kulturen till en koncentration av 10 μmM och blanda kraftigt (1/10 000 av kultur volymen 100 mm 4tu upplöst i 1 M NaOH). Tiol-etikett för 15 s till 5 min.
    Obs: trettio sekunder är en bra utgångspunkt. Tio-märkning för mindre än 20 s ger mer varierande resultat på grund av svårigheter att manipulera kulturen under tidspress. Märkning för mer än 1 min minskar dock den tidsmässiga upplösningen av tekniken.
  8. Om ett Chase-experiment ska utföras, Tillåt tio-märkning för 20 − 30 s sedan jaga genom att tillsätta 1/200 kultur volym av 1 M uridin (inte tiolated), till en slutlig koncentration av 5 mm.
    Obs: uridin är att föredra att uracil för jakten, som uridin är mer vattenlöslig tillåter en mindre volym som skall läggas till kulturen och så det finns mindre störningar i tillväxten av cellerna.
  9. Ta prover av kulturen med jämna mellanrum (minst 15 s), till slutet av tidsförloppet. Provtagningsintervall som är kortare än så är svåra att utföra på ett tillförlitligt sätt. Tillsätt provet till metanol på torris som bereds i steg 1,4. För enkelhetens skull, tillsätt 30 mL kultur till en 50 mL tub som innehåller 20 mL metanol.
    Obs: koldioxiden löses upp i metanol när den är kall. Detta kommer ur lösningen på tillsats av provet och skum kraftigt vid blandning ― vilket resulterar i prov förlust. För att undvika detta, kyla metanol till <-70 ° c i ett tätt förseglat rör tills nära den tid det behövs, sedan överföra till torris.
  10. Försegla röret och blanda ordentligt genom att skaka. Placera proverna på isen. Kontrollera att inget av proverna har frysts; om så är, försiktigt varm i handen, Invertera hela tiden. Detta görs bäst i handen eftersom provets temperatur kan bedömas, det ska alltid kännas kallt. Plats på isen. Detta är inte en paus punkt; När alla provet är flytande gå vidare till nästa steg.
  11. Snurra på 3000 x g i 2 min (vid 4 ° c om möjligt) för att pelleten cellerna. Häll av vätskan och Omsuspendera pelleten i minst 1 mL iskallt vatten genom att försiktigt Pipettera upp och ner.
    Anmärkning: restmetanol i provet pellets stöd resuspension.
  12. Överför till 2 mL skruvlock rör som bereds i steg 1,4. Snurra kort (t. ex. 10 s total tid) på > 13000 x g för att åter pelleten cellerna, placera tillbaka på isen och ta bort vätskan.
    Notera: cellpelleten kan förvaras vid-70 till-80 ° c i flera månader.

2. beredning av totalt RNA

Obs: tiden för slutförandet är 90 min.

  1. Använd dietylenpyrokarbonat (DEPC)-behandlade lösningar för att skydda RNA från nedbrytning. Aliquot lösningarna med hjälp av filterpipettspetsar och Använd handskar hela tiden.
    1. Till en lösning tillsätt 1/1000 volym DEPC och blanda genom kraftig skakning.
    2. Lämna i rumstemperatur (RT) för 24 h, sedan autoklav.
    3. Lösningar med amingrupper (t. ex. Tris) kan inte behandlas med DEPC. Aliquot pulvret och förvara speciellt för RNA-arbete. Använd tidigare DEPC behandlade H2O för att göra lösningen.
      Obs: eftersom Thio-gruppen på RNA är photoactivatable, minimera exponeringen för UV-ljus från denna punkt på. Lagringen ska vara i mörker och inkubering görs bäst i en PCR-maskin med lock.
  2. Om en S. pombe Spike ska läggas till cellpelleten i stället för kulturen (gör inte båda), Lägg till den nu. Tina en alikvot av de tiolerade S. pombe -cellerna på isen och Vortexblanda grundligt, minst 30 S, innan du lägger till pelleten.
    Anmärkning: om den bereds enligt steg 1.5.1 − 1.5.7, krävs 10 μL S. pombe -alikvot för en pellet som härrör från 30 ml kultur.
  3. Innan du sätter på locket, snurra mycket kort för 1 − 2 s för att säkerställa att inga zirconia pärlor fastnar mellan locket och röret, vilket kan orsaka prov och fenol att läcka från röret.
  4. Omsuspendera cellerna i 400 μl av acetat EDTA (AE) buffert (50 mm natriumacetat pH 5,3, 10 mm EDTA pH 8,0), genom vortexa kraftigt. Tillsätt 40 μL av 10% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS). Virvel inte, eftersom SDS kommer skum.
  5. Om β-Est AID 4U-protokollet ska användas, ta 40 μL av cellsuspensionen för proteinanalys7. Tillsätt 40 μL av AE för att göra volymen tillbaka upp till 400 μL.
  6. Tillsätt 800 μL fenol (försiktighet) vid lågt pH och virvel i 10 s.
    Varning: fenol är giftigt och frätande vid inandning och kontakt. Utför alltid procedurer med fenol i draghuv och Använd två par handskar.
  7. Lyse cellerna i en homogenisator (t. ex. tabell av material) för tre 2-min skurar vid den lägsta effekt inställningen. Lämna proverna på is för 2 min mellan pulser av homogenisering.
    Observera: optimera villkoren om du använder andra Homogenisatorer. Otillräcklig skakningar kommer att resultera i dålig avkastning, medan överdriven skakningar resulterar i uppenbara högre avkastning, som bestäms av absorbans vid 260 Nm (en260), men RNA kan brytas ned. En homogenisator är att föredra, men varm fenol RNA rening12 kan användas.
  8. Placera det lyserat provet på torris i 5 min, tills det stelnar, Detta minskar genomisk DNA föra över in i RNA. Får ej frysas under alltför lång tid eftersom provet inte kommer att Tina. Snurra 5 min i mikrofuge vid > 13000 x g vid RT; var inte frestad att göra detta vid 4 ° c, eftersom provet/fenolblandningen kommer att förbli solid under hela snurrandet om det utförs vid låg temperatur.
    Anmärkning: om provet fortfarande är fryst i slutet av spinn, re-spin för ytterligare 5 min tills provet har helt tinat.
  9. Fenol/kloroform extrahera sedan kloroform utdrag med en lika stor volym (ca 600 μL) av fenol: kloroform 5:1 sedan kloroform (försiktighet). Överför den övre fasen till ett annat rör som innehåller fenol: kloroform 5:1 eller kloroform. Vortex, snurra sedan i 5 minuter i en mikrofugrör vid RT. Överför sedan den övre fasen till ett nytt 1,5 mL-rör.
    Varning: kloroform är giftig vid inandning och kontakt. Utför alltid procedurer som involverar kloroform i en draghuv och Använd två par handskar.
  10. Tillsätt en tredjedel till halva volymen (cirka 300 μL) av 10 M LiCl, och blanda för att fälla RNA. Provet ska gå grumligt omedelbart men lämna i minst 10 min på is eller vid 4 ° c (förvara inte under-20 ° c som det kommer att frysa), eller tills fället flocalerar.
  11. Snurra i 5 min vid > 13000 x g i en microfuge. Ta bort vätskan, kort re-spin och ta bort dräggar. Tvätta pelleten med 300 − 500 μL 70% etanol, snurra kort och ta bort kvarvarande etanol.
    Obs: under dessa tvättar hålla pelleten på samma sida av röret som den första snurrande, detta sätt pelleten inte kommer att flytta och bryta; om det bryter en del av RNA kan förloras av misstag.
    Obs: torka inte pelleten; så länge som de flesta av vätskan har tagits bort det kommer inte att störa efterföljande steg. RNA kan också lagras i detta skede vid-20 ° c för ett par månader eller-70 till-80 ° c för långtidslagring.
  12. Återlös RNA-pelleten i 90 μL TE pH 7,0 (10 mM Tris HCl pH 7,0, 1 mM EDTA pH 8,0) genom upphettning vid 65 ° c med skakning eftersom RNA-pelleten kan vara svår att återlösa. Detta får inte vara mer än 5 min eftersom RNA bryts ned vid högre temperaturer. Kontrollera om full RNA solubilization och sedan överföra till en 0,2 mL tub. Pipettera provet uppåt och nedåt. Det bör inte finnas några "klumpar", och vätskan bör stiga och falla smidigt i spetsen. Denna lösning är trögflytande så den slutliga pipettering rörelse bör vara långsam.
    Anmärkning: RNA kan lagras vid-20 ° c i mörker i detta skede; Detta kan också vara fördelaktigt för RNA löslighet.

3. biotinylering

Obs: tiden för slutförandet är 60 min. Följande steg är bekvämt gjort i en remsa av rör med integrerade mössor eftersom de har mindre tendens att öppna på vortexa än remsor med separata mössor.

  1. Biotinylate genom att tillsätta 10 μL (1/10 slutlig volym) av en 5 mm hpdp-biotin lösning (MTS-biotin kan användas på exakt samma sätt som hpdp-biotin), till RNA och blanda grundligt. Värm RNA i högst några sekunder vid 65 ° c innan du lägger till biotin. Inkubera vid 65 ° c i 15 min till högst 30 min i mörker.
    Observera: denna uppvärmning krävs eftersom vissa HPDP-partier fälls ut vid RT i RNA-provet. Ett PCR-block med ett uppvärmt lock är idealiskt för detta.
  2. Förbered en liten harts volym, storlek uteslutning kolumn (tabell över material) att utesluta icke-inkorporerade biotin. Ta bort den undre etiketten på kolonnen och lossa locket, placera i ett 2 mL centrifugertub. Snurra på 1500 x g i 1 min för att spola ut bufferten Tillsätt 0,3 ml te försiktigt till toppen av kolonnen och snurra igen. Upprepa tvätt och snurra två gånger för totalt 3 tvättar. Slutligen överföra den tvättade kolonnen till en ny 1,5 mL tub.
  3. När provinkuberingen (steg 3,1) är slutförd lägger du till provet överst i kolumnen. Snurra på 1500 x g i 2 min. Den en RNA provet är nu i botten av röret.
    Obs: en 1 min spin är inte tillräckligt för att eluera hela provet.
  4. Tillsätt en tredjedel till hälften volym (cirka 40 μL) av 10 M LiCl, blanda för att åter fälla RNA som steg 2,10. Provet skall gå grumligt omedelbart men låt verka i minst 5 minuter på is eller vid 4 ° c eller tills fällmedlet flocalerar. Förvara inte under-20 ° c eftersom den fryser. Centrifugera provet i 5 minuter vid > 13000 x g i en mikrofuge.
  5. Tvätta med 80% etanol, ≤ 1 h roterande. Följ proceduren i steg 2,11 för att ta bort så mycket av vätskan som möjligt.
    Obs: som HPDP-biotin är mycket löslig i 80% etanol, detta är ett ytterligare reningssteg.
  6. Upprepa 80% etanol tvätt för att avlägsna så mycket un-Incorporated biotin som möjligt.
    Obs: RNA kan också lagras i detta skede vid-20 ° c i mörker.

4. rening av det nyligen syntetiserade RNA

Obs: tiden för slutförandet är 2 h.

  1. Re-lös RNA i 200 μL av DEPC-behandlade H2O (65 ° c inkubation kan användas, liknande förfarandet i steg 2,12).
  2. Mät RNA-koncentrationen vid en260 med hjälp av en spektrofotometer; provet kan behöva spädas 1/10 för att få det inom spektrofotometerens linjära omfång. Vortex denna utspädning i minst 10 s för att säkerställa trögflytande RNA är jämnt upplöst.
    Obs: effektiviteten av biotinylation kan bedömas av dot blot13 om det behövs.
  3. Tillsätt lika mycket RNA till ett nytt rör och gör upp till 200 μL i DEPC-behandlade H2O. Använd alla provet med den lägsta RNA-koncentrationen och Använd en lämplig volym av de andra proverna för att ha en liknande mängd RNA för varje.
    Anmärkning: kalkylbladet 4Tu experiment Template. xlsx har ett formulär som stöd för den här beräkningen.
  4. När provet är RT, tillsätt 25 μL 10 x NaTM buffert (0,1 M Tris HCl pH 7,0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl2), 25 μl 1 M napi pH 6,8 (0,5 m NaH2Po4 0,5 m na2HPO4) och 2,5 μL 10% SDS. Blanda noggrant och snurra försiktigt (< 30 s; cirka 100 x g).
    Anmärkning: för att undvika utfällning av SDS och salter skall proverna förvaras vid RT under följande procedurer upp till steg 4,13.
  5. Gör pärlbufferten som innehåller 1x NaTM buffert, 0,1 M NaPi, och 0,1% SDS, 2 mL per prov. Tillsätt den erforderliga mängden H2O först och SDS sist. Detta måste göras färskt varje gång som en fälls former efter 24 h.
    Anmärkning: för att undvika uppkomsten av fällar måste pärlbufferten förvaras vid RT under följande procedurer. Ta inte DEPC behandla eller autoklav.
  6. Tillsätt 50 μl konjugerat pärlor till en låg retention 1,5 ml tub. Placera röret på magnet hållaren, vänta på att pärlorna ska sedimentera och ta sedan bort vätskan
  7. Tvätta konjugerat pärlor.
    1. Tillsätt 200 μL pärlbuffert och virvel tills pärlpelleten är helt återsuspenderad. Vanligtvis är 3 − 5 s allt som krävs. För tvättar innan RNA provet tillsätts är det tillräckligt att vrida rören runt så att pärlorna färdas över röret till den andra sidan. Vänd sedan rören tillbaka till den ursprungliga sidan så att pärlorna färdas över röret igen.
    2. Snurra röret med låg hastighet (ca 100 x g) för högst 5 s för att snurra ner vätskan, men inte pärlorna.
    3. Placera i magnet hållaren så att pärlorna kan fångas upp av magneten.
    4. Ta bort vätskan genom aspiration för ett litet antal prover; Häll av vätskan om många prover.
      Anmärkning: med ett stort antal prover, ta bort all vätska enbart genom aspiration kan vara problematiskt, eftersom pärlorna i det första provet kan torkas ut innan det sista provet är klar, detta ökar bakgrunden. Tvättning kan påskyndas genom att hälla bort vätskan från alla prover på en gång medan på magneten. De bör lämnas lite längre på magneten innan hälla och den lilla mängd vätska som återstår måste aspireras bort, men totalt sett betyder det mindre tid på magneten och utan vätska. På detta sätt är det möjligt att göra 24 eller fler extraktioner snabbt.
  8. Block med 200 μL pärlbuffert, 10 μL 20 mg/mL glykogen och 2,5 μL 5 mg/mL tRNA, 20 min roterande ände över änden vid måttlig hastighet vid RT. Rotationen är att hålla pärlorna i fjädring. När blockeringen är klar, ta bort vätskan som steg 4.7.2 − 4.7.4 och tvätta igen, som stegen i avsnitt 4,7.
  9. Omsuspendera pärlorna i provet. Inkubera vid RT med rotation i 30 min.
  10. Förbered ett nytt 1,5 mL-rör för varje prov under inkubationen. Tillsätt 1/10 volym (cirka 10 μl) av 3 M natriumacetat pH 5,3 och 20 μg glykogen, och snurra vid cirka 100 x g för 3 s. Förvara i ett rack tills det behövs.
  11. Ta bort obundna RNA från pärlorna, som steg 4.7.2 − 4.7.4. Det obundna RNA kan vara framhärdat i ett nytt rör, men salterna och SDS gör det mycket svårt att rena. Tvätta sedan pärlorna, som avsnitt 4,7 med vortexing, i minst 3 till maximalt 5 gånger.
  12. Efter den sista tvätten var särskilt noga med att aspirera all vätska; gå tillbaka till varje tub och aspirera drägarna av bufferten en gång till.
  13. För att eluera RNA, tillsätt 50 μL nyberedd 0,7 M β-merkaptoetanol (βME) till pärlorna (1/20 utspädning av den kommersiellt levererade stamlösningen). Vortex och snurra kort, som steg 4.7.1 och 4.7.2. Placera slammen i magnet hållaren och Pipettera RNA-lösningen i 1,5 mL centrifugertub som bereds i steg 4,10.
  14. Eluera än en gång som steg 4,13 för att återvinna kvarvarande RNA från pärlorna och tillsätt det eluerade provet till röret som innehåller den första elueringen från dessa pärlor.
  15. Ta bort kvarvarande pärlor från det eluerade RNA genom att placera provet tillbaka i magnet hållaren och överföra vätskan till ett nytt, lågt bindande 0,5 mL centrifugeringsrör.
  16. Blanda provet och fäll sedan nsRNA genom att tillsätta 2,5 x volymer (280 μL) etanol och blanda en gång till. Låt verka i 1 h till över natten vid-20 ° c. Snurra i en pre-kyld centrifug (4 ° c) i 20 minuter vid maxhastigheten (minst 13 000 x g).
  17. Tvätta noggrant med 200 μL 70% etanol vid-20 ° c. Som resterande βme kommer att hämma nedströms applikationer, snurra vid varje steg för att ta bort så mycket av drägg som möjligt; i slutet provet bör inte lukta på βME.
  18. Lös upp i 10 − 20 μL DEPC-behandlad 1x TE med motsvarande 0,005 μL RNase-hämmare.
    Obs: alla efterföljande stadier ska utföras på is.
  19. Mät RNA-koncentrationen och renheten.
    1. Mät A260 och225 i en spektrofotometer med lågt provvolym.
      Anmärkning: en maximal absorbans nära λ = 225 Nm är från ett oundvikligt främmande ämne från pärlorna. I avsaknad av RNA sjunker signalen från det främmande ämnet till 35% vid λ = 260 Nm. Därför approximeras den faktiska mängden RNA med formeln: (A260-(a225* 0,35)) * 40 ng/μl.
    2. Alternativt analysera provet på en mikro-Fluidics elektrofores system såsom en bioanalyzer.
      Anmärkning: denna analys är att föredra att använda en spektrofotometer som RNA-integritet kan bedömas, det främmande ämnet inte stör kvantifiering och mindre prov krävs.
  20. Analysera nsRNA.
    Anmärkning: till exempel kan specifika RNAs kvantifieras med standard omvänd transkriptase qPCR tekniker. RNA förberett på detta sätt är kompatibelt med biblioteks förberedelser för RNA-SEQ. avlägsnande av rRNA är inte nödvändigt för märkning gånger mindre än 5 min. omkodning SLAMseq14 kan också utföras på detta RNA.

Representative Results

Typiska avkastningar för nsRNA återvinnas med detta ers4tU protokoll visas i figur 1b, detta har producerats av en bioanalyzer och spår visar avkastningen av RNA kontra storlek (nukleotider [NT]). Notera, i både bioanalysatorn trace och den infälld grafen, att RNA återhämtning från tid punkt 0 är en mycket liten del av som återhämtat sig från längre tid punkter-cirka 0,3 μg RNA återhämtat sig från cirka 109 celler jämfört med över dubbelt så mycket efter bara 30 s av märkning (0,8 μg nsRNA) från samma antal celler. RNA återhämtning vid 15 s är mer varierande som små skillnader i utförandet av provtagning har en proportionellt större effekt på RNA återhämtning. I bioanalyzer spår, rRNA prekursorer kan ses som en topp nära 1000 NT och en dubblett av toppar på 1700 − 1800 NT. Överflödet av dessa intermediärer ökar som tiolation fortsätter.

Tio-märkningen användes för att kvantifiera splitsning av ÄRV1 -avskriften (figur 3). Tiolation utfördes och prover togs vid 15 s intervall från början av tio-märkningen och bearbetningen av ÄRV1 RNA övervakades (figur 3a, b). Som kan ses, är pre-mRNA genereras (genom transkription), och svårbegriplig (genom det första steget av skarvning från pre-mRNA), även efter bara 15 s av märkning. Efter ca 45 s till 1 min, beloppen av svårbegriplig och pre-mRNA nå jämvikt med så mycket av dessa RNA arter som skapas genom transkription som bearbetas bort genom splitsning.

För att producera de data som visas i figur 3c var stammen pulsade med 4tu för 25 s och sedan jagade med uridin. Generationen av pre-mRNA och svårbegriplig når högst 1 minut. Detta jämförs väl med figur 3b. maximalt uppnått efter 45 s för att nå jämvikt plus 25 s av märkningen. Efter toppen, nivåerna sjunka som Thio-märkta RNAs är jagade genom skarvning processen.

Figur 3D visar utarmning av en proteinskarvning faktor och dess effekt på RNA metabolism, med hjälp av β-Est Aid 4U system6,7. Här, Prp16p reduceras från nära fysiologiska nivåer till 5% av denna nivå efter 25 min av utarmning. Prp16p är en viktig skarvning faktor för det andra steget i splitsning15. Lariats avlägsnas under det andra steget av skarvning (figur 3a), men här de ökar över nivån för pre-mRNA som Prp16 blir begränsande. Vid senare utarmning gånger, andra faktorer blir begränsande på grund av sekundära effekter, så att nivåerna av Lariat minska, och pre-mRNA nivåer stiger. Nivån på de skarvade mRNA minskar.

Figure 1
Figur 1: tillväxt i 4tU och RNA återhämtning. (a) 4-thiouracil påverkar tillväxten. Öka koncentrationen av 4tU i YMM Drop-out tillväxtmedium utan uracil ökar fördubblings tiden för S. cerevisiae (BY4741) bär p4FuiΔPEST plasmid. Tillväxt av fyra replikat kulturer övervakades vid 30 ° c i en Tecan oändlig Pro 200. Alla kulturer var i logg fasen hela, med OD600 mellan 0,1 och 0,6. Håna är en kontrollera kultur med ett likvärdigt belopp av NaOH tillfogade, som inte vid honom ändrar tillväxttakten. Detta diagram visar att tio-märkningen är en kompromiss mellan snabb märkning och skador på cellen. Felstaplar är standardfel på 4 replikat. bnsrna-avkastningen ökar linjärt från ca 15 s av märkningen. Huvudfiguren visar bioanalysatorn spår av renas, nsRNA från 0 (inte tiolated) till 2 min efter tillsats av 4tU vid 15 s intervall. Observera att 15 s-provet inte visas, eftersom det inte går att skilja från det omärkta provet. De två stora topparna motsvarar ribosomal RNAs (rRNAs). RRNA-prekursorer och intermediärer är synliga som flera toppar vid större molekylvikt än mogna rRNAs. Återhämtningen av dessa prekursorer och intermediärer ökar med tiden. Resultat från ett representativt experiment visas. Den infälld grafen visar återhämtningen av nsrna med ökande inkubering med 4tu. Avkastningen av nsRNA ökar med ökande tid av tillväxt med 4tU. Återhämtningen är anmärkningsvärt linjär (R2 = 0,934) under hela tidsskalan för detta experiment och visar en liten ökning över bakgrunden även vid 15 s märkning med 4tu även om den inte skiljer sig från det omärkta provet med öga från bioanalysatorn Spåra. Felstaplar visar standardfel för tre biologiska replikat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: β-Est stöd 4U β-Est Aid 4U grafiskt protokoll. En grafisk Sammanfattning av protokollet för det β-Est AID 4U-protokollet. β-estradiol (β-EST) främjar uttrycket av auxin inducerbara degron (stöd) system som i sin tur uttär ett stöd * taggade Target protein, hänvisa till Barrass et al.7 för ett detaljerat protokoll. I detta fall, degron system uttryck initieras 25 min innan proteinnedbrytning påbörjas och tiolation vid varje tidpunkt är för 1 min. prover tas före induktion och varje 2 minuter under utarmning. En animerad version visas i tilläggs siffran 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: prekursorer och intermediat för ÄRV1 RNA-skarvning. Skarvning av ÄRV1 pre-mRNA-utskrifter övervakades med kvantitativ omvänd Transkription PCR16. Nivåerna av ÄRV1 föregångare (pre-mRNA), mellanliggande Lariat-på exon2 (Lariat) och skarvas produkt (mRNA) visas normaliserade mot nivån på ÄRV1 på exon2 och steady state nivåer av dessa rnas. (a) lokalisering av qPCR-produkter på ÄRV1-avskriften. Schematiska av lokaliseringarna av de qPCR-produkter som används för att göra en analys av nivåerna av prekursorer, intermediärer och produkter av skarvning reaktionen av ÄRV1 avskrifter16. Exons representeras av lådor, intron som en linje och qPCR produkter som linjer med diamanter i vardera änden, färgen matchar de som används i diagrammen. Pre-mRNA PCR är specifikt för pre-mRNA och inte någon intermediat av skarvning som denna produkt korsar grenen punkt som störs efter det första steget i splitsning. Lariat PCR kommer att upptäcka produkten av det första steget i skarvning och censurerade Lariat produceras efter den andra. MRNA PCR är specifikt för produkten av skarvning, mRNA. Resultat från exon PCR (förekommer i alla prekursorer, intermediärer och produkter, utom den exciderade Lariat) visas inte i diagrammen eftersom detta användes för att normalisera data och är därför alltid lika med 1. bkontinuerlig tiolabelling. Mängden pre-mRNA ökar med tiden som 4tU införlivas genom transkription och efter en kort fördröjning, splitsning omvandlar den till Lariat-på exon2 mellanliggande och skarvade produkter. Nivåerna av dessa pre-mRNA och Lariat arter är detekterbara ovan bakgrund efter så lite som 15 s av tillväxt med 4tU och nå ett maximum efter cirka 45 s kontinuerlig märkning med 4tU, varvid deras produktion balanseras genom omvandling till skarvade mRNA och/eller degradering. Värden är normaliserade till deras steady state (vänster-mest punkt i grafen), och exon 2 nivåer för att visa deras utseende och bearbetning i jämförelse med transkription av exon 2. Eftersom RNA skarvning av ÄRV1 är till stor del Co-transkriptionella4,17 skarvade mRNA snabbt blir den mest förekommande arten, dess nivå liknar exon 2. Standard fel på tre biologiska replikat, varje analyseras i triplicate. (c) puls/jakt. Tiolation puls på 25 sekunder följt av Chase med uridin. Jämfört med de steady state nivåerna av dessa RNAs (vänster-mest punkt), de är initialt mycket riklig i den nyligen syntetiserade poolen. Nivåerna sjunker gradvis eftersom de bearbetas till mRNA (eller degraderas), närmar sig nivåer mycket liknar steady state nivåer av 5 min. standard fel på tre biologiska replikat, varje analyseras i triplicate. d) nsrna och protein förlust. Skarvning av ÄRV1 pre-mRNA-utskrifter som övervakas av kvantitativ omvänd TRANSKRIPTION PCR som i panel (a) vid utarmning av Prp16 proteinet med hjälp av auxin degron-systemet enligt beskrivningen i figur 2. Den Prp16 proteinnivåer visas också i diagrammet plottas mot den andra Y-axeln i procent av nivåer före auxin utarmning. Prp16 är en viktig del av spliceosome, särskilt viktigt för det andra steget i skarvning visas i panel (a), varefter svårbegriplig bryts ned. När detta kliver blir begränsa svårbegriplig ackumulera initialt. Vid senare tidpunkt punkter skarvning misslyckas helt, är svårbegriplig inte längre produceras och pre-mRNA nivåer stiger. Felstaplar är standardfel på tre biologiska replikat, varje analyseras i triplicate. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: grafisk Sammanfattning av protokoll avsnitten 1 till 3. Cellerna är tiolated med 4tU och får växa för att införliva den modifierade nukleotiden i RNA. En thiolated S. pombe Spike kan läggas till att tillåta normalisering över tidspunkter och experiment. Pulsen på 4tU kan jagas med hjälp av un-thiolated uridin. Märkningen kan antingen utföras kontinuerligt från 4tU addition eller från en förändring till tillväxtvillkor, kultur Split och 4tU läggas till kulturer vid ökande tider från tillväxtvillkor förändring, men varje märkning endast för en kort tid. Cellerna samlas in, och RNA framställs från cellerna, företrädesvis med hjälp av en homogenisator och fenol-baserade metoder. RNA är en och sedan en RNA renas från oinkorporerade biotin med hjälp av en storlek uteslutning kolumn. Nsrna är nu klar för rening med konjugerat pärlor (avsnitt 4, figur 5). Tal i rött motsvarar steg numren i protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: grafisk Sammanfattning av protokoll avsnitt 4. Enligt avsnitten 1 till 3 (figur 4) blockeras konjugerat-pärlorna och det biotinylerade RNA-provet tillsätts till de beredda pärlorna. Den en RNA binder till konjugerat pärlor och un-en RNA bort och tvättas. Den en RNA elueras från pärlorna med βme och fälls redo för vidare forskning. Tal i rött motsvarar steg numren i protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: förbättring av nsRNA återhämtning från jästceller med och utan ytterligare kopior av importören på 1 och 3 minuter av tio-märkning. Observera att Fui1 är jästen egen promotor uttryckt från en 2 μm plasmid. Den genomiska kopian av genen förekommer i båda dessa stammar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande figur 2: animerad version av β-Est stöd 4U β-Est Aid 4U grafiskt protokoll. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande fil 1:4tU_experiment_template. xltx. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil. 

Plasmid namn Importör/permease Markör Kommentar
p4Fui S. cerevisiae Fui1 URA3 Fui1 importerar uracil och uridin, vilket gör den idealisk för puls/Chase experiment.
pAT2 S. cerevisiae Fui1 LEU2
p4Fui-ΔPEST S. cerevisiae Fui1 URA3 PEST-motivet i Fui1 har inaktiverats, så permeasen bryts inte ned när det finns tillräckligt med intracellulär uracil för cellens behov. Fungerar bra i märknings experiment och förbättrar puls/Chase prestanda.
p4Fur S. cerevisiae Fur4 URA3 Uracil permease
YEpEBI311 H. sapiens ENT1 LEU2 Miller et al.11. Innehåller även en HSV tymidin-kinasgen.
(equilibrative nukleosidanaloger transportör)
Alla plasmider är 2 μm baserade. Alla P4 plasmider och pAT är baserade på pRS16 -serien av plasmider. FUI1 och FUR4 uttrycks från deras egna, endogena initiativtagare.

Tabell 1: plasmider som används med detta protokoll.

Discussion

Denna artikel presenterar ett protokoll för extremt snabb och specifik 4tU märkning, för återvinning av begynnande, nyligen syntetiserade RNA från S. cerevisiae efter så lite som 15 S av märkning, med mycket låg förorening av OMÄRKTA RNA.

Användaren bör alltid vara noga med att bibehålla integriteten hos RNA genom användning av kalla temperaturer och DEPC-behandlade reagenser. Streptavidin pärla rening är i allmänhet tillförlitlig; dock är pärlbufferten svår att hantera; Det måste göras nytt, med dess delar som tillfogas i det rätt beställer, och inte kylt eller autoklaverat. Vanliga brister inkluderar RNA är ofullständigt upplöst efter nederbörden steg, och så är antingen inte en eller på annat sätt förlorat under bearbetningen steg. Det finns omfattande felsökningshjälp i tilläggsmaterialet.

Det finns vissa begränsningar att vara medveten om i ers4tU. En redan nämnt är att 4tU saktar tillväxten av jästen (figur 1a). Bortsett från den endogent tiolerade rnas9kan endast rnas som har transkriberats under märknings perioden renas med denna metod. Polymeraser som pausas på gener under tiolationstid kommer inte att producera tiolerade utskrifter som kan renas, även om utskrifter som är delvis märkta på grund av polymeraser som kommer in i eller lämnar ett pausat tillstånd under tiolation kan återvinnas. Stammar som transkribera dåligt, antingen på grund av mutation eller tillväxtförhållanden, producera lite nsRNA, även om de tekniker som används här kommer ändå att förbättra återhämtningen av nsRNA jämfört med andra metoder. Längre tider och ökade kultur volymer kan vara nödvändiga i dessa stammar och villkor. Observera att uracil är en bra källa till kväve och därför bör denna metod trialed innan den används för studier med kväve svält.

Protokollet ers4tU är särskilt användbart för analys av kortlivade RNAs, av vilka många är så snabbt försämrade att de inte kan identifieras utan att nedbrytande maskineriet förlamats. Exempel är kryptiska instabila utskrifter (nedskärningar)4, och korta utskrifter som produceras av förtida uppsägning eller promotor proximalt pausa18 och antisense transkription "uppströms" från en promotor (prompter)19. Intermediaterna som produceras under bearbetningen av stabila RNA-arter är också övergående men kan berikas med ers4tU transkription4. Protokollet ers4tU är därför exceptionellt när det tillåter mycket övergående RNA-arter att analyseras och fångas under nära fysiologiska förhållanden, vilket är en stor fördel jämfört med andra metoder. Denna teknik har använts för att studera transkription och nedströms RNA bearbetning kinetik i RNA-polymeras mutanter som elongate snabbare eller långsammare än normalt20.

Thiolation är också kompatibel med RNA-SEQ och SLAM-SEQ21, vilket gör att alla RNA produceras inom en mycket kort tid fönster för att kännetecknas i utsökt detalj.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Wellcome-finansiering till JB [104648]. Arbetet i Wellcome centrum för cell bio Logi stöds av Wellcome Core-finansiering [092076]. Författarna erkänner medlemmarna i labbet för deras hjälp: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias och SHINEY George. Författarna skulle också vilja tacka Patrick Cramer för plasmid YEpEBI31111.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol (βME) Sigma-Aldrich M3148 CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use
Chloroform Sigma-Aldrich 25668 CAUTION toxic
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave
DMF (N,N-dimethylformamide)  Sigma-Aldrich 227056 CAUTION toxic
EDTA Sigma-Aldrich 3609 Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide
Ethanol Sigma-Aldrich 29221
EZ-link HPDP Biotin Thermo scientific 21341 Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend.
Glucose Fisher Scientific  G/0500/60
Glycogen [20 mg/mL] Sigma-Aldrich 10901393001 Store at -20 °C
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel Thermo Scientific 77712 Optional
LiCl Sigma-Aldrich 793620 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 63033 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.
Methanol Fisher Scientific M/4000/PC17 CAUTION Toxic and flammable
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139 Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264
NaCl Sigma-Aldrich S9888-M 5 M solution
Phenol, low pH.   Sigma-Aldrich P4682 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.  Sigma-Aldrich P1944 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Pierce Spin Columns Thermo Scientific 69702 Optional
SCSM single drop-out –ura Formedium  DSCS101
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 32318-M Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429 CAUTION corrosive
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Sigma-Aldrich 436143 CAUTION irritant, do not inhale
Streptavidin Magnetic beads NEB 1420S Store at 4°C 
SUPERase-In, RNase inhibitor Life technologies  AM2696 Store at -20°C
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike See section 1.7 of the protocol
4-thiouracil (4tU)  ACROS ORGANICS 359930010 Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. 
Tris base Sigma-Aldrich 93362 1 M solutions at various pH
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001 5mg/ml, store at -20°C
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.
Yeast nitrogen base without amino acids  with amonium sulphate Formedium CYN0410
Zeba Columns 0.5ml Thermo Scientific 89882 Store at 4 °C 
Zirconia beads Thistle Scientific 110791052
Equipment and Consumables
Beadbeater Biospec 112011EUR Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g 
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist 
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end 
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended 
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL Eppendorf H179467N
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL Ambion AM12350
Tubes, centrifuge, 50 mL  Sarstedt 62.547.004 Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss
Tubes, centrifuge, 15 mL  Sarstedt 62.554.001
Tubes, 2 mL, screw cap Greiner 723361
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids Brand 781332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10, (1), e1513 (2018).
  2. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).
  3. Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).
  4. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  5. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).
  6. Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast. Yeast (Chichester England). 36, (1), 75-81 (2018).
  7. Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  8. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  9. Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression. Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).
  10. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).
  13. Rädle, B., et al. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  14. Herzog, V. A., et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).
  15. Ohrt, T., et al. Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system. RNA. 19, 902-915 (2013).
  16. Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
  17. Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast. RNA. 23, 601-610 (2017).
  18. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).
  19. Preker, P., et al. RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters. Science. 322, 1851-1854 (2008).
  20. Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast. Genome Research. 28, 203-213 (2018).
  21. Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding. Nature Methods. 15, 221-225 (2018).
Extremt snabb och specifik metabolisk märkning av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).More

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter