Summary
Fragile X mental retardasyon-1 genindeki sitozin-guanin-guanin trinükleotid tekrarlarının ölçülmesi için doğru ve sağlam polimeraz zincir reaksiyonu esaslı bir test, Kırılgan X sendromu ve Fragile X ile ilişkili moleküler tanı ve taramayı kolaylaştırır daha kısa dönüş süresi ve ekipman yatırımı ile bozukluklar.
Abstract
Kırılgan X sendromu (FXS) ve ilişkili bozukluklar, Fragile X mental retardation-1(FMR1)gen organizatörünün 5' çevrilmemiş bölgesinde (UTR) sitozin-guanin-guanin (CGG) trinükleotid tekrarının genişlemesinden kaynaklanır. Geleneksel olarak, genetik bir analizör üzerinde kapiller elektroforez parça analizi FMR1CGG tekrarları boyutlandırma için kullanılır , ancak tekrar sayısı 200 daha yüksek olduğunda tam ölçüm için ek Güney leke analizi gereklidir. Burada, FMR1CGG tekrarlarının sayısallaştırılması için doğru ve sağlam polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı bir yöntem salıyoruz. Bu testin ilk adımı, Kırılgan X PCR kiti kullanılarak FMR1 organizatörü5'UTR'deki tekrar dizilerinin PCR amplifikasyonudur, ardından PCR ürünlerinin saflaştırılması ve mikroakışkan kapiller elektroforez aletinde parça boyutlandırması ve analiz yazılımı kullanarak bilinen tekrarlar ile standartlaratıfta bulunarak CGG tekrarları sayısının sonraki yorumu. Bu PCR tabanlı test tekrarlanabilir ve 200'den fazla (tam mutasyon olarak sınıflandırılır), 55-200 (premutasyon olarak sınıflandırılır), 46-54 (orta) ve 10'dan fazla tekrar numarası na sahip olanlar da dahil olmak üzere FMR1 organizatörlerinin CGG tekrarlarının tüm yelpazesini tanımlayabilme yeteneğine sahiptir ve 10 45 (normal). FXS ve Fragile X ile ilişkili bozuklukların sağlamlık ve hızlı raporlama süresi ile sınıflandırılmasını kolaylaştıran uygun maliyetli bir yöntemdir.
Introduction
Kırılgan X sendromu (FXS) ve Kırılgan X ilişkili bozukluklar, örneğin, titreme ve ataksi sendromu (FX-TAS) ve primer yumurtalık yetmezliği (FX-POI) esas olarak 5' çevrilmemiş trinükleotid tekrar genişleme sitozin-guanin-guanin (CGG) neden olur Xq27.31,2'deKırılgan X mental retardasyon-1(FMR1)geninin bölge (UTR) FMR1 kodlanmış protein (FMRP), mRNA veya modüle sentezin inkbiyotasyon, stabilite ve dendritik taşınmasını düzenleyerek nöronal gelişim ve sinaptik plastisitede işlev veren poliribozom ile ilişkili RNA-bağlayıcı bir proteindir. kısmi postsinaptik proteinlerin3,4,5,6,7.
>200 CGG tekrar boyutu ile dinamik varyasyon tam mutasyon olarak tanımlanır, hangi anormal hipermetilasyon ve FMR1 organizatörü sonraki transkripsiyonel susturma neden olur8. Ortaya çıkan fmrp protein yokluğu veya eksikliği normal nöronal gelişimi bozar veFXSneden 9 , çeşitli klinik belirtiler ile karakterize, şiddetli zihinsel özürlülük orta dahil olmak üzere, gelişimsel gecikme, hiperaktif davranışlar, kötü temas ve otistik belirtileri10,11,12. Kadın FXS hastalarında sunum genellikle erkeklerde olduğundan daha hafiftir. 55-200 ve 45-54 arasında değişen CGG tekrar boyutu sırasıyla premutasyon ve ara durum olarak sınıflandırılır. İstikrarsızlık yüksek derecede nedeniyle, bir premutasyon veya ara alel CGG tekrar boyutu muhtemelenyavru13,14iletildiğinde genişletir . Bu nedenle, premutasyon alelleri olan taşıyıcılar tekrar genişleme nedeniyle FXS etkilenen çocuk sahibi olma riski yüksektir, ve bazı durumlarda, ara aleller iki nesil boyunca tam mutasyon aralığına tekrar boyutunu genişletebilirsiniz15, 16. yıl. Ayrıca, premutasyon ile erkekler de geç başlangıçlı FX-TAS17,18,19gelişme riski iletmek, premutasyon kadın hem FX-TAS ve FX-POI için yatkın iken20, 21,22. Son zamanlarda, bu gelişimsel gecikme ve sosyal davranışlarda sorunlar ile otistik spektrum bozuklukları premutasyon FMR1 alelleri23olan çocuklarda sunulmaktadır bildirilmiştir,24.
Tam CGG tekrar boyutunu belirlemek için sınıflandırma ve FXS ve Kırılgan X ilişkili bozuklukların tahmini için büyük öneme sahiptir25,26. Tarihsel olarak, CGG tekrar bölgeye özgü polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) parça boyutlandırma artı Güney leke analizi ile FMR1 CGG tekrar27moleküler profilleme için altın standart olmuştur. Ancak, geleneksel spesifik PCR 100-130'dan fazla tekrarile büyük premütasyonlara karşı daha az duyarlıdır ve tam mutasyonları yükseltmekten acizdir27,28. Ayrıca, tekrar boyutlandırma için geleneksel bir genetik analizör üzerinde kılcal elektroforez fazla 200 CGG tekrarları ile FMR1 PCR ürünleri tespit etmek için başarısız olur. Güney leke analizi, normalden tam mutasyon tekrar sayılarına kadar daha geniş bir tekrar boyutu aralığının farklılaşmasını sağlar ve tam mutasyonu doğrulamak için (erkeklerde) ve heterozigot alelleri tam mutasyonile ayırt etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. normal tekrar boyutları ile görünüşte homozigot aleller (kadınlarda). Ancak, yinelemeleri ölçmek için çözünürlük sınırlıdır. Daha da önemlisi, bu adım adım test stratejisi emek yoğun, zaman alıcı ve maliyet-etkisiz.
Burada, FMR1CGG tekrarları nicelleştirme için doğru ve sağlam PCR tabanlı bir yöntem salıyoruz. Bu testin ilk adımı, Fragile X PCR kitini kullanarak FMR1 organizatörün 5'UTR'deki tekrar dizilerinin PCR yükseltilmesidir. PCR ürünleri saflaştırılır ve parça boyutlandırma bir mikroakışkan kapiller elektroforez aleti üzerinde gerçekleştirilir ve analiz yazılımı kullanılarak CGG tekrarlarının sayısının daha sonra yorumlanması, PCR parça uzunluğunun CGG tekrarlarının sayısıyla doğru orantılı olduğu gerekçesi. PCR sistemi, gc açısından zengin trinükleotid tekrar bölgesinin amplifikasyonunu kolaylaştıran reaktifler içerir. Bu PCR tabanlı test tekrarlanabilir ve FMR1 organizatörleri CGG tekrarları tüm aralıkları tespit yeteneğine sahiptir. Bu daha az dönüş süresi ve ekipman yatırım ile FXS ve Kırılgan X ile ilgili bozuklukların moleküler tanı ve tarama geniş uygulama bulabilirsiniz ve böylece, klinik daha geniş bir yelpazede kullanılabilir maliyet-etkin bir yöntemdir Laboratuvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hong Kong Ortak Çin Üniversitesi tarafından etik onay verildi―Yeni Bölgeler Doğu Küme Klinik Araştırma Etik Komitesi (Referans Numarası: 2013.055)
1. PCR amplifikasyon
- Başlamadan önce, -20 °C'lik dondurucudan PCR tampon karışımını, numune dilüent ve DNA örneklerini (hem test hem de referans DNA) çıkarın ve tüm reaktiflerin ve DNA'nın tamamen çözülmesini sağlamak için 20-30 dakika oda sıcaklığında tutun. Vorteks ve kısaca kullanmadan önce aşağı spin.
- DNA örneklerinin konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün (bkz. Malzeme Tablosu). DNA konsantrasyonu 25 ng/μL olmalıdır; gerekirse uygun konsantrasyona seyreltici numune ile seyreltin.
NOT: DNA ayıklanır ve proteinler ve yüksek tuz konsantrasyonları gibi müdahale maddeleri kaldırmak için saflaştırılmalıdır. Sonraki PCR amplifikasyon ve analizi için (A260/A280: 1.8-2.0 ve A260/A230: >1.0) bozulmamış, yüksek kaliteli DNA kullanılmalıdır. - Referansı ve test edilmiş DNA örneklerini belirlemek için bir PCR plaka veya 0,2 mL PCR tüplerinin kuyularını etiketleyin.
- Test numuneleri, 2 referans örneği ve negatif kontrol numunesi için gerekli PCR reaksiyonlarının sayısını hesaplayın. HER reaksiyon için 15 μL PCR tampon karışımı, 2,6 μL numune dilüent ve 0,4 μL polimeraz ekleyerek PCR Master Mix'i hazırlayın.
NOT: PCR performansını izlemek için örnek dilüent kullanarak negatif kontrol esastır. PcR ana karışımını oda sıcaklığında hazırlayın, buz üzerinde pipet yapmayın. PCR tampon karışımı viskoz. Tüpü karıştırın ve kullanmadan önce kısa bir süre aşağı doğru döndürün. - Vortex 10-20 s için adım 1.4 PCR ana karışımı ve aşağı spin. Karışımın 18 μL'sini her kuyuya veya tüpe yavaşça dağıtın.
- Girdap ve DNA örneklerini aşağı çevir. 20 μL'lik son bir PCR hacmi için her DNA'nın 2 μL'si uygun kuyuya veya tüpe. 5 kez yukarı ve aşağı boru lar atarak karıştırın.
NOT: Reaksiyon başına toplam DNA miktarı 50-100 ng olmalıdır. 20 μL PCR reaksiyonu başına 150 ng'den büyük DNA miktarları büyük tekrar alellerinin zayıf amplifikasyonuna neden olabilir. Daha düşük konsantre DNA'lar için, PCR ana karışımındaki numune dilüent miktarı DNA çözeltisi ile değiştirilebilir. - Plakayı yapışkan plakalı mühürleyici veya tüp kapaklı kapatın.
- Mühürlü PCR plakayı veya tüpleri ısıtmalı kapaklı termal döngüye yerleştirin. Programı aşağıdaki ayarlarla çalıştırın: 5 dk için 95 °C, ardından 98 °C'de 35 s için 25 devir denaturing, 59 °C'de 35 s ve 72 °C'de 4 dk boyunca uzatma; 10 dk. PCR ürünlerini daha fazla işleme için çıkarılana kadar devre arasında 4 °C'de tutun.
- PCR amplifikasyonundan sonra ürünleri hemen arındırın ve analiz edin veya bir gecede +2 ila +8 °C'de saklayın. Alternatif olarak, ürün -30 ila -16 °C'de 30 güne kadar saklanabilir.
2. PCR Ürünlerinin Saflaştırılması
- Kuvöz çalkalayıcıyı 65 °C'ye önceden ısıtın.
- Her PCR reaksiyonu için, bölüm 1'deki her PCR ürününün 20 μL'sine 80°L 1x TE tamponu ekleyin (Malzeme Tablosunabakın).
- Örnek karışımı çok kanallı bir pipet kullanarak pcr temizleme plakasına aktarın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Plakayı ortaya çıkarın ve kuvöz çalkalayıcının içine yerleştirin ve 10 dakika boyunca 1.200 rpm sallayarak 65 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra vakum aleti250 mbar (veya 25 kPa, 188 mmHg, Hg'de 7,4) olarak ayarlayın ve çözeltiyi 15 dk. Kuyular'ın sıvı kalmaması için filtreden aspire edin.
- Kuvöz çalkalayıcıyı 25 °C'ye kadar soğutun.
- İlk aspirasyondan sonra, vakumu kapatın ve her kuyuya 50°L 1x TE tampon ekleyin. Karıştırmayın. Adım 2.5 vakum ayarlarını kullanarak 10 dk için çözüm aspire.
- Filtre plakasının altını kağıt havlu yığınına sıkıca bastırarak kurulayın.
- Her kuyunun alt merkezine 20°L 1x TE tampon ekleyin. 5 dakika boyunca 1.200 rpm sallayarak 25 °C'de kuvöz shaker ve kuluçka plaka yerleştirin.
- Kuluçkadan sonra, saflaştırılmış her PCR DNA'sının >15 μL'sini adım 2,9'dan yeni bir 96 kuyulu PCR plakasına aktarın. Saflaştırılmış DNA doğrudan analiz edilebilir veya alternatif olarak -30 ila -16 °C'de istenilen ekadar saklanabilir.
3. PCR Ürünlerinin Parça Boyutlandırılması
- Başlamadan önce, DNA boyası konsantresi, DNA jel matrisi, DNA markeri, DNA merdiveni ve saflaştırılmış DNA örneklerini adım 2'den 30 dakika oda sıcaklığına kadar dengelemesine izin verin.
-
Astar istasyonunu kur.
- Yeni bir reaktif ler kullanırken şırıngayı değiştirin (Bkz. Malzemeler Tablosu).
- Taban plakasını ayarlayın ve şırınga klibinin kolu serbest bırakın ve üst konuma doğru kaydırın.
- Boyutlandırma yazılımını başlatın (Bkz. Malzeme Tablosu)ve jel-boya karışımını hazırlayın.
-
Girdap boya 10 s için konsantre ve aşağı spin. Bir jel matris şişeye boyanın 25 μL'sini ekleyin. Girdap karışık çözüm iyi ve aşağı spin.
- Jel-boya karışımını bir spin filtresine aktarın. Spin filtresini mikrosentrifuge yerleştirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1.500 x g ± %20 oranında döndü.
NOT: Çözeltiyi Boya ile ışıktan koruyun ve kullanımdan sonra 4 °C'de saklayın. Jel-boya karışımı yaklaşık 15 cips için bir kez hazırlandıktan için kullanılabilir. Jel-boya karışımı kullanmadan önce her zaman 30 dakika oda sıcaklığına dengelemek için izin verin.
- Jel-boya karışımını bir spin filtresine aktarın. Spin filtresini mikrosentrifuge yerleştirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1.500 x g ± %20 oranında döndü.
-
Jel boya karışımını yükleyin.
- Astar istasyonuna yeni bir DNA çipi yerleştirin. Kuyuya 9 μL jel boya karışımı ekleyin "G" ile işaretlenmiş. Lütfen pistonun 1 mL işaretine yerleştirdiğinden emin olun ve astar istasyonunu kapatın.
- Şırınga pistonuna klip tarafından tutulana kadar bastırın. Tam olarak 30 s bekleyin sonra klibi bırakın. 5 s bekleyin ve sonra yavaş yavaş 1 mL konumuna geri piston çekin.
- Astar istasyonunu açın ve "G" ile işaretlenmiş kuyulara 9 μL jel-boya karışımı ekleyin.
- Merdiven simgesiyle işaretlenmiş kuyuya 5 μL işaretleyici ekleyin ve ayrıca 12 örnek kuyunun her birine 5 μL marker ekleyin. Kuyuları boş bırakmayın.
- Merdiven sembolü ile işaretlenmiş kuyuya 1 μL DNA merdiveni ekleyin. 12 numune kuyunun her birine 3,1 veya 1 μL ultra saf su (kullanılmayan kuyular) adımlarından 1 000 ADET PCR ürünü (kullanılmış kuyular) ekleyin. Çipi belirtilen ayarda (2.400 rpm) 1 dakika boyunca girdap karıştırıcıve girdap adaptörüne yatay olarak koyun.
- Çipi biyoanalizör aletine yerleştirin ve çipi 5 dakika içinde alete çalıştırın.
- Titretamamı tamamlandıktan sonra, kullanılan çipi hemen cihazdan çıkarın.
- Elektrot temizleyicisinin kuyularından birine yavaşça 350 μL deiyonize su ekleyin. Biyoanalizörün kapağını açın ve elektrot temizleyicisini içine yerleştirin. Kapağı kapatın ve yaklaşık 10 s. Kapağı açın ve elektrot temizleyici çıkarın. Elektrotlar üzerindeki suyun buharlaşmasını sağlamak için 10 s daha bekleyin ve kapağı kapatın.
4. Parça Boyutlandırma Sonuçlarını Analiz Etme
NOT: Referans numuneler, bilinmeyen numunelerle aynı toplu olarak aynı termal döngücü ve biyoanalizör tarafından güçlendirilmeli ve analiz edilmelidir.
- Bioanalyzer çalışması tamamlandıktan sonra, sonraki çözümleme için her çalıştırmadaki en yüksek verileri .csv tablo dosyası olarak dışa aktarın.
- Analiz yazılımını başlatın ve dışa aktarılan .csv tepe tablosu dosyasını adım 4.1'den açın.
- QC menü sekmesi aracılığıyla, iki referans örneğinden dört noktaya (arsa üzerinde mavi elmas olarak gösterilir) monte edilen regresyon çizgisini gözden geçirin. Regresyon çizgisinin R2 değeri >0.98 olmalıdır (tipik değerler 0.999'u aşar).
- Sonuçlar menüsü sekmesi nden, parça uzunluğu(lar) referans örneklerinden türetilen doğrusal regresyon standart eğrisine göre otomatik olarak çizilen her numunenin yinelenen boyutunu kontrol edin. Yazılım aynı zamanda her numunenin farklı yönergelere göre sınıflandırını sağlar.
- Dışa Aktarma menüsü sekmesi aracılığıyla, her örnek için sonuç raporunu yinelenen sayılar ve tanılama sınıflandırması ile birlikte her çalıştırma için örnek bilgilerin ve QC raporunun bir özetini dışa aktarın.
NOT: Analiz yazılımı, American College of Medical Genetics (ACMG) veya Clinical Molecular Genetics Society/ European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG) yönergeleri ve önceden tanımlanmış sınıflandırma gibi özel sınıflandırma kılavuzlarının kullanılmasına olanak sağlar. Ölçüt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutasyon öncesi kadın referans örneğinin boyutlandırma sonuçları (NA20240, 30 ve 80 tekrar boyutları) ve tam mutasyon kadın referans örneği (NA20239, 20 ve 200 tekrar boyutları) sırasıyla Şekil 1A ve Şekil 1B'degösterilmiştir. Tipik olarak, parça boyutu profilinde iki işaretçi tepe noktası (alt marker 50 baz çifti [bp] ve üst marker 10.380 bp) yer almaktadır. Genellikle yaklaşık 95 bp boyutu ile bir astar karmaşık zirve vardır. Referans örnek aracılığıyla, Şekil 1C'desergilendiği gibi dört noktalı doğrusal bir regresyon standart eğrisi oluşturulabilir.
Klinik normal, ara, premutasyon ve tam mutasyon örneklerinin temsili boyut özellikleri Şekil 2A-D'degösterilmiştir. Özellikle, iki genişletilmiş parça tepe ve bir normal tepe ile mozaik tam mutasyonlar Şekil 2Esunulmaktadır. Bazı kadın olgularda, Şekil 2F'degösterildiği gibi mikroakışkan elektroforez sonuçlarında sadece bir tepe gösterilir. Bu durum, normal homozigot alellerin (iki alelde aynı CGG tekrar numaraları ile) sunumu veya tekrar sayı farkları dört veya daha azolanheterozigot alellerin ayırt edilememesi ile açıklanabilir. Ancak, bu tek tepeli sonuçlar normal olarak sınıflandırılabilir, çünkü PCR tabanlı boru hattının sağlam amplifikasyon ve tam mutasyon veya premutasyon alellerinin saptanmasına olanak sağladığı doğrulanmıştır, bu da yanlış negatif bu durum. Alt-optimal durum bir tür temel önyargı, Şekil 2Ggösterildiği gibi , bazı durumlarda belirsiz veya yorumlanamayan sonuçlar üretebilir. Böyle bir durumun bir enstrüman sorunundan kaynaklandığından şüpheleniliyor. Bilinmeyen örneklerin ölçülen parça boyutları, Şekil 2H'degösterildiği gibi, analiz yazılımını kullanarak yinelenen boyutları otomatik olarak hesaplamak için referans örneklerinden türetilen doğrusal regresyon standart eğrisine göre çizilir. 200'den az tekrarın parça boyutları doğrusal regresyon standart eğrisine enterpolasyon ait ken, daha büyük tam mutasyon alel boyutları aynı standart çizgi boyunca ekstrapolating ile ölçülür. Yazılım ayrıca her numunenin farklı yönergelere göre sınıflandırını görüntüler.
Şekil 1: Kadın referans örneklerinin boyutlandırma sonuçları ve buna karşılık gelen doğrusal regresyon eğrisi. (A, B) mutasyon öncesi kadın referans örneğinin (NA20240, 30 ve 80 tekrar boyutları) ve tam mutasyon kadın referans örneğinin (NA20239, tekrar boyutları 20 ve 200) boyutözelliklerini gösterir. Her örnek için elektroforez sonucuna iki belirteç (alt marker, 50 bp ve üst marker 10380 bp) dahildir. Yaklaşık 95 bp boyutu ile tepe bir astar kompleksi gösterir. Siyah oklar astar kompleksinin en yüksek boyutunu gösterir ve mavi oklar referans örneğinin parça uzunluğunu temsil eder. (C) İki referans örneğinden dört noktalı (mavi elmas) doğrusal regresyon standart eğrisi analiz yazılımında oluşturulur. Yatay ve dikey eksenler hesaplanan CGG tekrar numaralarını ve mikroakışkan elektroforezde ölçülen parça uzunluğunu gösterir. Regresyonun R2 değeri 0,99967 idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı CGG tekrar boyutuna sahip klinik örneklerin temsili sonuçları. (A–E)biyoanalizör tarafından temsili boyut özelliklerini normal (parça uzunlukları 328 bp ve 353 bp, 28 ve 36 tekrar numaralarına karşılık gelen), orta (335 bp ve 390 bp parça uzunlukları ile, 30 ve 49 tekrar numaraları), premutasyon (332 bp ve 439 bp parça uzunlukları ile, 29 ve 65 tekrar numaralarına karşılık), tam mutasyon (337 bp ve 1911bp parça uzunlukları ile, 31 ve 545 tekrar numaraları karşılık gelen) ve mozaik tam mutasyonlar (349 bp, 1201 bp ve 2688 bp parça uzunlukları ile, 33, 294 ve 751 örneklerinin tekrar numaralarına karşılık gelen) (F) muhtemelen homozigot alelleri olan bir dişinin tek tepeli mikroakışkan elektroforez sonucu (334 bp parça uzunluğu ile, tekrar sayısına karşılık gelen) muhtemelen homozigot alelleri olan bir kadın (iki alel aynı CGG tekrar numaraları ile) veya heterozigot aleller (CGG tekrar sayı farkları dört veya daha az) ile. (G) temel önyargı alt-optimal durumun bir türü gösterir. Siyah oklar astar kompleksinin en yüksek boyutunu gösterir ve kırmızı oklar örneğin parça uzunluğunu temsil eder. (H) analiz yazılımının ana sonuç arabirimini görüntüler. Bilinmeyen örneklerin ölçülen parça boyutları, yinelenen boyutları otomatik olarak hesaplamak için doğrusal regresyon standart eğrisine çizilir. (E)'de gösterilen mozaik tam mutasyon kadınörneğinin normal alelleri koordinat ekseni bölgesinin sol alt köşesindeki standart eğriye eşlenir (yeşil olarak çizilmiş) ve daha büyük tam mutasyon alelleri (kırmızı ile çizilmiş) dört standart nokta (eğriüzerinde mavi elmas). Figürün alt yarısındaki tabular kesitler, seçilen ACMG kılavuz sınırlarına göre parça boyutlarını ve ilgili tanısınıflandırmasını sunar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FXS trizomi sonra entelektüel bozukluğun ikinci en sık nedenidir 21, X bağlı zeka geriliği yaklaşık yarısı için muhasebe30, yaklaşık 1 etkileyebilir 4,000 erkek ve 1 8.000 kadın. Daha da önemlisi, yaklaşık 1 250-1.000 kadın bir premutasyon taşımak, ve bu frekans 1 250-1.600 erkeklerde26,31,32,33. CGG'nin premutasyon alelleri yavrulara iletildiğinde tam mutasyonlara tekrar genişleme riski önemli ölçüde yükseldiğinden, örneğin anne tekrar boyutu 100-20014olduğunda %55-59'dan %98'e yükseldiğinde, CGG tayini daha geniş bir aralıkta tekrar boyutu FXS tanısı ve üreme planlaması için premutasyon taşıyıcıların tarama kolaylaştırabilir. Burada tanıtılan PCR tabanlı yöntem, FMR1 organizatörü5'UTR tekrar dizileri yükseltmek ve bir mikroakışkan kapiller elektroforez aleti üzerinde CGG tekrar numaralarının tam spektrum ölçmek için doğru, hızlı ve sağlam ve böylece olabilir daha az dönüş süresi ve ekipman yatırım ile FXS ve Fragile X ile ilgili bozuklukların moleküler tanı ve tarama geniş uygulama artırmak. Biyoanalizör aleti, tekrar boyutu ölçümü için düşük ve orta ölçekli iş testi ayarlarında güvenle kullanılabilir. Ekipman çok daha küçük, daha az maliyetli ve korumak için daha basit diğer kapiller elektroforez aletleri, ABI kapiller genetik analizörler gibi. Yüksek hacimli tarama için, 384 örnekli modele kadar multidx sistemi testler için kapsamlı bir esneklik ve üretim sağlar.
Teşbidört ana adım içerir: FMR1 organizatörü (PCR kurulum ve PCR amplifikasyon 5'UTR tekrar dizileri PCR amplifikasyon yaklaşık 3,5 saat sürer), PCR ürünlerinin saflaştırılması (yaklaşık 1 saat sürer), bir mikroakışkan üzerinde parça boyutlandırma kapiller elektroforez aleti (yaklaşık 1 saat sürer) ve bilinen tekrarlarla referans standartlarından çıkarılarak analiz yazılımı kullanılarak CGG tekrarlarının sayısının yorumlanması (yaklaşık 0,5 saat sürer). Toplamda, bu teşpin dönüş süresi yaklaşık 6 saattir. Optimum performans için, DNA örnekleri proteinler ve yüksek tuz konsantrasyonları gibi putatif müdahale maddeleri kaldırmak için saflaştırılmalıdır. Ayrıca, önerilen giriş DNA miktarı PCR reaksiyonunun 20 μL'si başına 50-100 ng'dir. PCR sisteminin 20 μL'si başına 150 ng'den büyük DNA miktarlarının büyük tekrar alellerinin zayıf amplifikasyonuna neden olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, her PCR çalıştırırken iyi karakterize leştirilmiş tekrar boyutlarına sahip en az iki referans örneğinin, analiz yazılımında kalite kontrol ve sonraki otomatik parça boyutlandırması olarak tekrarlanan sayıların eşzamanlı analizi için kurulması şiddetle tavsiye edilir. 29. Tipik olarak, referans örneklerinden elde edilen doğrusal regresyon eğrisinin R2 değeri 0,98'den büyük olmalıdır. Buna ek olarak, PCR ürünleri algılama verimliliğini artırmak için mikroakışkan kapiller elektroforez önce saflaştırılmalıdır. PCR astar FAM floresan29ile etiketlendikçe, uygun bir elektroforez sistemi (örneğin, biyoanalizör ve MultiDX sistemi) ile parça boyutlandırma ek etiketleme olmadan doğrudan yapılabilir.
Tanı ve FXS ve ilgili bozuklukların incelenmesi için çeşitli metodolojiler kapsamlı Bruce E. Hayward ve ark, DNA tabanlı tahliller ve FMRP protein tahlilleri34dahil tarafından gözden geçirilmiştir. Çoğu durumda olduğu gibi FXS'in moleküler temeli FMRP1 geninin promotör bölgesinde bir genişleme CGG tekrarı ile karakterize dinamik mutasyondur, Genomik DNA kullanılarak güney lekelenme ve amplifikasyon bazlı tahliller en sık kullanılan tahlillerdir. yinelenen sayının belirlenmesi. PcR tabanlı tahlillerin maliyet etkinliği ve minimum DNA miktarı gereksiniminde Güney lekelerine ağır bastığı bilinmektedir. Ancak, Yüksek GC içeriği verimliliği etkileyebilir beri CGG-tekrar amplifikasyon ana bir sorundur, ve çok çaba yıl içinde PCR sisteminin optimizasyonu için yapılmıştır34. Kırılgan X PCR kiti tüm CGG trinükleotid tekrarları doğru amplifikasyon için optimize edilmiştir, ve bu PCR tabanlı yöntemin performansı üzerinde bir doğrulama çalışması daha önce bizim grup29tarafından bildirilmiştir . Benzer bir PCR tabanlı yöntem Mailick Seltzer ve ark. tarafından 201235yılında rapor edilmiştir, ancak ABI 3730xl cihaz tekrar boyut tayini için kullanılmıştır ve sadece tekrar boyutu 200'den az olan bireyler tespit edilmiştir. Bunun nedeni, seçtikleri platformun 200'ün üzerinde yineleme boyutuyla daha büyük yinelemeleri algılayamamasına bağlı olabilir. Buna karşılık, kullandığımız biyoanalizör aleti, tam mutasyonlar29dahil olmak üzere FMR1 CGG tekrarının tam spektrumunun doğru ve uygun maliyetli bir şekilde algılayabildiği için daha sağlam bir parça boyutlandırma analizi sunmaktadır.
Tekrar sayısı dışında, FMR1 mutasyonu, metilasyon ve mozaiğin kapsamı dahil olmak üzere FXS ve FXS ile ilgili hastalıkların uygun tanısı için başka faktörlerin de saptanması gerekir34. Metilasyon durumu, metilasyona duyarlı restriksiyon enzimi veya bisülfit modifikasyon uyrama34kullanılarak sindirim öncesi adımların dahil edilmesi gibi çeşitli yöntemlerle izlenebilir, ancak, bizim talibi FMR1 organizatörü 5'UTR metilasyon durumu. Ayrıca, Bir FMR1 alel genişleme riski de AGG kesintileri varlığına bağlıdır, iletim sırasında gen stabilize edebilirsiniz. PCR tabanlı tekrar tahlilleri AGG-kesintileri tespit etmek için modifiye edilmiştir, sindirim enziminin instabilitesi ise ana sınırlamalardan biridir. Triplet-astarlı (TP) PCR CGG tekrarları veya AGG kesintileri bir hibrid PCR astar bağlama kullanarak aynı anda CGG tekrar boyutu ve AGG kesintileri tespit edebilirsiniz PCR tsay başka bir türüdür. Ancak, açıkladığımız FMR1 genine özgü PCR yöntemi, amplifikasyon yapıldıktan sonra FMR1 gen dizilemesi yapılmadığı sürece AGG kesintilerini belirleyemez. Son zamanlarda, Hayward ve ark tam bir genetik çalışma veya ayrıntılı laboratuvar çalışması için gerekli tüm parametreleri belirlenmesi için kendi laboratuvarlarında kullanılan PCR yöntemleri rapor, tekrar numarası tespit edebilir tahliller de dahil olmak üzere, AGG kesinti durumu ve metilasyon durumu36. Ne yazık ki, ne bir tsay kapsamlı güncel tüm bu faktörleri belirleme yeteneğine sahiptir.
Bu test fmr1 geni içinde delemler veya tek nükleotid varyantları tespit etmek mümkün değildir kayda değer, hangi FXS olguların yaklaşık% 1'ini oluşturmaktadır27. Nadiren, FMR1 tekrar için hücresel mozaisizm olan bireylerde, PCR daha büyük premutasyon ve tam mutasyon alelleri için mozaik tespit başarısızlık nedeniyle yanlış bir negatif sonuç verebilir37,38. Bu mozaik tam mutasyon erkek örnek (341 tekrarlar) için bu PCR tabanlı test eşiği, zirve dedektöreşik taban çizgisi29üzerinde üç floresan birimleri olarak ayarlandığında% 2.5 olduğu gösterilmiştir . Mozaik alellerin belirtilmiş olması durumunda güney leke analizi önerilir. Ayrıca, elektroforez platformları ile ilgili olarak, önceki çalışma, kapiller elektroforez sistemleri (örneğin, ABI 3130XL alet) ile karşılaştırıldığında, biyoanalizör cihazının normal homozigotu ayırt edemediğini göstermiştir. dört veya daha az29tekrar sayı farklılıkları var heterozigot tekrar boyutları ile kadın örneklerinden bireysel parça zirveleri ile kadın örnekleri . Ancak, bu tek tepeli numuneler normal olarak sınıflandırılabilir, çünkü bu PCR tabanlı boru hattının sağlam amplifikasyon ve tam mutasyon veya premutasyon alellerinin saptanmasına olanak sağladığı doğrulanmıştır, bu da yanlış negatif bu durum. Yukarıdaki sınırlamalardan bağımsız olarak, yöntem, FXS ve Kırılgan X ile ilişkili hastalıkların maliyet etkinliği, sağlamlık ve hızlı raporlama süresi ile moleküler olarak tanımlanması için birinci kademe bir boru hattı olarak kullanılabilir ve FMR1 geni ve Metilasyon düzeylerinin Güney leke analizi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma NSFC Acil Durum Yönetimi Projesi (Hibe No. 81741004), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81860272), Guangxi İl Bilim ve Teknoloji Vakfı Ana Araştırma Planı hibe tarafından desteklenmiştir ( Hibe No AB16380219), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı Hibe (Grant No. 2018M630993) ve Guangxi Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 2018GXNSFAA281067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
| Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
| Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
| Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
References
- Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
- Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
- Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
- Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
- Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
- Ascano, M. Jr, et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
- Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
- Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
- Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
- Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
- Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
- Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
- Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
- Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
- Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
- Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
- Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
- Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
- Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
- Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
- Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
- Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
- Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
- Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
- Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
- Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
- Saul, R. A., Tarleton, J. C.
- Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
- Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
- Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
- Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
- Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
- Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
- Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
- Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
- Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
- Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
- Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).
