Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En robust polymerase Kjedere reaksjon-basert analyse for kvantifisere Cytosin-Guanin-Guanin Trinucleotide gjentar i skjøre X mental retardasjon-1 Gene

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59963
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 2, 2,3, 2,3, 2, 5, 5, 6,7, 2,3
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

En nøyaktig og robust polymerase Chain reaksjons BAS ert analyse for kvantifisere cytosin-Guanin-Guanin trinucleotide gjentar i skjøre X mental retardasjon-1-genet Letter molekylær diagnose og screening av skjøre X syndrom og skjøre X-relaterte med kortere sving rundt tid og investering i utstyr.

Abstract

Skjøre X syndrom (FXS) og tilknyttede lidelser er forårsaket av utvidelse av cytosin-Guanin-Guanin (CGG) trinucleotide gjentar i 5 ' uoversatt region (UTR) av skjøre X mental retardasjon-1 (FMR1) Gene promoter. Konvensjonelt, kapillær elektroforese fragment analyse på en genetisk analysator brukes for dimensjonering av CGG repetisjoner av FMR1, men ytterligere Southern blot analyse er nødvendig for nøyaktig måling når repetisjons tallet er høyere enn 200. Her presenterer vi en nøyaktig og robust polymerase kjedere reaksjons metode (PCR) basert på kvantifisering av CGG repetisjoner av FMR1. Det første trinnet i denne testen er PCR forsterkning av gjenta sekvenser i 5 ' UTR av FMR1 arrangøren ved hjelp av en SKJØR X PCR Kit, etterfulgt av rensing av PCR-produkter og fragment dimensjonering på en mikrovæskebasert kapillær elektroforese instrument, og tolkning av antall CGG-repetisjoner ved å henvise til standarder med kjente repetisjoner ved hjelp av analyseprogramvaren. Dette PCR-baserte analysen er reproduserbar og i stand til å identifisere hele spekteret av CGG repetisjoner av FMR1 arrangører, inkludert de med en gjentakelse antall mer enn 200 (klassifisert som full mutasjon), 55 til 200 (premutation), 46 til 54 (middels), og 10 til 45 (normal). Det er en kostnadseffektiv metode som forenkler klassifisering av FXS og skjøre X-assosierte lidelser med robusthet og rask rapporterings tid.

Introduction

Skjøre X syndrom (FXS) og skjøre X assosierte lidelser, f. eks, tremor og ataksi syndrom (FX-TAS), og primære eggstokkene insuffisiens (FX-POI) er hovedsakelig forårsaket av cytosin-Guanin-Guanin (CGG) trinucleotide gjenta ekspansjon i 5 ' uoversatt region (UTR) av den skjøre X mental retardasjon-1 (FMR1) genet på xQ 27.31,2. Den FMR1 kodet PROTEIN (FMRP) er en polyribosome-assosiert RNA-binding protein som fungerer i neuronal utvikling og Synaptic plastisitet ved å regulere alternative skjøting, stabilitet, og dendrittiske transport av mRNA eller modulerende syntese av delvis postsynaptic proteiner3,4,5,6,7.

Den dynamiske variasjonen med en CGG på > 200 er beskrevet som full mutasjon, noe som induserer den avvikende hypermethylation og påfølgende transcriptional demping av FMR1 arrangøren8. Den resulterende fravær eller mangel på FMRP protein forstyrrer normal neuronal utvikling og forårsaker FXS9, karakterisert ved ulike kliniske symptomer, inkludert moderat til alvorlig intellektuell funksjonshemming, utviklingsmessige forsinkelse, hyperaktiv atferd, fattige kontakter og autistiske manifestasjoner10,11,12. Presentasjonen i kvinnelige FXS pasienter er generelt mildere enn i menn. Det CGG gjentagelse størrelse oppstiller fra 55 å 200 og 45 å 54 er hemmelig idet premutation og mellomliggende rang, respectively. På grunn av den høye graden av ustabilitet, CGG gjenta størrelse i en premutation eller middels allel antagelig utvides når overføres fra foreldre til avkom13,14. Dermed, bærere med premutation alleler har høy risiko for å få barn rammet med FXS på grunn av gjenta ekspansjon, og i noen tilfeller kan mellomliggende alleler utvide sin gjenta størrelse til full mutasjon området over to generasjoner15, 16i den. Videre, hanner med premutation også formidle økt risiko for å utvikle sen-utbruddet FX-tas17,18,19, mens premutation kvinner er disponert for både FX-tas og FX-POI20, 21,22. Nylig har det blitt rapportert at autistiske spektrum lidelser med utviklingsmessige forsinkelser og problemer i sosial atferd er presentert hos barn med premutation FMR1 alleler23,24.

For å finne den eksakte CGG repetisjons størrelse er av stor betydning for klassifisering og prediksjon av FXS og skjøre X-tilknyttede lidelser25,26. Historisk har CGG gjenta Regionspesifikk polymerase kjedere reaksjon (PCR) med fragment dimensjonering pluss Southern blot analyse vært gullstandarden for molekylær profilering av FMR1 CGG gjenta27. Imidlertid er tradisjonell spesifikk PCR mindre følsom for store premutations med mer enn 100 til 130 repetisjoner og er ute av stand til å forsterke hele mutasjoner27,28. I tillegg kan kapillær elektroforese på en tradisjonell genetisk analysator for repetisjons dimensjonering ikke detektere FMR1 PCR-produkter med mer enn 200 CGG repetisjoner. The Southern blot analysen muliggjør differensiering av et bredere spekter av gjenta størrelse, fra normal til full mutasjon gjenta tall, og har vært mye brukt for å bekrefte hele mutasjoner (i menn) og differensiere heterozygot alleler med full mutasjon fra tilsynelatende homozygote alleler med normal gjenta størrelser (i kvinner). Imidlertid, resolusjonen for Kvantifisere det gjentar er begrenset. Enda viktigere er dette trinn-for-trinn testing strategien er arbeidskrevende, tidkrevende og kostnadseffektive.

Her presenterer vi en nøyaktig og robust PCR-basert metode for kvantifisering av CGG-repetisjoner av FMR1. Det første trinnet i denne testen er PCR forsterkning av gjenta sekvenser i 5 ' UTR av FMR1 promoter bruker SKJØRE X PCR Kit. PCR-produktene er renset og fragment dimensjonering utføres på et mikrovæskebasert kapillær elektroforese instrument, og etterfølgende tolkning av antallet CGG-repetisjoner ved hjelp av analyseprogramvaren ved å henvise til standarder med kjente repetisjoner basert på at PCR-fragment lengden er direkte proporsjonal med antallet CGG-repetisjoner. PCR-systemet omfatter reagenser som forenkler forsterkningen av det svært GC-rike trinucleotide gjentakelsesområdet. Dette PCR-baserte analysen er reproduserbar og i stand til å identifisere alle områder av CGG repetisjoner av FMR1 arrangører. Dette er en kostnadseffektiv metode som kan finne bred anvendelse i molekylær diagnose og screening av FXS og skjøre X-relaterte lidelser med mindre sving rundt tid og investeringer i utstyr og dermed kan utnyttes i et bredere spekter av kliniske Laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etisk godkjenning ble gitt av Joint Chinese University of Hong Kong-nye territorier East Cluster Clinical Research etikk Committee (referansenummer: 2013,055)

1. PCR forsterkning

  1. Før start, Fjern PCR buffer mix, sample fortynningsmiddel og DNA-prøver (både test og referanse DNA) (se tabell over materialer) fra-20 ° c fryseren og oppbevar dem i romtemperatur i 20 – 30 min for å sikre at alle reagenser og DNA er fullt tint. Og snurr kort ned før bruk.
  2. Mål konsentrasjonen av DNA-prøvene ved hjelp av en spektrofotometer (se tabell over materialer). DNA-konsentrasjonen bør være 25 ng/μL; fortynnet med et prøve fortynningsmiddel til riktig konsentrasjon ved behov.
    Merk: DNA skal trekkes ut og renses for å fjerne forstyrrende stoffer, slik som proteiner og høye salt konsentrasjoner. Ikke-degradert DNA av høy kvalitet bør brukes til påfølgende PCR-forsterkning og-analyse (A260/A280:1.8 – 2.0 og A260/A230: > 1.0).
  3. Merk brønner på en PCR-plate eller 0,2 mL PCR-rør for å identifisere referanse og testede DNA-prøver.
  4. Beregn antall PCR-reaksjoner som kreves for testprøvene, 2 referanse prøver og negativ kontroll prøve. Klargjør PCR Master Mix ved å tilsette 15 μL av PCR buffer blanding, 2,6 μL av prøve fortynningsmiddel og 0,4 μL av polymerase for hver reaksjon.
    Merk: En negativ kontroll med prøve fortynningsmiddel er avgjørende for å overvåke PCR-ytelsen. Klargjør PCR-Master blandingen ved romtemperatur, ikke Pipetter på is. PCR buffer blandingen er viskøs. Bland røret og deretter kort spinne ned før bruk.
  5. Vortex PCR Master Mix fra trinn 1,4 til 10 – 20 s og snurr ned. Gradvis dispensere 18 μL av blandingen i hver brønn eller tube.
  6. Vortex og spinn ned DNA-prøvene. Pipetter 2 μL av hvert DNA i riktig brønn eller rør for et endelig PCR-volum på 20 μL. Bland ved pipettering opp og ned 5 ganger.
    Merk: Den totale mengden av DNA per reaksjon bør være 50 – 100 ng. DNA-mengder større enn 150 ng per 20 μL PCR-reaksjon kan resultere i en dårlig forsterkning av store gjentakelses alleler. For lavere konsentrert DNAs, kan mengden av prøve fortynningsmiddel i PCR Master Mix erstattes av DNA-løsning.
  7. Forsegle platen med selvklebende plate sealer, eller med rør caps.
  8. Plasser den forseglede PCR-platen eller rørene i den termiske cycler med oppvarmet lokk. Kjør programmet med følgende innstillinger: 95 ° c i 5 min, etterfulgt av 25 sykluser med denaturering ved 98 ° c for 35 s, annealing ved 59 ° c for 35 s, og utvidelse ved 72 ° c i 4 min; et siste trinn ved 72 ° c i 10 min. Hold PCR-produktene ved 4 ° c i cycler til den fjernes for videre behandling.
  9. Etter PCR forsterkning, rense og analysere produktene umiddelbart, eller lagre på + 2 til + 8 ° c over natten. Alternativt kan produktet oppbevares i opptil 30 dager ved-30 til-16 ° c.

2. rensing av PCR-produktene

  1. Varm opp inkubator shaker til 65 ° c.
  2. For hver PCR-reaksjon legger du til 80 μL av 1x TE-buffer (se materialfortegnelsen) til 20 μL av hvert PCR-produkt fra del 1.
  3. Overfør prøve blandingen til en PCR-rensing (se tabell over materialer) ved hjelp av en flerkanals pipette.
  4. Hold platen avdekket og plasser den i inkubator shaker, og ruge ved 65 ° c mens risting ved 1 200 RPM i 10 min.
  5. Etter inkubasjons setter du vakuum instrumentet på 250 mbar (eller 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 i HG) og aspirer løsningen gjennom filteret i 15 min. brønner skal ikke ha væske igjen.
  6. Avkjøl inkubator shaker ned til 25 ° c.
  7. Etter den første aspirasjon, slå av vakuum og tilsett 50 μL av 1x TE buffer til hver brønn. Ikke bland. Aspirer løsningen for 10 min ved hjelp av vakuum innstillingene i trinn 2,5.
  8. Tørk bunnen av filter platen ved å trykke den godt på en stabel med papirhåndklær.
  9. Tilsett 20 μL av 1x TE-buffer i midten nederst på hver brønn. Plasser platen i inkubator shaker og ruge ved 25 ° c mens du rister ved 1 200 RPM i 5 min.
  10. Etter inkubasjons overfører du > 15 μL av hver renset PCR DNA fra trinn 2,9 til en fersk 96-brønn PCR-plate. Renset DNA kan analyseres direkte, eller alternativt kan lagres ved-30 til-16 ° c til nødvendig.

3. fragment dimensjonering av PCR-produkter

  1. Før start, tillater DNA fargestoff konsentrat, DNA gel matrise, DNA-markør, DNA stige og renset DNA prøver fra trinn 2 til likevekt til romtemperatur i 30 min.
  2. Sett opp priming stasjonen.
    1. Skift ut sprøyten (se tabell over materialer) når du bruker en ny gruppe med reagenser.
    2. Juster bunnplaten, og løsne hendelen på sprøyte klipsen og skyv den opp til øverste posisjon.
  3. Start dimensjonering programvare (se tabell over materialer) og forberede gel-Dye mix.
  4. Vortex fargestoff konsentrat for 10 s og spinne ned. Tilsett 25 μL av fargestoff til en gel Matrix hetteglass. Vortex den blandede løsningen godt og spinn ned.
    1. Overfør gel-Dye Mix til en spin filter. Plasser spin-filteret i en mikrosentrifugen og snurr i 10 minutter ved romtemperatur ved 1 500 x g ± 20%.
      Merk: Beskytt oppløsningen med fargestoff fra lys og oppbevares ved 4 ° c etter bruk. Den gel-Dye Mix kan brukes til ca 15 sjetonger gang forberedt. La gel-Dye Mix å likevekt til romtemperatur i 30 min hver gang før bruk.
  5. Last inn gel-Dye mix.
    1. Sett inn en ny DNA-chip på priming stasjonen. Tilsett 9 μL av gel-Dye mix i brønnen merket med "G". Kontroller at stempelet er plassert på 1 mL-merket, og lukk deretter priming stasjonen.
    2. Trykk sprøytes stempelet ned til det holdes av klemmen. Vent til nøyaktig 30 s deretter slipper klippet. Vent til 5 s, og trekk stempelet langsomt tilbake til posisjonen 1 mL.
    3. Åpne priming stasjonen og tilsett 9 μL av gel-Dye mix i brønnene merket med "G".
  6. Tilsett 5 μL av merket i brønnen som er merket med stige symbolet, og Legg også til 5 μL av merket i hver av de 12 prøve brønnene. Ikke la noen brønner tomme.
  7. Tilsett 1 μL av DNA stige i brønnen merket med stigen symbolet. Tilsett 1 μL av PCR-produkt (brukte brønner) fra trinn 3,1 eller 1 μL av ultrarent vann (ubrukte brønner) i hver av de 12 prøve brønnene. Sett brikken horisontalt i adapteren av Vortex mikser og Vortex på 1 min ved angitt innstilling (2 400 RPM).
  8. Sett inn brikken i det bioanalyzer instrumentet og Kjør brikken i instrumentet i løpet av 5 min..
  9. Når analysen er fullført, fjerner du den brukte brikken fra instrumentet umiddelbart.
  10. Sakte tilsett 350 μL av deionisert vann i en av brønnene i elektrode rengjøringsmiddelet. Åpne lokket på bioanalyzer og plasser elektrode ren i det. Lukk lokket og ruge i ca. 10 s. Åpne lokket og fjern elektrode ren. Vent en annen 10 s for å la vannet på elektrodene til å fordampe og Lukk lokket.

4. analyser resultatene av fragment dimensjonering

Merk: Referanse prøvene bør forsterkes og analyseres av de samme termiske cycler og bioanalyzer i samme bunke som de ukjente prøvene.

  1. Når bioanalyzer er fullført, eksporterer du topp dataene fra hver kjøring som en CSV-tabell fil for senere analyse.
  2. Start analyseprogramvaren og åpne den eksporterte. csv peak Table filen fra trinn 4,1.
  3. Gjennom QC Menu-fanen, se gjennom regression linjen montert på de fire punktene (vist som blå diamanter på tomten) fra de to referanse prøvene. R2 -verdien til regression linjen skal være > 0.98 (typiske verdier overstiger 0,999).
  4. På resultat -menyen kontrollerer du gjentakelses størrelsen for hvert utvalg med fragment lengde (r) som automatisk tegnes inn mot den lineære standardkurven avledet fra referanse eksemplene. Programvaren gir også klassifisering av hver prøve i henhold til ulike retningslinjer.
  5. I kategorien Eksporter -meny eksporterer du resultatrapporten for hver prøve med gjentakelses numrene og diagnose klassifiseringen, i tillegg til et sammendrag av eksempel informasjon og QC-rapport for hver kjøring.
    Merk: Analyseprogramvare tillater bruk av egendefinerte klassifiserings retningslinjer, slik som American College of Medical genetikk (ACMG) eller klinisk molekylær genetikk Society/European Society of Human genetikk (CMGS/ESHG) retningslinjer, samt forhåndsdefinerte klassifisering Kriterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Størrelses resultatene av den premutation kvinnelige referanse prøven (NA20240, gjenta størrelser på 30 og 80) og full mutasjon kvinnelig referanse prøve (NA20239, gjenta størrelser på 20 og 200) er vist i figur 1a og figur 1B, henholdsvis. Vanligvis er to markør topper (nedre markør 50 base parene [BP] og øvre markør 10 380 BP) inkludert i fragment størrelse profil. Det er vanligvis en primer kompleks topp med en størrelse på nesten 95 BP. Gjennom referanse prøven kan en lineær regresjon standard kurve med fire punkter konstrueres, som vist i figur 1C.

Den representative størrelsen funksjoner av klinisk normal, middels, premutation, og full mutasjon prøvene er vist i figur 2A-D. Spesielt mosaikk fulle mutasjoner med to utvidet fragment topper og en normal topp er presentert i figur 2e. I noen kvinnelige tilfeller, bare en topp vises i mikrovæskebasert elektroforese resultater, som vist i figur 2F. Dette kan forklares ved presentasjon av normal homozygote alleler (med samme CGG gjenta tall i de to alleler) i disse tilfellene eller manglende evne til å skille heterozygot alleler som har gjenta tall forskjeller på fire eller mindre29. Disse ene topp resultatene kan imidlertid klassifiseres som normalt, fordi det har blitt validert at PCR-basert rørledning muliggjør robust forsterkning og påvisning av full mutasjon eller premutation alleler, noe som minimerer muligheten for falske negative Denne situasjonen. En type sub-optimale situasjonen er Baseline bias, som vist i figur 2g, som kan produsere tvetydige eller uninterpretable resultater i noen tilfeller. En slik tilstand mistenkes å være forårsaket av et instrument problem. De målte fragment størrelsene til ukjente prøver tegnes inn mot den lineære standardkurven avledet fra referanse eksemplene for å automatisk beregne repetisjons størrelsene ved hjelp av analyseprogramvaren, som vist i figur 2h. Fragment størrelser som er mindre enn 200 repetisjoner, interpolert i den lineære standardkurven, mens større allel i full mutasjon måles med ekstrapolere langs samme standard linje. Programvaren viser også klassifisering av hver prøve i henhold til ulike retningslinjer.

Figure 1
Figur 1: Skalerings resultatene for de kvinnelige referanse prøvene og den tilsvarende lineære regresjon-kurven. (A, B) viser størrelsen funksjoner av premutation kvinnelige referanse PRØVEN (NA20240, gjenta størrelser på 30 og 80) og full mutasjon kvinnelig referanse prøve (NA20239, gjenta størrelser på 20 og 200), henholdsvis. To markører (nedre markør, 50 BP og øvre markør 10380 BP) er inkludert i det elektroforese resultatet for hver prøve. Toppen med en størrelse på nesten 95 BP indikerer en primer kompleks. Svarte piler angir topp størrelsen på primer kompleks, og blå piler representerer fragment lengden på referanse prøven. (C) lineær regresjon standard kurve med fire punkter (blå diamanter) fra de to referanse prøvene er bygget i analyseprogramvaren. De horisontale og vertikale aksene viser de beregnede CGG tallene og den målte fragment lengden i mikrovæskebasert elektroforese. R2 -verdien av regresjon var 0,99967. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representative resultater av kliniske prøver med ULIK CGG-gjentakelses størrelse. (A-E) viser representative størrelsen funksjoner ved bioanalyzer i rekkefølgen av normal (med fragment lengder på 328 bp og 353 BP, tilsvarende til gjenta tall på 28 og 36), middels (med fragment lengder av 335 bp og 390 BP, tilsvarende til Gjenta tall på 30 og 49), premutation (med fragment lengder på 332 BP og 439 BP, tilsvarende gjenta tall på 29 og 65), full mutasjon (med fragment lengder av 337 BP og 1911bp, tilsvarende gjenta tall på 31 og 545) og mosaikk full mutasjoner (med fragment lengder på 349 BP, 1201 BP og 2688 BP, tilsvarende gjenta antall 33, 294 og 751) prøver. (F) presenterer en enkelt-peak mikrovæskebasert elektroforese resultat (med en fragment lengde på 334 BP, tilsvarende gjenta antall 30) av en kvinne som sannsynligvis har homozygote alleler (med samme CGG gjenta tall i de to alleler) eller heterozygot alleler (med CGG repetisjons nummer forskjeller på fire eller færre). (G) viser en type av sub-optimale situasjonen som er Baseline bias. Svarte piler angir topp størrelsen på primer kompleks, og røde piler representerer fragment lengden på prøven. (H) viser hoved resultat grensesnittet for analyseprogramvaren. De målte fragment størrelsene til ukjente prøver tegnes inn mot den lineære standardkurven for å beregne gjentakelses størrelsene automatisk. Den normale allel av mosaikk full mutasjon kvinnelige prøven vist i (E) er tilordnet til standardkurven i nedre venstre hjørne av koordinat aksen regionen (plottet i grønt), og den større full-mutasjon alleler (plottet i rødt) ekstrapolert utover fire standard punkter (blå diamanter på kurven). Tabelldelene i den nedre halvdelen av figuren presenterer fragment størrelsene og den tilsvarende diagnostiske klassifiseringen i henhold til de valgte ACMG retningslinje grensene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FXS er den nest vanligste årsaken til intellektuell svekkelse etter Trisomi 21, sto for nesten halvparten av X-tilknyttede mental retardasjon30, som kan påvirke ca 1 av 4 000 menn og 1 av 8 000 kvinner. Enda viktigere, nesten 1 av 250-1000 kvinner bære en premutation, og denne frekvensen er 1 i 250-1600 i menn26,31,32,33. Siden risikoen for CGG gjenta ekspansjon til fulle mutasjoner ved overføring av premutation alleler til avkom dramatisk løfter, for eksempel fra 4% når morens gjenta størrelsen er 55 til 59 til 98% når størrelsen er 100 – 20014, fastsettelse av CGG Gjenta størrelse på et bredere spekter kan forenkle diagnostisering av FXS og screening av premutation bærere for deres reproduktive planlegging. PCR-baserte metoden innført her er nøyaktig, rask og robust for å forsterke gjenta sekvenser i 5 ' UTR av FMR1 promoter og kvantifisere hele SPEKTERET av CGG gjenta tall på en mikrovæskebasert kapillær elektroforese instrument, og dermed kan øke sin brede anvendelse i molekylær diagnose og screening av FXS og skjøre X-relaterte lidelser med mindre turn-around tid og investeringer i utstyr. Det bioanalyzer instrumentet kan trygt benyttes i lav til moderat gjennomstrømming test innstillinger for gjenta størrelse måling. Utstyret er mye mindre, mindre kostbart og enklere å vedlikeholde enn andre kapillær elektroforese instrumenter, slik som ABI kapillær genetiske analyserer. For høyt volum screening gir MultiDX-systemet med opp til 384-sample-modellen en omfattende fleksibilitet og gjennomstrømning for testene.

Analysen inneholder fire hoved trinn: PCR forsterkning av repetisjons sekvensene i 5 ' UTR av FMR1 PROMOTER (PCR-oppsett og PCR-forsterkning tar nesten 3,5 h), rensing av PCR-produkter (tar nesten 1 time), fragment dimensjonering på en mikrovæskebasert kapillær elektroforese instrument (tar nesten 1 h), og tolkning av antall CGG gjentar ved hjelp av analyseprogramvaren ved inferring fra referanse standardene med kjente repetisjoner (tar nesten 0,5 t). I alt turn-rundt tidspunktet for denne analysen er ca 6 h. For optimal ytelse bør DNA-prøver renses for å fjerne antatte forstyrrende stoffer som proteiner og høye salt konsentrasjoner. I tillegg er den anbefalte mengden av inn data DNA 50 – 100 ng per 20 μL av PCR-reaksjonen. DNA-beløp større enn 150 ng per 20 μL av PCR-systemet har vist å resultere i dårlig forsterkning av store gjentatte alleler. Videre er det sterkt anbefalt å sette opp minst to referanse prøver med godt preget gjenta størrelser i hver PCR kjøre for samtidig analyse av gjenta tall som kvalitetskontroll og påfølgende automatiserte fragment dimensjonering i analyseprogramvare 29. vanligvis skal R2 -verdien av den lineære regresjon kurven avledet fra referanse prøvene være større enn 0,98. I tillegg bør PCR-produktene renses før mikrovæskebasert kapillær elektroforese for å forbedre deteksjons effektiviteten. Ettersom PCR-primer er merket med FAM-fluorescens29, kan fragment dimensjonering med et passende elektroforese system (f.eks. Bioanalyzer og MultiDX-systemet) utføres direkte uten ekstra merking.

En rekke metoder for diagnostisering og studier av FXS og relaterte lidelser har blitt grundig gjennomgått av Bruce E. Hayward et al., inkludert DNA-baserte analyser og FMRP protein analyser34. Som i de fleste tilfeller molekyl grunnlaget for FXS er dynamisk mutasjon preget av en ekspansjon CGG gjenta i arrangøren regionen FMRP1 Gene, Southern blotting og forsterkning-baserte analyser ved hjelp av genomisk DNA er de mest brukte analysene for å bestemme repetisjons nummeret. Det er velkjent at PCR-baserte analyser overweigh Southern blotting i kostnadseffektivitet og minimum DNA-beløp kravet. Forsterkning av CGG-REPEAT er imidlertid en stor utfordring siden høyt GC-innhold kan påvirke effektiviteten, og mye innsats har blitt gjort for optimalisering av PCR-systemet gjennom årene34. Den skjøre X PCR-pakken er optimalisert for nøyaktig forsterkning av hele CGG trinucleotide repetisjoner, og en validerings studie om utførelsen av denne PCR-baserte metoden har tidligere blitt rapportert av vår gruppe29. En lignende PCR-basert metode ble rapportert av Mailick seltzer et al. i 201235, men ABI 3730xl instrumentet ble brukt for å gjenta størrelsen besluttsomhet og bare individer med gjenta størrelse mindre enn 200 ble identifisert. Dette kan skyldes det faktum at deres valgte plattformen ikke var i stand til å oppdage de større repetisjoner med gjenta størrelse over 200. I kontrast, bioanalyzer instrumentet vi bruker tilbyr en mer robust fragment dimensjonering analysen, som det kan nøyaktig og kostnadseffektivt oppdage hele spekteret av FMR1 CGG gjenta inkludert full mutasjoner29.

Med unntak av gjentakelses nummer må flere andre faktorer også fastslås for hensiktsmessig diagnostisering av FXS-og FXS-relaterte lidelser, inkludert FMR1 mutasjon, omfanget av metylering og mosaikk34. Den metylering status kan overvåkes av ulike metoder som inkorporering av pre-fordøyelsen trinn ved hjelp av metylering-sensitive restriksjon enzym eller bisulfite modifikasjon analysen34, men vår analysen er ute av stand til å bestemme metylering status på 5 ' UTR av FMR1 arrangøren. I tillegg, utvidelsen risikoen for en FMR1 allel også avhengig av tilstedeværelsen av AGG avbrudd, som kan stabilisere genet under overføring. PCR-baserte repetisjons analyser har blitt endret for å oppdage AGG-avbrudd, mens fordøyelsen enzym ustabilitet er en av de viktigste begrensningene. Triplet-primet (TP) PCR ved hjelp av en hybrid PCR primer binding i CGG gjentar eller AGG avbrudd er en annen type PCR-analysen som kan oppdage CGG gjenta størrelse og AGG avbrudd samtidig. Den FMR1 gen spesifikke PCR-metoden vi har beskrevet, er imidlertid ikke i stand til å identifisere AGG-avbrudd med mindre FMR1 Gene-sekvensering etter at forsterkningen er utført. I det siste har Hayward et al. rapportert om PCR-metodene som brukes i eget laboratorium for bestemmelse av alle parametrene som er nødvendige for en fullstendig genetisk workup eller grundig laboratorie studie, inkludert analyser som kan påvise repetisjons nummer, AGG-status og metylering status36. Dessverre, verken analysen er i stand til å omfattende bestemme alle disse faktorene oppdatert.

Det er verdt å merke seg at analysen ikke er i stand til å oppdage slettinger eller single-nukleotid varianter innenfor FMR1 genet, som utgjør ca 1% av FXS tilfeller27. I sjeldne tilfeller, hos personer som har mobil mosaikk for FMR1 gjentakelse, kan PCR gi et falskt negativt resultat på grunn av svikt i påvisning av mosaikk for større premutation og full mutasjon alleler37,38. Det har vist seg at terskelen til denne PCR-baserte analysen for en hel mutasjon hann prøve (341 repetisjoner) er 2,5% når topp detektor terskelen er satt til tre fluorescens enheter over opprinnelig plan29. Southern blot analyse anbefales i tilfeller hvis mosaikk alleler er indikert. Videre, med hensyn til elektroforese plattformene, har tidligere studier indikert at sammenlignet med kapillær elektroforese systemer (f. eks, ABI 3130XL instrument), er bioanalyzer instrumentet i stand til å differensiere den normale homozygote kvinnelige prøver med individuelle fragment topper fra kvinnelige prøver med heterozygot gjenta størrelser som har gjenta tall forskjeller på fire eller mindre29. Disse enkelt topp prøvene kan imidlertid klassifiseres som normalt, fordi det har blitt validert at denne PCR-baserte rørledningen muliggjør robust forsterkning og påvisning av full mutasjon eller premutation alleler, noe som minimerer muligheten for falske negative Denne situasjonen. Uavhengig av begrensningene ovenfor, kan metoden benyttes som en første-lags rørledning for molekylær identifisering av FXS og skjøre X-assosierte sykdommer med kostnadseffektivitet, robusthet og rask rapportering tid, supplert med sekvensering av FMR1 gen og Southern blot analyse av metylering nivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra NSFC Emergency Management Project (Grant nr. 81741004), National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 81860272), den store forsknings plan av Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Gi nei. AB16380219), Kina postdoktor Science Foundation Grant (Grant no. 2018M630993), og Guangxi Natural Science Foundation (Grant no. 2018GXNSFAA281067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M. Jr, et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Tags

Genetikk polymerase kjedere reaksjon mikrovæskebasert kapillær elektroforese cytosin-Guanin-Guanin gjentar trinucleotide skjøre X mental retardasjon-1 promoter skjør X syndrom full mutasjon premutation
En robust polymerase Kjedere reaksjon-basert analyse for kvantifisere Cytosin-Guanin-Guanin Trinucleotide gjentar i skjøre X mental retardasjon-1 Gene
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung,… More

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter