Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

اختبار قوي من تفاعل البوليميراز القائم على سلسلة لقياس السيتوسين-غوانين-غوانين ترينوكلوتيد يكرر في التهشاشة X التخلف العقلي-1 الجينات

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59963
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 2, 2,3, 2,3, 2, 5, 5, 6,7, 2,3
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

اختبار دقيق وقوي قائم على سلسلة من ردود الفعل البوليمرية لتحديد كمية السيتوسين-غوانين-غوانين الترينوكلوتيد يكرر في الجين الهش X التخلف العقلي-1 يسهل التشخيص الجزيئي وفحص متلازمة X الهشة والهشة X ذات الصلة اضطرابات مع أقصر بدوره حول الوقت والاستثمار في المعدات.

Abstract

متلازمة X الهشة (FXS) والاضطرابات المرتبطة بها بسبب التوسع في السيتوسين-غوانين-غوانين (CGG) ترينوكلوتيد تكرار في منطقة 5 'غير مترجمة (UTR) من الهشاشة X التخلف العقلي-1(FMR1)الجينات المروج. تقليديا، يتم استخدام تحليل جزء الكهربائي الشعرية على محلل وراثي لتغيير الحجم من CGG يكرر FMR1، ولكن مطلوب تحليل لطخة الجنوبية إضافية للقياس الدقيق عندما يكون الرقم المتكرر أعلى من 200. هنا، نقدم دقيقة وقوية تفاعل البوليميراز سلسلة (PCR) -- طريقة تستند إلى القياس الكمي من CGG يكرر FMR1. الخطوة الأولى من هذا الاختبار هي تضخيم PCR من تكرار التسلسلات في 5'UTR من المروج FMR1 باستخدام مجموعة PCR X الهشة، تليها تنقية منتجات PCR وتجزئة التحجيم على جهاز الكهربائي الشعيرات الشعرية microfluidic، و تفسير لاحق لعدد CGG يكرر عن طريق الرجوع إلى المعايير مع تكرار المعروفة باستخدام برنامج التحليل. هذا الاختبار المستند إلى PCR قابل للتكرار وقادر على تحديد مجموعة كاملة من CGG يكرر من المروجين FMR1، بما في ذلك تلك التي مع عدد متكرر من أكثر من 200 (تصنف على أنها طفرة كاملة)، 55 إلى 200 (التحوير)، 46 إلى 54 (وسيط)، و 10 إلى 45 (عادي). وهي طريقة فعالة من حيث التكلفة تسهل تصنيف FXS والاضطرابات الهشة المرتبطة بـ X مع المتانة ووقت الإبلاغ السريع.

Introduction

متلازمة X الهشة (FXS) والاضطرابات الهشة X المرتبطة بها، على سبيل المثال، الهزة ومتلازمة ترنح (FX-TAS)، وقصور المبيض الأولي (FX-POI) هي أساسا بسبب السيتوسين-غوانين-غوانين (CGG) ترينوكلوتيد تكرار التوسع في 5 'غير مترجمة المنطقة (UTR) من التخلف العقلي X الهشة-1(FMR1)الجينات على Xq27.31،2. البروتين المشفر FMR1 (FMRP) هو بروتين ملزم بالحمض النووي الريبي المرتبط بالبوليريبوسوم يعمل في تطوير الخلايا العصبية واللدونة متشابك من خلال تنظيم الربط البديل، والاستقرار، والنقل الددري من mRNA أو التوليف تحوير من البروتينات المشاركات الجزئية3،4،5،6،7.

ويوصف التباين الديناميكي مع حجم تكرار CGG من >200 بأنها طفرة كاملة، مما يحفز فرط الميثيل الشاذ وإسكات النسخ اللاحقة للمروّج FMR1 8. يؤدي غياب أو نقص بروتين FMRP إلى تعطيل تطور الخلايا العصبية الطبيعية ويسبب FXS9، الذي يتميز بأعراض سريرية مختلفة، بما في ذلك الإعاقة الذهنية المعتدلة إلى الشديدة، وتأخر النمو، والسلوكيات المفرطة النشاط، ضعف الاتصالات ومظاهر التوحد10،11،12. العرض في المرضى FXS الإناث عموما أكثر اعتدالا من ذلك في الذكور. ويصنف حجم تكرار CGG الذي يتراوح بين 55 و200 و45 إلى 54 على أنه حالة ما قبل التحويل والمستوى المتوسط، على التوالي. بسبب درجة عالية من عدم الاستقرار، وCGG تكرار حجم في premutation أو الأليل المتوسطة يفترض أن يوسع عندما تنتقل من الآباء والأمهات إلى ذرية13،14. وهكذا، فإن الناقلين مع الأليلات ما قبل النضة في خطر كبير من وجود الأطفال المتضررين من FXS بسبب التوسع المتكرر، وفي بعض الحالات، يمكن أن توسع الأليلات المتوسطة حجمها المتكرر إلى مجموعة الطفرة الكاملة على مدى جيلين15، 16. وعلاوة على ذلك، فإن الذكور مع preprepre ينقل أيضا زيادة خطر تطوير في وقت متأخر من ظهور FX-TAS17،18،19، في حين أن الإناث قبل التحول هي مستعدة لكل من FX-TAS وFX-POI20، 21،22. في الآونة الأخيرة، أفيد أن اضطرابات طيف التوحد مع تأخر النمو ومشاكل في السلوكيات الاجتماعية يتم عرضها في الأطفال مع النفير FMR1 alleles23،24.

لتحديد بالضبط CGG تكرار حجم له أهمية كبيرة لتصنيف والتنبؤ من FXS والاضطرابات الهشة المرتبطة X25،26. تاريخيا، كان CGG تكرار المنطقة محددة تفاعل البوليميراز سلسلة (PCR) مع تجزئة جزء بالإضافة إلى تحليل وصمة عار الجنوبية المعيار الذهبي للتنميط الجزيئي للFMR1 CGG تكرار27. ومع ذلك، PCR محددة التقليدية هي أقل حساسية للطفرات الكبيرة مع أكثر من 100 إلى 130 يكرر وغير قادر على تضخيم الطفرات الكاملة27،28. وعلاوة على ذلك، يفشل الكتروفوريس الشعري على محلل وراثي تقليدي لتكرار التحجيم في الكشف عن منتجات PcR FMR1 مع أكثر من 200 CGG يكرر. يتيح تحليل اللطخة الجنوبية التمييز بين مجموعة أوسع من الحجم المتكرر، من الأرقام العادية إلى أرقام تكرار الطفرة الكاملة، وقد تم استخدامه على نطاق واسع لتأكيد الطفرات الكاملة (في الذكور) وتمييز الأليلات المتجانسة مع طفرة كاملة من على ما يبدو المتجانسة الأليلات مع أحجام تكرار العادية (في الإناث). ومع ذلك، فإن قرار التحديد الكمي للتكرار محدود. والأهم من ذلك، أن استراتيجية الاختبار هذه خطوة بخطوة هي استراتيجية كثيفة العمالة وتستغرق وقتاً طويلاً وغير فعالة من حيث التكلفة.

هنا، نقدم طريقة دقيقة وقوية تستند إلى PCR لتحديد كمي من CGG يكرر FMR1. الخطوة الأولى من هذا الاختبار هي تضخيم PCR من تسلسل تكرار في 5'UTR من المروج FMR1 باستخدام مجموعة PCR X الهشة. يتم تنقية منتجات PCR ويتم تنفيذ تغيير حجم الشظايا على أداة الكهربائي الشعرية الدقيقة، والتفسير اللاحق لعدد CGG يكرر باستخدام برنامج التحليل عن طريق الرجوع إلى المعايير مع تكرار المعروفة على أساس الأساس المنطقي أن طول جزء PCR يتناسب مباشرة مع عدد CGG يكرر. ويشمل نظام PCR الكواشف التي تسهل تضخيم منطقة تكرار trinucleotide الغنية جدا GC. هذا الاختبار المستند إلى PCR قابل للاستنساخ وقادر على تحديد جميع نطاقات CGG يكرر المروجين FMR1. هذا هو طريقة فعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن تجد تطبيق واسع النطاق في التشخيص الجزيئي وفحص FXS والاضطرابات الهشة ذات الصلة X مع أقل بدوره حول الوقت والاستثمار في المعدات، وبالتالي، يمكن استخدامها في مجموعة أوسع من السريرية المختبرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم منح الموافقة الأخلاقية من قبل الجامعة الصينية المشتركة في هونغ كونغ-الأقاليم الجديدة الشرقية مجموعة البحوث السريرية لجنة (الرقم المرجعي: 2013.055)

1. تضخيم PCR

  1. قبل البدء، قم بإزالة مزيج المخزن المؤقت PCR، وعينات مخففة والحمض النووي (كل من الاختبار والحمض النووي المرجعي) (انظر جدول المواد)من الفريزر -20 درجة مئوية وإبقائها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة للتأكد من ذوبان جميع الكواشف والحمض النووي بشكل كامل. دوامة وتدور لفترة وجيزة إلى أسفل قبل الاستخدام.
  2. قياس تركيز عينات الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد). وينبغي أن يكون تركيز الحمض النووي 25 نانوغرام/ميكرولتر؛ تخفيف مع تخفيف عينة إلى التركيز المناسب إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: وينبغي استخراج الحمض النووي وتنقيته لإزالة المواد المسببة للتداخل، مثل البروتينات وتركيزات الملح العالية. وينبغي استخدام الحمض النووي غير المتدهور وعالي الجودة في تضخيم وتحليل الـ PCR اللاحق (A260/A280: 1.8-2.0 وA260/A230: >1.0).
  3. تسمية الآبار من لوحة PCR أو أنابيب PCR 0.2 مل لتحديد عينات الحمض النووي المرجعية والمختبرة.
  4. حساب عدد تفاعلات PCR المطلوبة لعينات الاختبار، وعينتين مرجعيتين وعينة تحكم سالبة. إعداد PCR ماجستير ميكس عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من مزيج المخزن المؤقت PCR، 2.6 ميكرولتر من عينة مخفف و 0.4 ميكرولتر من البوليمرات لكل رد فعل.
    ملاحظة: عنصر تحكم سالب باستخدام نموذج مخفف ضروري لمراقبة أداء PCR. إعداد المزيج الرئيسي PCR في درجة حرارة الغرفة، لا ماصة على الجليد. مزيج المخزن المؤقت PCR لزج. خلط الأنبوب ثم تدور لفترة وجيزة إلى أسفل قبل الاستخدام.
  5. قم بتدوير المزيج الرئيسي PCR من الخطوة 1.4 لـ 10-20 s والدوران لأسفل. الاستغناء ببطء 18 درجة مئوية من الخليط في كل بئر أو أنبوب.
  6. دوامة وتدور أسفل عينات الحمض النووي. ماصة 2 μL من كل DNA في البئر المناسب أو أنبوب لحجم PCR النهائي من 20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب أن يكون المبلغ الإجمالي للحمض النووي لكل رد فعل 50-100 نانوغرام. كميات الحمض النووي أكبر من 150 نانوغرام لكل 20 ميكرولتر تفاعل PCR قد يؤدي إلى تضخيم الفقراء من الأليلات تكرار كبيرة. بالنسبة للحمض الأدنى المركز، يمكن استبدال كمية مخفف العينة في المزيج الرئيسي PCR بمحلول الحمض النووي.
  7. ختم لوحة مع لوحة لاصقة السدادة، أو مع قبعات أنبوب.
  8. ضع لوحة PCR المختومة أو الأنابيب في الدراجات الحرارية مع غطاء ساخن. تشغيل البرنامج مع الإعدادات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها 25 دورات من denaturing في 98 درجة مئوية لمدة 35 s، الصلب في 59 درجة مئوية لمدة 35 s، وتمديد في 72 درجة مئوية لمدة 4 دقائق؛ خطوة أخيرة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  9. بعد تضخيم PCR، تنقية وتحليل المنتجات على الفور، أو تخزين في +2 إلى +8 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بدلا من ذلك، يمكن تخزين المنتج لمدة تصل إلى 30 يوما في -30 إلى -16 درجة مئوية.

2. تنقية منتجات PCR

  1. سخني الحاضنة شاكر إلى 65 درجة مئوية.
  2. بالنسبة لكل تفاعل PCR، أضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE 1x (انظر جدول المواد)إلى 20 ميكرولتر لكل منتج من منتجات PCR من القسم 1.
  3. نقل خليط العينة إلى لوحة تنظيف PCR (انظر جدول المواد)باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  4. الحفاظ على لوحة كشف ووضعها في شاكر حاضنة، وحضانة في 65 درجة مئوية في حين يهز في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
  5. بعد الحضانة، تعيين أداة فراغ في 250 مبار (أو 25 كيلوباسكال، 188 ملم زئبق، 7.4 في زئبق) وأسق الحل من خلال مرشح لمدة 15 دقيقة.
  6. تبريد الحاضنة شاكر وصولا الى 25 درجة مئوية.
  7. بعد الطموح الأول، إيقاف تشغيل الفراغ وإضافة 50 درجة مئوية من 1X TE العازلة إلى كل بئر. لا تخلط. قم بتسريع الحل لمدة 10 دقائق باستخدام إعدادات الفراغ في الخطوة 2.5.
  8. تجفيف الجزء السفلي من لوحة فلتر عن طريق الضغط عليه بحزم على كومة من المناشف الورقية.
  9. إضافة 20 درجة مئوية من 1X TE العازلة في المركز السفلي لكل بئر. ضع اللوحة في الحاضنة شاكر وحضانة في 25 درجة مئوية في حين يهز في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  10. بعد الحضانة، نقل > 15 درجة مئوية من كل الحمض النووي PCR تنقية من الخطوة 2.9 إلى لوحة PCR 96 جيدا جديدة. يمكن تحليل الحمض النووي النقي مباشرة، أو بدلا من ذلك يمكن تخزينها في -30 إلى -16 درجة مئوية حتى المطلوبة.

3. تجزئة جزء من منتجات PCR

  1. قبل البدء، السماح تركيز صبغ الحمض النووي، مصفوفة هلام الحمض النووي، علامة الحمض النووي، سلم الحمض النووي وعينات الحمض النووي النقي من الخطوة 2 إلى التوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. قم بإعداد محطة الفتيلة.
    1. استبدال الحقنة (انظر جدول المواد)عند استخدام دفعة جديدة من الكواشف.
    2. ضبط لوحة قاعدة، والإفراج عن رافعة مقطع حقنة والانزلاق حتى الموضع العلوي.
  3. بدء تشغيل برنامج التحجيم (انظر جدول المواد)وإعداد مزيج هلام صبغ.
  4. دوامة صبغ التركيز لمدة 10 s وتدور إلى أسفل. إضافة 25 درجة مئوية من الصبغة إلى قارورة مصفوفة هلام. دوامة الحل مختلطة بشكل جيد وتدور إلى أسفل.
    1. نقل مزيج هلام صبغ إلى مرشح تدور. وضع مرشح تدور في جهاز طرد مركزي صغير وتدور لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 1500 × ز ± 20٪.
      ملاحظة: حماية الحل مع صبغ من الضوء وتخزينها في 4 درجة مئوية بعد الاستخدام. ويمكن استخدام مزيج هلام صبغ لحوالي 15 رقائق مرة واحدة أعدت. السماح لمزيج هلام صبغ لequilibrate إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في كل مرة قبل الاستخدام.
  5. تحميل مزيج هلام صبغ.
    1. أدخل رقاقة الحمض النووي الجديدة على محطة فتيلة. إضافة 9 ميكرولتر من هلام صبغ مزيج في علامة جيدا مع "G". يرجى التأكد من وضع الغطاس عند علامة 1 مل ثم قم بإغلاق محطة فتيلة.
    2. اضغط على الغطاس حقنة أسفل حتى يتم الاحتفاظ بها من قبل مقطع. انتظر بالضبط 30 s ثم الافراج عن مقطع. انتظر 5 s، ومن ثم سحب ببطء الغطاس مرة أخرى إلى موقف 1 مل.
    3. فتح محطة فتيلة وإضافة 9 ميكرولتر من هلام صبغ مزيج في الآبار ملحوظ مع "G".
  6. إضافة 5 ميكرولتر من علامة في علامة ملحوظ جيدا مع رمز سلم وأيضا إضافة 5 ميكرولتر من علامة في كل من الآبار عينة 12. لا تترك أي آبار فارغة.
  7. إضافة 1 ميكرولتر من سلم الحمض النووي في علامة جيدا مع رمز سلم. إضافة 1 ميكرولتر من منتج PCR (الآبار المستخدمة) من الخطوة 3.1 أو 1 ميكرولتر من المياه النقية جداً (الآبار غير المستخدمة) في كل من الآبار عينة 12. وضع رقاقة أفقيا في محول دوامة خلاط ودوامة لمدة 1 دقيقة في الإعداد المشار إليه (2400 دورة في الدقيقة).
  8. إدراج رقاقة في أداة محلل حيوي وتشغيل رقاقة في الصك في غضون 5 دقائق.
  9. بعد اكتمال عملية الاكتمال، قم بإزالة الشريحة المستخدمة على الفور من الأداة.
  10. إضافة ببطء 350 درجة مئوية من الماء منزوع الأيونات في واحدة من الآبار من منظف القطب الكهربائي. فتح غطاء المحلل الحيوي ووضع منظف القطب في ذلك. أغلق الغطاء واحتضن حوالي 10 s. افتح الغطاء وإزالة منظف القطب الكهربائي. انتظر 10 ق أخرى للسماح للمياه على الأقطاب الكهربائية لتبخر ومن ثم إغلاق الغطاء.

4. تحليل نتائج تغيير حجم الأجزاء

ملاحظة: وينبغي تضخيم العينات المرجعية وتحليلها بواسطة نفس الدورات الحرارية والمحلل الحيوي في نفس الدفعة مع العينات غير المعروفة.

  1. بعد اكتمال تشغيل محلل حيوي تصدير بيانات الذروة من كل تشغيل كملف جدول .csv للتحليل اللاحق.
  2. بدء تشغيل برنامج التحليل وفتح ملف جدول الذروة .csv المصدرة من الخطوة 4.1.
  3. من خلال علامة التبويب قائمة مراقبة الجودة، راجع خط الانحدار المجهز بالنقاط الأربع (كما هو موضح كألماس أزرق على قطعة الأرض) من العينات المرجعية اثنين. يجب أن تكون قيمة R2 لبند الانحدار >0.98 (القيم النموذجية تتجاوز 0.999).
  4. من خلال علامة التبويب القائمة نتائج، تحقق من حجم التكرار لكل عينة يتم رسم طول (طول) جزءها تلقائيًا مقابل منحنى الانحدار الخطي القياسي المشتق من العينات المرجعية. كما يوفر البرنامج تصنيف كل عينة وفقا لإرشادات مختلفة.
  5. من خلال علامة التبويب تصدير القائمة تصدير تقرير النتائج لكل عينة مع تكرار الأرقام والتصنيف التشخيصي، بالإضافة إلى ملخص معلومات العينة وتقرير مراقبة الجودة لكل تشغيل.
    ملاحظة: يسمح برنامج التحليل باستخدام إرشادات التصنيف المخصصة، مثل المبادئ التوجيهية للكلية الأمريكية لعلم الوراثة الطبية (ACMG) أو الجمعية السريرية لعلم الوراثة الجزيئية/الجمعية الأوروبية لعلم الوراثة البشرية (CMGS/ESHG)، بالإضافة إلى التصنيف المحدد مسبقًا معايير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وترد في الشكل1ألف والشكل 1باءعلى التوالي نتائج تغيير حجم العينة المرجعية الأنثوية قبل التحوّل (NA20240، والأحجام المتكررة من 30 و80) والعينة المرجعية الأنثوية الكاملة للطفرة (NA20239، والأحجام المتكررة من 20 و200). بشكل عام، يتم تضمين قمتين علامة (علامة أقل 50 أزواج قاعدة [bp] وعلامة أعلى 10,380 bp) في ملف تعريف حجم الجزء. عادة ما يكون هناك ذروة معقدة التمهيدي مع حجم ما يقرب من 95 نقطة أساس. من خلال العينة المرجعية، يمكن إنشاء منحنى قياسي انحدار خطي مع أربع نقاط، كما هو معروض في الشكل 1C.

تظهر في الشكل 2A-Dالسمات التمثيلية للعينات السريرية العادية والمتوسطة ومرحلة ما قبل النفير والطفرة الكاملة. وعلى وجه الخصوص، يتم عرض الطفرات الكاملة للفسيفساء مع قمتين من الشظايا الموسعة وقمة عادية واحدة في الشكل 2E. في بعض الحالات الأنثوية، يتم عرض ذروة واحدة فقط في نتائج الكهربائي microfluidic، كما هو موضح في الشكل 2F. ويمكن تفسير ذلك من خلال تقديم الأليلات المتجانسة العادية (مع نفس أرقام تكرار CGG في الأليلات اثنين) في هذه الحالات أو عدم القدرة على التمييز بين الأليل اتيروس heterozygous التي لديها اختلافات متكررة في عدد من أربعة أو أقل29. ومع ذلك، يمكن تصنيف هذه النتائج ذات الذروة الواحدة على أنها طبيعية، لأنه تم التحقق من أن خط الأنابيب القائم على PCR يتيح تضخيم قوي والكشف عن الطفرة الكاملة أو الأليل اتالالات ما قبل التحوير، مما يقلل من إمكانية سلبية كاذبة في هذا الوضع. ويتمثل أحد أنواع الحالات دون المستوى الأمثل في تحيز خط الأساس، كما هو مبين في الشكل 2زاي،الذي يمكن أن يسفر عن نتائج غامضة أو غير قابلة للتفسير في بعض الحالات. ويُشتبه في أن هذا الشرط ناجم عن مسألة تتعلق بصك. يتم رسم أحجام الأجزاء المقاسة للعينات غير المعروفة مقابل منحنى معيار الانحدار الخطي المشتق من العينات المرجعية لحساب أحجام التكرار تلقائيًا باستخدام برنامج التحليل، كما هو معروض في الشكل 2H. يتم استيفاء أحجام الأجزاء التي تقل عن 200 تكرار في منحنى الانحدار الخطي القياسي بينما يتم قياس أحجام الأليل الأكبر من الطفرة الكاملة من خلال استقراء على طول نفس الخط القياسي. كما يعرض البرنامج تصنيف كل عينة وفقا لإرشادات مختلفة.

Figure 1
الشكل 1: نتائج تغيير حجم العينات المرجعية الأنثوية ومنحنى الانحدار الخطي المقابل. (A, B)تظهر ملامح حجم العينة المرجعية للإناث قبل النفير (NA20240، تكرار الأحجام من 30 و 80) وعينة مرجعية الإناث طفرة كاملة (NA20239، تكرار الأحجام من 20 و 200)، على التوالي. يتم تضمين علامتين (علامة أقل، 50 نقطة أساس وعلامة أعلى 10380 bp) في نتيجة الكهربائي لكل عينة. الذروة مع حجم ما يقرب من 95 نقطة في الثانية يشير إلى مجمع التمهيدي. تشير الأسهم السوداء إلى حجم الذروة للمركب التمهيدي، وتمثل الأسهم الزرقاء طول جزء العينة المرجعية. (C)يتم إنشاء منحنى معيار الانحدار الخطي مع أربع نقاط (الماس الأزرق) من العينات المرجعية اثنين في برنامج التحليل. تُظهر المحاور الأفقية والرأسية أرقام تكرار CGG المحسوبة وطول الشظية المقيس ة في الكتروفوريس الميكروفلويدي. كانت قيمة R2 الانحدار 0.99967. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: النتائج التمثيلية للعينات السريرية ذات الحجم المتكرر المختلف CGG. (A-E)إظهار ميزات الحجم التمثيلي بواسطة محلل حيوي في ترتيب عادي (مع أطوال جزء من 328 نقطة أساس و 353 نقطة أساس، المقابلة للأرقام المتكررة من 28 و 36)، متوسطة (مع أطوال جزء من 335 نقطة أساس و 390 نقطة أساس، المقابلة لـ تكرار أرقام 30 و 49)، والتحويل المسبق (مع أطوال جزء من 332 نقطة أساس و 439 نقطة أساس، المقابلة للأرقام المتكررة من 29 و 65)، طفرة كاملة (مع أطوال جزء من 337 نقطة أساس و 1911bp، المقابلة لتكرار أرقام 31 و 545) والفسيفساء كاملة الطفرات (مع أطوال جزء من 349 نقطة أساس، 1201 نقطة أساس و 2688 نقطة أساس، المقابلة للأرقام المتكررة من 33، 294 و 751) عينات. (F)يقدم نتيجة الكهربائي microfluidic ذروة واحدة (مع طول جزء من 334 نقطة في الثانية، المقابلة للعدد المتكرر من 30) من الإناث الذين ربما لديها alleles homozygous (مع نفس الأرقام تكرار CGG في alleles اثنين) أو [هيتيروسيغوس] [ألّلس] (مع ال [كغّ] تكرار رقم فروق من أربعة أو أقلّ). (G)يظهر نوع واحد من الوضع دون الأمثل الذي هو التحيز خط الأساس. تشير الأسهم السوداء إلى حجم الذروة في مجمع التمهيدي، وتمثل الأسهم الحمراء طول جزء العينة. (H)يعرض واجهة النتيجة الرئيسية لبرنامج التحليل. يتم رسم أحجام الأجزاء المقاسة للعينات غير المعروفة مقابل منحنى الانحدار الخطي القياسي لحساب أحجام التكرار تلقائيًا. يتم تعيين الأليل الطبيعي للعينة الأنثوية ذات الطفرة الكاملة للفسيفساء الموضحة في (E) إلى المنحنى القياسي في الركن الأيسر السفلي من منطقة محور الإحداثيات (المرسومة باللون الأخضر)، والأليلات الأكبر ذات الطفرة الكاملة (المرسومة باللون الأحمر) التي تم استقراؤها خارج أربع نقاط قياسية (الماس الأزرق على منحنى). تعرض الأقسام الجدولية في النصف السفلي من الشكل أحجام الأجزاء والتصنيف التشخيصي المقابل وفقاً لحدود المبادئ التوجيهية التي تم اختيارها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FXS هو السبب الثاني الأكثر شيوعا من الإعاقة الذهنية بعد trisomy 21، مما يمثل ما يقرب من نصف التخلف العقلي المرتبطة بـ X30، والتي قد تؤثر على ما يقرب من 1 من كل 4000 ذكر و1 من كل 8000 أنثى. والأهم من ذلك، ما يقرب من 1 من كل 250-1000 الإناث تحمل ما قبل النقوس، وهذا التردد هو 1 في 250-1600 في الذكور26،31،32،33. وبما أن خطر تكرار الطفرات إلى الطفرات الكاملة عند نقل الأليل قبل النفير إلى الذرية يرتفع بشكل كبير، على سبيل المثال، من 4٪ عندما يكون حجم تكرار الأمهات 55-59 إلى 98٪ عندما يكون الحجم 100-20014، فإن تحديد CGG تكرار حجم في نطاق أوسع يمكن أن تسهل تشخيص FXS وفحص الناقلين قبل النفير لتخطيطها الإنجابي. الطريقة المستندة إلى PCR التي أدخلت هنا دقيقة وسريعة وقوية لتضخيم تسلسل تكرار في 5'UTR من المروج FMR1 وتحديد الطيف الكامل من CGG تكرار الأرقام على جهاز الكهربائي الشعيرات الدموية microfluidic، وبالتالي يمكن تعزيز تطبيقها على نطاق واسع في التشخيص الجزيئي وفحص FXS والاضطرابات الهشة ذات الصلة X مع أقل بدوره حول الوقت والاستثمار في المعدات. يمكن استخدام أداة المحلل الحيوي بثقة في إعدادات اختبار الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة لقياس حجم التكرار. المعدات هي أصغر بكثير، وأقل تكلفة وأبسط للحفاظ على من غيرها من الأدوات الكهربائي الشعرية، مثل محللات الجينات الشعرية ABI. بالنسبة للفحص عالي الحجم، يوفر نظام MultiDX الذي يحتوي على طراز يصل إلى 384 عينة مرونة واسعة والإنتاجية للاختبارات.

ويشمل التصنيف أربع خطوات رئيسية: تضخيم PCR للتسلسلات المتكررة في 5'UTR للمروّج FMR1 (PCR الإعداد وPCR التضخيم يأخذ ما يقرب من 3.5 ساعة)، تنقية منتجات PCR (يأخذ ما يقرب من 1 ساعة)، تجزئة على microfluidic أداة الكهربائي الشعرية (يأخذ ما يقرب من 1 ساعة)، وتفسير عدد CGG يكرر باستخدام برنامج التحليل عن طريق الاستدلال من المعايير المرجعية مع تكرار المعروفة (يأخذ ما يقرب من 0.5 ساعة). في المجموع، فإن الوقت بدوره حول هذا القول هو ما يقرب من 6 ح. وللحصول على الأداء الأمثل، ينبغي تنقية عينات الحمض النووي لإزالة المواد المسببة للتداخل المفترض مثل البروتينات وتركيزات الملح العالية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الكمية الموصى بها من الحمض النووي المدخلات هو 50-100 نانوغرام لكل 20 ميكرولتر من تفاعل PCR. وقد تبين أن كميات الحمض النووي التي تزيد عن 150 نانوغرام لكل 20 ميكرولتر من نظام PCR تؤدي إلى ضعف تضخيم الأليلات المتكررة الكبيرة. وعلاوة على ذلك، يوصى بشدة بإعداد عينتين مرجعيتين على الأقل ذات أحجام تكرار ذات طابع جيد في كل عملية تشغيل من الـ PCR لإجراء تحليل متزامن للأرقام المكررة كمراقبة للجودة وما يترتب على ذلك من تغيير حجم تلقائي للأجزاء في برنامج التحليل 29- عادة، ينبغي أن تكون قيمة R2 لمنحنى الانحدار الخطي المستمد من العينات المرجعية أكبر من 0.98. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تنقية منتجات PCR قبل الكهربائي الشعري microfluidic لتحسين كفاءة الكشف. كما يتم تسمية التمهيدي PCR مع FAM الفلورية29،جزء التحجيم مع نظام الكهربائي المناسب (على سبيل المثال، محلل حيوي ونظام MultiDX) يمكن أن يؤديها مباشرة دون وضع علامات إضافية.

وقد تم استعراض مجموعة متنوعة من المنهجيات لتشخيص ودراسة FXS والاضطرابات ذات الصلة بشكل شامل من قبل بروس E. هايوارد وآخرون، بما في ذلك الاختبارات المستندة إلى الحمض النووي واختبارات البروتين FMRP34. كما هو الحال في معظم الحالات الأساس الجزيئي لFXS هو طفرة ديناميكية تتميز بتوسيع CGG تكرار في المنطقة المروجة للجين FMRP1، النشاف الجنوبي والاختبارات المستندة إلى تضخيم باستخدام الحمض النووي الجيني هي الاختبارات الأكثر استخداما ل تحديد الرقم المتكرر. ومن المعروف جيدا أن الاختبارات المستندة إلى PCR تزن النشاف الجنوبي في فعالية التكلفة والحد الأدنى من متطلبات كمية الحمض النووي. ومع ذلك، فإن تضخيم تكرار CGG هو التحدي الرئيسي لأن ارتفاع محتوى GC يمكن أن تؤثر على الكفاءة، وقد بذلت الكثير من الجهد لتحسين نظام PCR على مدى السنوات34. وقد تم تحسين مجموعة X PCR الهشة لتضخيم دقيق من تكرار ترينوكليوتيد CGG بأكمله، وقد تم الإبلاغ عن دراسة التحقق من صحة أداء هذه الطريقة المستندة إلى PCR من قبل مجموعتنا29. وفي عام 2012، أبلغ موقع Mailick Seltzer وآخرونعن طريقة مماثلة تستند إلى PCR، ولكن تم استخدام أداة ABI 3730xl لتحديد حجم التكرار، ولم يتم التعرف إلا على الأفراد الذين يقل حجمهم المتكرر عن 200 شخص. قد يرجع ذلك إلى حقيقة أن النظام الأساسي الذي تم اختياره لم يكن قادراً على الكشف عن تكرار أكبر مع تكرار حجم فوق 200. وعلى النقيض من ذلك، فإن أداة المحلل الحيوي التي نستخدمها تقدم فحصًا أكثر قوة لتحجيم الأجزاء، حيث يمكنها الكشف بدقة وفعالية من حيث التكلفة عن الطيف الكامل لـ FMR1 CGG الذي يتكرر بما في ذلك الطفرات الكاملة29.

باستثناء تكرار عدد، وهناك عدة عوامل أخرى تحتاج أيضا إلى التأكد من التشخيص المناسب للاضطرابات FXS وFXS ذات الصلة، بما في ذلك طفرة FMR1، ومدى الميثيل والفسيفساء34. يمكن رصد حالة الميثيل بطرق مختلفة مثل دمج خطوات ما قبل الهضم باستخدام إنزيم تقييد حساس للمثيلة أو فحص تعديل bisulfite34، ومع ذلك، فإن فحصنا غير قادر على تحديد حالة مثيلة 5'UTR من المروج FMR1. بالإضافة إلى ذلك، فإن خطر التوسع في آليل FMR1 يعتمد أيضا على وجود انقطاع AGG، والتي يمكن أن استقرار الجين أثناء انتقال. وقد تم تعديل الاختبارات المتكررة المستندة إلى PCR للكشف عن انقطاع AGG في حين أن عدم استقرار إنزيم الهضم هو واحد من القيود الرئيسية. Triplet-تستعد (TP) PCR باستخدام الربط التمهيدي PCR الهجين في CGG يكرر أو انقطاع AGG هو نوع آخر من فحص PCR التي يمكن الكشف عن حجم تكرار CGG وانقطاع AGG في وقت واحد. ومع ذلك، فإن طريقة PCR الخاصة بالجينات FMR1 التي وصفناها غير قادرة على تحديد حالات انقطاع الـ AGG ما لم يتم إجراء تسلسل جين FMR1 بعد إجراء التضخيم. في الآونة الأخيرة، أفاد هايوارد وآخرون عن أساليب PCR المستخدمة في مختبرهم الخاص لتحديد جميع المعلمات اللازمة لإجراء دراسة جينية كاملة أو دراسة مختبرية شاملة، بما في ذلك الاختبارات التي يمكن الكشف عن العدد المتكرر، وحالة انقطاع AGG و حالة المثيلة36. ولسوء الحظ، لا يمكن لأي من الدراسة أن تحدد جميع هذه العوامل بصورة شاملة حتى الآن.

ومن الجدير بالذكر أن هذا القول غير قادر على الكشف عن عمليات الحذف أو المتغيرات أحادية النيوكليوتيد داخل جين FMR1، الذي يمثل ما يقرب من 1٪ من حالات FXS27. نادرا، في الأفراد الذين لديهم الفسيفساء الخلوية لتكرار FMR1، PCR قد تعطي نتيجة سلبية كاذبة بسبب الفشل في الكشف عن الفسيفساء لمقدمات أكبر وalleles الطفرة الكاملة37،38. وقد ثبت أن عتبة هذا التصنيف القائم على PCR لفسيفساء عينة الذكور طفرة كاملة (341 يكرر) هو 2.5٪ عندما يتم تعيين عتبة كاشف الذروة في ثلاث وحدات الفلورة فوق خط الأساس29. ويوصى بتحليل اللطخة الجنوبية في الحالات التي يشار فيها إلى أليلات الفسيفساء. وعلاوة على ذلك، وفيما يتعلق بمنصات الكهربائي، أشارت الدراسة السابقة إلى أنه بالمقارنة مع أنظمة الكهربائي الشعرية (على سبيل المثال، أداة ABI 3130XL)، فإن أداة المحلل الحيوي غير قادرة على التمييز بين المتجانسات العادية عينات الإناث مع قمم جزء الفردية من عينات الإناث مع الأحجام المتكررة heterozygous التي لديها اختلافات عدد تكرار من أربعة أو أقل29. ومع ذلك، يمكن تصنيف هذه العينات ذات الذروة الواحدة على أنها طبيعية، لأنه تم التحقق من أن خط الأنابيب القائم على PCR يتيح تضخيم قوي والكشف عن الطفرة الكاملة أو الأليل اتالالات ما قبل التحوير، مما يقلل من إمكانية سلبية كاذبة في هذا الوضع. بغض النظر عن القيود المذكورة أعلاه، يمكن استخدام هذه الطريقة كخط أنابيب من الدرجة الأولى لتحديد الجزيئية من FXS والأمراض الهشة المرتبطة X مع فعالية التكلفة، والمتانة ووقت الإبلاغ السريع، وتكملها تسلسل الجينات FMR1 وتحليل اللطخة الجنوبية لمستويات الميثيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا البحث بمنح من مشروع إدارة الطوارئ التابع للجنة الوطنية للعلوم والطوارئ (المنحة رقم 81741004)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81860272)، وخطة البحوث الرئيسية لمؤسسة العلوم والتكنولوجيا الإقليمية في غوانغشي ( رقم المنحة AB16380219)، ومنحة مؤسسة ما بعد الدكتوراه الصينية (منحة رقم 2018M630993)، ومؤسسة قوانغشى للعلوم الطبيعية (المنحة رقم 2018GXNSFAA281067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M. Jr, et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Tags

علم الوراثة العدد 151 تفاعل البوليميراز المتسلسل الكهربائي الشعري الميكروفلويدي السيتوسين-غوانين-غوانين يكرر ترينوكلوتيد التخلف العقلي الهش X-1 المروج متلازمة X الهشة طفرة كاملة ما قبل التحوير
اختبار قوي من تفاعل البوليميراز القائم على سلسلة لقياس السيتوسين-غوانين-غوانين ترينوكلوتيد يكرر في التهشاشة X التخلف العقلي-1 الجينات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung,… More

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter