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Genetics

Um ensaio robusto baseado em reação em cadeia da polimerase para quantificar repetições de trinucleotídeo de citosina-guanina-guanina em X frágil retardo mental-1 gene

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59963
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 2, 2,3, 2,3, 2, 5, 5, 6,7, 2,3
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

Um ensaio exato e robusto da reacção em cadeia do polymerase para quantificar repetições do trinucleotide da citosina-guanina-guanina no frágil X retardo mental-1 gene facilita o diagnóstico molecular e a seleção da síndrome frágil de X e do X-relacionado frágil distúrbios com tempo de virada mais curto e investimento em equipamentos.

Abstract

A síndrome de X frágil (FXS) e as desordens associadas são causadas pela expansão da repetição do trinucleotide da citosina-guanina-guanina (CGG) na região 5 ' Untranslated (UTR) do promotor do gene do retardo mental X-1 (FMR1) frágil. Convencionalmente, a análise capilar do fragmento da electroforese em um analisador genético é usada para o dimensionamento das repetições de CGG de FMR1, mas a análise adicional do Sul do Borrão é exigida para a medida exata quando o número da repetição é mais elevado do que 200. Aqui, nós apresentamos um método exato e robusto da reacção em cadeia do polymerase (PCR)-baseado para a quantificação das repetições de CGG de FMR1. A primeira etapa deste teste é a amplificação do PCR das seqüências da repetição no 5 ' UTR do promotor FMR1 usando um jogo frágil do PCR de X, seguido pela purificação dos produtos do PCR e do fragmento que cola em um instrumento capilar microfluídicos da electroforese, e interpretação subseqüente do número de repetições CGG referenciando padrões com repetições conhecidas usando o software de análise. Este ensaio PCR-baseado é reprodutível e capaz de identificar a série completa de repetições de CGG de FMR1 promotores, incluindo aqueles com um número da repetição de mais de 200 (classific como a mutação cheia), 55 a 200 (premutação), 46 a 54 (intermediário), e 10 a 45 (normal). É um método rentável que facilita a classificação do FXS e de desordens X-associadas frágeis com robustez e tempo de relatório rápido.

Introduction

A síndrome de X frágil (FXS) e as desordens associadas frágeis de X, por exemplo, a síndrome do tremor e da ataxia (FX-TAS), e a insuficiência ovariana preliminar (FX-POI) são causadas principalmente pela expansão da repetição do trinucleotide da citosina-guanina-guanina (CGG) nos 5 ' não traduzidos região (UTR) do gene frágil X retardo mental-1 (FMR1) no xq 27,31,2. A proteína FMR1 codificada (FMRP) é uma proteína de ligação de RNA associada a poliribosome que funciona no desenvolvimento neuronal e na plasticidade sináptica, regulando a emenda alternativa, estabilidade e transporte dendrítico de mRNA ou síntese moduladora de proteínas pós-sinápticas parciais3,4,5,6,7.

A variação dinâmica com um tamanho da repetição de CGG de > 200 é descrita como a mutação cheia, que induz o hipermetilação aberrante e o silenciamento transcricional subseqüente do promotor FMR1 8. A ausência ou falta resultante da proteína FMRP interrompe o desenvolvimento neuronal normal e provoca o FXS9, caracterizado por vários sintomas clínicos, incluindo incapacidade intelectual moderada a grave, atraso no desenvolvimento, comportamentos hiperativos, contatos pobres e manifestações autísticas10,11,12. A apresentação em pacientes fêmeas de FXS é geralmente mais suave do que aquela nos machos. O tamanho da repetição de CGG que varia de 55 a 200 e de 45 a 54 é classific como a pré-mutação e o status intermediário, respectivamente. Devido ao alto grau de instabilidade, o tamanho da repetição de CGG em uma pré-mutação ou alelo intermediário presumivelmente se expande quando transmitido dos pais para a descendência13,14. Assim, os portadores com alelos da pré-mutação estão no risco elevado de ter as crianças afetadas com o FXS por causa da expansão da repetição, e em alguns casos, os alelos intermediários podem expandir seu tamanho da repetição à escala cheia da mutação sobre duas gerações15, a 16. Além disso, os machos com pré-mutação também transmitem um risco aumentado de desenvolvimento de FX-tas de início tardio17,18,19, enquantoasfêmeas depré-mutação são predispostas para FX-tas e FX-POI20, 21,22. Recentemente, tem sido relatado que distúrbios do espectro autístico com atraso no desenvolvimento e problemas em comportamentos sociais são apresentados em crianças com pré-mutação FMR1 alelos23,24.

Para determinar o tamanho exato da repetição de CGG é de grande importância para classificação e predição do FXS e de desordens X-associadas frágeis25,26. Historicamente, a reação em cadeia da polimerase específica da região de repetição CGG (PCR) com dimensionamento de fragmento mais a análise do Southern blot tem sido o padrão-ouro para o perfil molecular da repetição de FMR1 CGG27. Entretanto, o PCR específico tradicional é menos sensível às grandes pré-mutações com mais de 100 a 130 repetições e é incapaz de amplificar mutações cheias27,28. Além disso, a electroforese capilar em um analisador genético tradicional para o dimensionamento da repetição não detecta produtos de FMR1 PCR com mais de 200 repetições de CGG. A análise do Sul do borrão permite a diferenciação de uma escala mais larga do tamanho da repetição, de normal aos números inteiros da repetição da mutação, e foi amplamente utilizada confirmando mutações cheias (nos machos) e diferenciando alelos heterozygous com uma mutação cheia de alelos aparentemente homozygous com tamanhos normais da repetição (nas fêmeas). No entanto, a resolução para quantificar as repetições é limitada. Mais importante, esta estratégia de teste passo a passo é trabalhosa, demorada, e custo-ineficaz.

Aqui, nós apresentamos um método exato e robusto da PCR-baseado para a quantificação das repetições de CGG de FMR1. A primeira etapa deste teste é amplificação do PCR das seqüências da repetição no 5 ' UTR do promotor FMR1 usando o jogo frágil do PCR de X. Os produtos do PCR são purified e o dimensionamento do fragmento é executado em um instrumento capilar microfluídicos da electroforese, e na interpretação subseqüente do número de repetições de CGG usando o software da análise referenciando padrões com repetições conhecidas baseadas no racional que o comprimento do fragmento do PCR é diretamente proporcional ao número de repetições de CGG. O sistema do PCR inclui os reagentes que facilitam a amplificação da região altamente GC-rica da repetição do trinucleotide. Este ensaio PCR-baseado é reprodutível e capaz de identificar todas as escalas de repetições de CGG de FMR1 promotores. Este é um método rentável que pode encontrar a aplicação larga no diagnóstico molecular e na seleção do FXS e de desordens X-relacionadas frágeis com menos tempo do turn-around e o investimento no equipamento e assim, pode ser utilizado em um espectro mais largo de clínico Laboratórios.

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Protocol

A aprovação ética foi concedida pela Universidade conjunta chinesa de Hong Kong ― Comitê de ética em pesquisa clínica do grupo de novos territórios do leste (número de referência: 2013, 55)

1. amplificação do PCR

  1. Antes de começar, remova a mistura do tampão do PCR, amostras do diluente e do ADN da amostra (teste e ADN da referência) (veja a tabela dos materiais) do congelador de-20 ° c e mantenha-os na temperatura ambiente por 20-30 minutos para certificar-se que todos os reagentes e ADN estão descongelados inteiramente. Vortex e brevemente girar para baixo antes de usar.
  2. Meça a concentração das amostras de DNA utilizando um espectrofotômetro (ver tabela de materiais). A concentração de DNA deve ser de 25 ng/μL; diluir com diluente da amostra para a concentração apropriada, se necessário.
    Nota: O DNA deve ser extraído e purificado para remover substâncias interferentes, como proteínas e altas concentrações de sal. O DNA não degradado e de alta qualidade deve ser utilizado para posterior amplificação e análise de PCR (A260/A280:1.8 – 2.0 e A260/A230: > 1,0).
  3. Rotule poços de uma placa de PCR ou 0,2 mL de tubos de PCR para identificar amostras de DNA de referência e testadas.
  4. Calcule o número de reações de PCR necessárias para as amostras de teste, 2 amostras de referência e amostra de controle negativo. Prepare a mistura do mestre do PCR adicionando 15 μL da mistura do amortecedor do PCR, 2,6 μL do diluente da amostra e 0,4 μL do polymerase para cada reação.
    Nota: Um controle negativo usando o diluente da amostra é essencial para monitorar o desempenho do PCR. Prepare a mistura mestre do PCR na temperatura ambiente, não pipeta no gelo. A mistura do tampão do PCR é viscosa. Misture o tubo e, em seguida, gire brevemente para baixo antes de usar.
  5. Vortex a mistura mestre do PCR da etapa 1,4 para 10 – 20 s e gire para baixo. Dispense lentamente 18 μL da mistura em cada poço ou tubo.
  6. Vortex e gire as amostras de DNA. Pipetar 2 μL de cada ADN para o poço ou tubo adequado para um volume final de PCR de 20 μL. misturar com pipetagem para cima e para baixo 5 vezes.
    Nota: A quantidade total de DNA por reação deve ser de 50 – 100 ng. As quantidades de DNA maiores que 150 ng por 20 μL de reação de PCR podem resultar em uma fraca amplificação de alelos de repetição grandes. Para DNAs mais baixas concentradas, a quantidade de diluente da amostra na mistura mestra do PCR pode ser substituída pela solução do ADN.
  7. Sele a placa com o aferidor da placa adesiva, ou com tampões de tubo.
  8. Coloc a placa ou os tubos selados do PCR no ciclador térmico com tampa aquecida. Execute o programa com as seguintes configurações: 95 ° c por 5 min, seguidos por 25 ciclos de desnaturação a 98 ° c para 35 s, recozimento a 59 ° c para 35 s e extensão a 72 ° c por 4 min; uma etapa final em 72 ° c por 10 minutos. prenda os produtos do PCR em 4 ° c no cycler até a remoção para um processamento mais adicional.
  9. Após a amplificação do PCR, purificar e analise os produtos imediatamente, ou armazene-o em + 2 a + 8 ° c durante a noite. Alternativamente, o produto pode ser armazenado por até 30 dias em-30 a-16 ° c.

2. purificação dos produtos do PCR

  1. Pré-aqueça o agitador da incubadora a 65 ° c.
  2. Para cada reação de PCR, adicione 80 μL de tampão de 1x TE (veja a tabela de materiais) aos 20 μL de cada produto da PCR da seção 1.
  3. Transfira a mistura de amostras para uma placa de limpeza de PCR (ver tabela de materiais) utilizando uma pipeta multicanal.
  4. Mantenha a placa descoberta e coloque-a no agitador da incubadora, e incubar a 65 ° c enquanto agitando a 1.200 rpm por 10 min.
  5. Após a incubação, definir o instrumento de vácuo em 250 mbar (ou 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 em Hg) e aspirar a solução através do filtro por 15 min. Wells não deve ter nenhum líquido restante.
  6. Resfrie o agitador da incubadora até 25 ° c.
  7. Após a primeira aspiração, desligue o aspirador e adicione 50 μL de tampão TE 1x a cada poço. Não misture. Aspirar a solução por 10 min usando as configurações de vácuo na etapa 2,5.
  8. Seque a parte inferior da placa de filtro pressionando-a firmemente em uma pilha de toalhas de papel.
  9. Adicione 20 μL do tampão de 1x TE no centro inferior de cada poço. Coloc a placa no abanador da incubadora e incubar em 25 ° c ao agitar em 1.200 rpm por 5 minutos.
  10. Após a incubação, transfira > 15 μL de cada ADN purificado do PCR da etapa 2,9 a uma placa fresca do PCR 96-well. O DNA purificado pode ser analisado diretamente, ou alternativamente pode ser armazenado em-30 a-16 ° c até que exigido.

3. fragmento de dimensionamento de produtos de PCR

  1. Antes de começar, permita o concentrado da tintura do ADN, a matriz do gel do ADN, o marcador do ADN, a escada do ADN e amostras purificadas do ADN da etapa 2 para equilibrar à temperatura ambiente por 30 minutos.
  2. Configurar a estação de escorva.
    1. Substitua a seringa (ver tabela de materiais) quando utilizar um novo lote de reagentes.
    2. Ajuste a placa de base e solte a alavanca do clipe da seringa e deslize-a até a posição superior.
  3. Inicie o software de dimensionamento (ver tabela de materiais) e prepare a mistura gel-Dye.
  4. Concentrado de corante Vortex para 10 s e girar para baixo. Adicione 25 μL do corante a um frasco para injetáveis de matriz de gel. Vortex a solução mista bem e girar para baixo.
    1. Transfira a mistura gel-Dye para um filtro de centrifugação. Coloque o filtro de centrifugação numa microcentrífuga e gire durante 10 min à temperatura ambiente a 1.500 x g ± 20%.
      Nota: Proteja a solução com corante da luz e armazene a 4 ° c após o uso. A mistura do gel-corante pode ser usada por aproximadamente 15 microplaquetas uma vez preparadas. Deixe a mistura de gel-corante equilibrar-se à temperatura ambiente durante 30 minutos de cada vez antes da utilização.
  5. Carregue a mistura gel-Dye.
    1. Insira um novo chip de DNA na estação de escorva. Adicionar 9 μL de mistura de gel-corante no poço marcado com "G". Certifique-se de que o êmbolo está posicionado na marca de 1 mL e, em seguida, feche a estação de escorva.
    2. Pressione o êmbolo da seringa para baixo até que seja mantido pelo clipe. Aguarde exatamente 30 s, em seguida, solte o clipe. Aguarde 5 s e, em seguida, puxe lentamente o êmbolo de volta para a posição de 1 mL.
    3. Abra a estação de escorva e adicione 9 μL de mistura de gel-corante nos poços marcados com "G".
  6. Adicione 5 μL de marcador no poço marcado com o símbolo da escada e adicione também 5 μL de marcador em cada um dos 12 poços amostrais. Não deixe nenhum poço vazio.
  7. Adicione 1 μL da escada do ADN no poço marcado com o símbolo da escada. Adicionar 1 μL de produto PCR (poços usados) da etapa 3,1 ou 1 μL de água ultrapura (poços não utilizados) em cada um dos 12 poços amostrais. Coloque o chip horizontalmente no adaptador de misturador Vortex e Vortex por 1 min no ajuste indicado (2.400 rpm).
  8. Insira a microplaqueta no instrumento do Bioanalyzer e funcione a microplaqueta no instrumento dentro de 5 minutos.
  9. Após a conclusão do ensaio, retire imediatamente o chip utilizado do aparelho.
  10. Adicione lentamente 350 μL de água desionizada em um dos poços do limpador de eletrodos. Abra a tampa do bioanalisador e coloque o limpador do eletrodo nele. Fechar a tampa e incubar por cerca de 10 s. Abra a tampa e retire o limpador do eléctrodo. Aguarde mais 10 s para permitir que a água nos eléctrodos evate e, em seguida, feche a tampa.

4. Analise os resultados de dimensionamento de fragmento

Nota: As amostras de referência devem ser amplificadas e analisadas pelo mesmo termociclador e bioanalisador no mesmo lote com as amostras desconhecidas.

  1. Após a execução do Bioanalyzer ser concluída, exporte os dados de pico de cada execução como um arquivo de tabela. csv para análise subsequente.
  2. Inicie o software de análise e abra o arquivo de tabela de pico. csv exportado da etapa 4,1.
  3. Através da aba do menu do QC , reveja a linha de regressão ajustada aos quatro pontos (mostrados como diamantes azuis na parcela) das duas amostras da referência. O valor de R2 da linha de regressão deve ser > 0,98 (os valores típicos excedem 0,999).
  4. Através da guia menu de resultados , verifique o tamanho da repetição de cada amostra cujo comprimento (s) de fragmento é automaticamente plotado contra a curva padrão de regressão linear derivada das amostras de referência. O software também fornece a classificação de cada amostra de acordo com diferentes diretrizes.
  5. Através da aba do menu da exportação , exporte o relatório do resultado para cada amostra com os números da repetição e a classificação diagnóstica, assim como um Sumário da informação da amostra e do relatório do QC para cada execução.
    Nota: O software de análise permite o uso de diretrizes de classificação personalizadas, como as diretrizes da American College of Medical Genetics (ACMG) ou da sociedade de genética molecular/sociedade européia de genética humana (CMGS/ESHG), bem como a classificação predefinida Critérios.

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Representative Results

Os resultados de dimensionamento da amostra de referência feminina de pré-mutação (NA20240, tamanhos de repetição de 30 e 80) e a amostra de referência feminina de mutação completa (NA20239, tamanhos de repetição de 20 e 200) são mostrados na Figura 1a e na Figura 1b, respectivamente. Normalmente, dois picos de marcador (menor marcador 50 pares de base [BP] e marcador superior 10.380 BP) são incluídos no perfil de tamanho do fragmento. Há geralmente um pico complexo primer com um tamanho de quase 95 BP. Através da amostra de referência, pode-se construir uma curva padrão de regressão linear com quatro pontos, conforme exposto na Figura 1C.

As características representativas do tamanho de amostras clínicas normais, intermediárias, de pré-mutação e de mutação completa são mostradas na Figura 2A – D. Particularmente, as mutações cheias do mosaico com dois picos expandidos do fragmento e um pico normal são apresentados na Figura 2e. Em alguns casos femininos, apenas um pico é exibido nos resultados da eletroforese microfluídico, como mostrado na Figura 2F. Isto pode ser explicado pela apresentação de alelos homozygous normais (com os mesmos números da repetição de CGG nos dois alelos) nestes casos ou a inabilidade de diferenciar alelos heterozygous que têm diferenças do número da repetição de quatro ou menos29. No entanto, esses resultados de pico único podem ser classificados como normais, pois foi validado que o pipeline baseado em PCR possibilita a amplificação e a detecção robustas de alelos de mutação ou pré-mutação, o que minimiza a possibilidade de falso-negativo em Esta situação. Um tipo de situação subótima é o viés de linha de base, como mostrado na Figura 2G, que pode produzir resultados ambíguos ou não interpretáveis em alguns casos. Suspeita-se que tal condição seja causada por uma questão de instrumento. Os tamanhos de fragmentos medidos de amostras desconhecidas são plotados contra a curva padrão de regressão linear derivada das amostras de referência para calcular automaticamente os tamanhos de repetição usando o software de análise, conforme exibido na Figura 2h. Os tamanhos de fragmento inferiores a 200 repetições são interpolados na curva padrão de regressão linear, enquanto os tamanhos maiores de alelo de mutação completa são medidos por extrapolação ao longo da mesma linha padrão. O software também exibe a classificação de cada amostra de acordo com diferentes diretrizes.

Figure 1
Figura 1: os resultados de dimensionamento das amostras de referência feminina e a curva de regressão linear correspondente. (A, B) mostram as características do tamanho da amostra fêmea da referência da pré-mutação (NA20240, tamanhos da repetição de 30 e 80) e a amostra fêmea da referência da mutação completa (NA20239, tamanhos da repetição de 20 e de 200), respectivamente. Dois marcadores (marcador inferior, 50 BP e marcador superior 10380 BP) estão incluídos no resultado da eletroforese para cada amostra. O pico com um tamanho de quase 95 BP indica um complexo primário. As setas pretas indicam o tamanho máximo do complexo primário e as setas azuis representam o comprimento do fragmento da amostra de referência. (C) a curva padrão de regressão linear com quatro pontos (diamantes azuis) das duas amostras de referência é construída no software de análise. Os eixos horizontais e verticais mostram os números de repetição CGG calculados e o comprimento do fragmento medido na eletroforese microfluíica. O valor de R2 da regressão foi 0,99967. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: os resultados representativos de amostras clínicas com tamanho diferente da repetição de CGG. (A – e) mostram as características representativas do tamanho por bioanalisador na ordem do normal (com comprimentos de fragmento de 328 bp e 353 BP, correspondendo aos números de repetição de 28 e 36), intermediário (com comprimentos de fragmento de 335 bp e 390 BP, correspondendo ao números de repetição de 30 e 49), pré-mutação (com comprimentos de fragmento de 332 BP e 439 BP, correspondendo aos números de repetição de 29 e 65), mutação completa (com comprimentos de fragmento de 337 BP e 1911bp, correspondendo aos números de repetição de 31 e 545) e mosaico completo mutações (com comprimentos de fragmento de 349 BP, 1201 BP e 2688 BP, correspondendo aos números de repetição de 33, 294 e 751) amostras. (F) apresenta um resultado de eletroforese microfluídico de pico único (com comprimento de fragmento de 334 BP, correspondendo ao número de repetição de 30) de uma fêmea que provavelmente tem alelos homozygous (com os mesmos números de repetição de CGG nos dois alelos) ou alelos heterozygous (com as diferenças do número da repetição de CGG de quatro ou de menos). (G) mostra um tipo de situação sub-optimal que é viés de linha de base. As setas pretas indicam o tamanho máximo do complexo primário, e as setas vermelhas representam o comprimento do fragmento da amostra. (H) exibe a interface principal do resultado do software de análise. Os tamanhos de fragmentos medidos de amostras desconhecidas são plotados contra a curva padrão de regressão linear para calcular automaticamente os tamanhos de repetição. O alelo normal da amostra feminina de mutação completa do mosaico mostrado em (E) é mapeado para a curva padrão no canto inferior esquerdo da região do eixo de coordenadas (plotada em verde), e os alelos de mutação total maiores (plotados em vermelho) extrapolados para além do quatro pontos padrão (diamantes azuis na curva). As seções tabulares na metade inferior da figura apresentam os tamanhos dos fragmentos e a classificação diagnóstica correspondente de acordo com os limites de diretriz de ACMG escolhidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O FXS é a segunda causa mais comum de comprometimento intelectual após a trisminha 21, representando quase metade do retardo mental ligado ao X30, que pode afetar aproximadamente 1 em 4.000 machos e 1 em 8.000 fêmeas. Mais importante, quase 1 em 250 – 1000 fêmeas carregam uma pré-mutação, e esta freqüência é 1 em 250 – 1600 nos machos26,31,32,33. Desde que o risco de expansão da repetição de CGG às mutações cheias ao transmitir alelos da pré-mutação aos descendentes eleva dramàtica, por exemplo, de 4% quando o tamanho da repetição materna é 55 – 59 a 98% quando o tamanho é 100 – 20014, a determinação do CGG o tamanho da repetição em uma escala mais larga poderia facilitar o diagnóstico de FXS e a seleção de portadores da pré-mutação para seu planeamento reprodutivo. O método PCR-baseado introduzido aqui é exato, rápido e robusto para amplificar as seqüências da repetição no 5 ' UTR do promotor FMR1 e quantificar o espectro cheio de números da repetição de CGG em um instrumento capilar microfluídicos da electroforese, e assim pode Aumente sua aplicação larga no diagnóstico molecular e na seleção de desordens de FXS e de X-relacionadas frágeis com menos tempo do turn-around e investimento no equipamento. O instrumento do Bioanalyzer pode confiàvel ser utilizado em baixas às configurações moderadas do teste da taxa de transferência para a medida do tamanho da repetição. O equipamento é muito menor, menos dispendioso e mais simples de manter do que outros instrumentos de eletroforese capilar, como analisadores genéticos capilares ABI. Para a triagem de alto volume, o sistema MultiDX que contém até 384 modelo de amostra fornece uma ampla flexibilidade e throughput para os testes.

O ensaio inclui quatro etapas principais: a amplificação do PCR das seqüências da repetição no 5 ' UTR do promotor FMR1 (o PCR ajustou-acima e a amplificação do PCR toma quase 3,5 h), purificação dos produtos do PCR (toma quase 1 h), dimensionamento do fragmento em um microfluídicos instrumento capilar da electroforese (toma quase 1 h), e a interpretação do número de repetições de CGG usando o software da análise inferir dos padrões de referência com repetições conhecidas (toma quase 0,5 h). No total, o tempo de turn-around deste ensaio é aproximadamente 6 h. Para um ótimo desempenho, as amostras de DNA devem ser purificadas para remover substâncias interferentes putativas, como proteínas e altas concentrações de sal. Adicionalmente, a quantidade recomendada de DNA de entrada é de 50 – 100 ng por 20 μL de reação de PCR. As quantidades do ADN maiores de 150 ng por 20 μL do sistema do PCR foram mostradas para conduzir à amplificação deficiente de grandes alelos da repetição. Além disso, recomenda-se fortemente configurar pelo menos duas amostras de referência com tamanhos bem caracterizados da repetição em cada PCR funcionado para a análise simultânea de números da repetição como o controle de qualidade e o dimensionamento automatizado subseqüente do fragmento no software da análise 29. normalmente, o valor de R2 da curva de regressão linear derivada das amostras de referência deve ser superior a 0,98. Além, os produtos do PCR devem ser purificados antes da electroforese capilar microfluídicos para melhorar a eficiência da deteção. Porque o primer do PCR é etiquetado com fluorescência29de FAM, o dimensionamento do fragmento com um sistema apropriado da electroforese (por exemplo, Bioanalyzer e o sistema de multidx) pode diretamente ser executado sem rotulagem adicional.

Uma variedade de metodologias para o diagnóstico e o estudo de FXS e de desordens relacionadas foi revisada detalhada por Bruce E. Hayward e outros, incluindo testes ADN-baseados e os ensaios da proteína de FMRP34. Como na maioria dos casos a base molecular de FXS é mutação dinâmica caracterizada por uma repetição de CGG da expansão na região do promotor do gene FMRP1 , a mancha do Sul e os ensaios amplificação-baseados usando o ADN genomic são os ensaios os mais geralmente usados para determinação do número de repetição. É sabido que os ensaios PCR-baseados sobrepõem o Sul que blotting na custo-eficácia e na exigência mínima da quantidade do ADN. Entretanto, a amplificação do CGG-REPEAT é um desafio principal desde que o índice elevado do GC pode afetar a eficiência, e muito esforço foi feito para a optimização do sistema do PCR sobre os anos34. O jogo frágil do PCR de X foi aperfeiçoado para a amplificação exata das repetições inteiras do trinucleotide de CGG, e um estudo da validação no desempenho deste método PCR-baseado tem sido relatado previamente por nosso grupo29. Um método similar PCR-baseado foi relatado por Mailick Seltzer e outros em 201235, mas o instrumento de Abi 3730xl foi usado para a determinação do tamanho da repetição e somente os indivíduos com tamanho da repetição menos do que 200 foram identificados. Isto pode ser devido ao fato de que sua plataforma escolhida foi incapaz de detectar as repetições maiores com tamanho da repetição acima de 200. Ao contrário, o instrumento do Bioanalyzer que nós nos usamos oferece um ensaio mais robusto do dimensionamento do fragmento, porque pode exatamente e cost-eficazmente detectar o espectro cheio da repetição de FMR1 CGG que inclui mutações cheias29.

Exceto o número da repetição, diversos outros fatores igualmente precisam de ser verificados para o diagnóstico apropriado de desordens de FXS e de FXS, incluindo a mutação FMR1, a extensão do metilação e o mosaicism34. O status do metilação pode ser monitorado por vários métodos tais como a incorporação de etapas da pre-digestão usando a enzima metilação-Sensitive da limitação ou o ensaio da modificação do bissulfito34, entretanto, nosso ensaio é incapaz de determinar o Estado de metilação do 5 ' UTR do promotor FMR1 . Adicionalmente, o risco de expansão de um alelo FMR1 também depende da presença de interrupções de AGG, o que pode estabilizar o gene durante a transmissão. Os ensaios da repetição PCR-baseados foram modificados para detectar AGG-interrupções visto que a instabilidade da enzima da digestão é uma das limitações principais. O PCR de Triplet-aprontado (TP) usando uma ligação híbrida do primer do PCR em repetições de CGG ou em interrupções de AGG é um outro tipo de ensaio do PCR que pode detectar o tamanho da repetição de CGG e as interrupções de AGG simultaneamente. Entretanto, o método gene-específico FMR1 do PCR nós descrevemos é incapaz de identificar as interrupções de AGG a menos que o sequenciamento do gene FMR1 depois que a amplificação é executada. Recentemente, Hayward et al. relataram os métodos de PCR utilizados em seu próprio laboratório para determinação de todos os parâmetros necessários para um trabalho genético completo ou estudo laboratorial minucioso, incluindo ensaios que podem detectar número de repetição, status de interrupção de AGG e Estado de metilação36. Infelizmente, nenhum ensaio é capaz de determinar exaustivamente todos esses fatores até à data.

Vale ressaltar que o ensaio não é capaz de detectar exclusões ou variantes de nucleotídeo único dentro do gene FMR1 , que responde por aproximadamente 1% dos casos de FXS27. Raramente, nos indivíduos que têm o mosaicism celular para a repetição FMR1 , o PCR pode dar um resultado negativo falso por causa da falha em detectar o mosaicism para o alelos maior da pré-mutação e da cheio-mutação37,38. Demonstrou-se que o limiar deste ensaio PCR-baseado para a amostra masculina da mutação cheia do mosaico (341 repetições) é 2,5% quando o limiar máximo do detetor é ajustado em três unidades da fluorescência acima da linha de base29. A análise do Sul do Borrão é recomendada nos casos se os alelos do mosaico são indicados. Além disso, em relação às plataformas de eletroforese, o estudo prévio indicou que, em comparação com os sistemas de eletroforese capilar (por exemplo, instrumento ABI 3130XL), o instrumento bioanalisador é incapaz de diferenciar o normal homozygous amostras fêmeas com os picos individuais do fragmento das amostras fêmeas com tamanhos heterozygous da repetição que têm diferenças do número da repetição de quatro ou menos29. No entanto, essas amostras de pico único podem ser classificadas como normais, pois foi validada que este pipeline baseado em PCR possibilita a amplificação robusta e a detecção de alelos de mutação total ou pré-mutação, o que minimiza a possibilidade de falso-negativo em Esta situação. Independentemente das limitações acima, o método pode ser utilizado como um pipeline de primeira linha para a identificação molecular de FXS e doenças X-associadas frágeis com custo-efetividade, robustez e tempo de relato rápido, complementados por sequenciamento do FMR1 gene e Southern blot análise de níveis de metilação.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do projeto de gerenciamento de emergência da NSFC (Grant no. 81741004), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 81860272), o principal plano de pesquisa da Fundação provincial de ciência e tecnologia de Guangxi ( Grant no. AB16380219), o Grant da Fundação da ciência de pós-doutorado de China (Grant no. 2018M630993), e a Fundação da ciência natural de Guangxi (Grant no. 2018GXNSFAA281067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

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Genética edição 151 reação em cadeia da polimerase eletroforese capilar microfluídica repetições de citosina-guanina-guanina trinucleotídeo retardo mental X frágil-1 promotor síndrome de X frágil mutação completa pré-mutação
Um ensaio robusto baseado em reação em cadeia da polimerase para quantificar repetições de trinucleotídeo de citosina-guanina-guanina em X frágil retardo mental-1 gene
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Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung,… More

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).

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