Summary
Een nauwkeurige en robuuste polymerase kettinggebaseerde assay test voor het kwantificeren van Cytosine-guanine-guanine trinucleotide herhalingen in het fragiele X mentale retardatie-1 gen vergemakkelijkt de moleculaire diagnose en screening van fragiel X-syndroom en fragiele X-gerelateerde aandoeningen met kortere turn-around tijd en investering in apparatuur.
Abstract
Fragiel X-syndroom (FXS) en geassocieerde aandoeningen worden veroorzaakt door uitbreiding van de Cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide REPEAT in de 5 ' onvertaalde regio (UTR) van de fragiele X Mental Retardation-1 (FMR1) Gene Promoter. Conventioneel, capillaire elektroforese fragment analyse op een genetische analysator wordt gebruikt voor de dimensionering van de CGG herhalingen van FMR1, maar extra Southern blot analyse is vereist voor exacte meting wanneer het herhalingsnummer hoger is dan 200. Hier presenteren we een accurate en robuuste polymerase kettingreactie (PCR)-gebaseerde methode voor de kwantificering van de CGG-herhalingen van FMR1. De eerste stap van deze test is de PCR-versterking van de herhalings sequenties in de 5 ' UTR van de FMR1 -promotor met behulp van een fragiele X PCR-Kit, gevolgd door zuivering van de PCR-producten en fragment dimensionering op een microfluïdisch capillair elektroforese-instrument, en latere interpretatie van het aantal CGG herhalingen door te verwijzen naar normen met bekende herhalingen met behulp van de analyse software. Deze PCR-gebaseerde test is reproduceerbaar en kan het volledige bereik van CGG-herhalingen van FMR1 -promotors identificeren, waaronder die met een herhaald aantal van meer dan 200 (geclassificeerd als volledige mutatie), 55 tot 200 (premutatie), 46 tot 54 (intermediair) en 10 tot 45 (normaal). Het is een kosteneffectieve methode die de classificatie van de FXS en fragiele X-geassocieerde aandoeningen met robuustheid en snelle rapportage tijd vergemakkelijkt.
Introduction
Fragiele X syndroom (FXS) en fragiele X geassocieerde aandoeningen, bijvoorbeeld tremor en ataxie syndroom (FX-TAS), en primaire ovariële insufficiëntie (FX-POI) worden voornamelijk veroorzaakt door Cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide herhalings uitbreiding in de 5 ' onvertaalde regio (UTR) van het fragiele X Mental Retardation-1 (FMR1) gen op xq 27,31,2. De FMR1 gecodeerd eiwit (FMRP) is een poly ribosome-geassocieerde RNA-bindende proteïne dat functioneert in neuronale ontwikkeling en synaptische plasticiteit door het reguleren van alternatieve splicing, stabiliteit, en dendritische transport van mRNA of modulerende synthese van partiële postsynaptische eiwitten3,4,5,6,7.
De dynamische variatie met een CGG herhalings grootte van > 200 wordt beschreven als volledige mutatie, die de afwijkende hypermethylatie en daaropvolgende transcriptionele uitschakeling van de FMR1 Promoter8induceert. De resulterende afwezigheid of het ontbreken van het FMRP-eiwit verstoort de normale neuronale ontwikkeling en veroorzaakt FXS9, gekenmerkt door verschillende klinische symptomen, waaronder matige tot ernstige verstandelijke handicap, ontwikkelingsachterstand, hyperactieve gedragingen, slechte contacten en autistische manifestaties10,11,12. De presentatie bij vrouwelijke FXS-patiënten is over het algemeen mildere dan die bij mannen. De CGG herhalings grootte variërend van 55 tot 200 en 45 tot 54 zijn geclassificeerd als premutatie en tussenliggende status, respectievelijk. Vanwege de hoge mate van instabiliteit, breidt de CGG-herhalings grootte in een premutatie of intermediair allel vermoedelijk uit wanneer ze worden overgebracht van ouders naar nakomelingen13,14. Zo zijn dragers met premutatie allelen met een hoog risico op het krijgen van kinderen getroffen met FXS vanwege de herhaalde expansie, en in sommige gevallen kunnen intermediaire allelen hun herhalings grootte uitbreiden tot het volledige mutatie bereik van twee generaties15, 16. Bovendien geven mannetjes met premutatie ook een verhoogd risico op het ontwikkelen van Late-onset FX-tas17,18,19, terwijl premutatie vrouwtjes voorbestemd zijn voor zowel FX-tas als FX-POI20, 21,22. Onlangs is gemeld dat autistische spectrum stoornissen met vertraging in de ontwikkeling en problemen in sociaal gedrag worden gepresenteerd bij kinderen met premutatie FMR1 allelen23,24.
Om te bepalen van de exacte CGG REPEAT grootte is van groot belang voor de classificatie en voorspelling van de FXS en fragiele X-geassocieerde aandoeningen25,26. Historisch gezien is de CGG herhalings regiospecifieke polymerase kettingreactie (PCR) met fragment dimensionering plus Southern blot analyse de gouden standaard voor moleculaire profilering van de FMR1 CGG REPEAT27. Traditionele specifieke PCR is echter minder gevoelig voor grote premutaties met meer dan 100 tot 130 herhalingen en is niet in staat om volledige mutaties te versterken27,28. Bovendien kan capillaire elektroforese op een traditionele genetische analysator voor herhaalde dimensionering FMR1 PCR-producten niet detecteren met meer dan 200 CGG-herhalingen. De Southern blot-analyse maakt differentiatie mogelijk van een breder scala aan herhalings grootte, van normale tot volledige mutatie herhalings nummers, en is op grote schaal gebruikt voor het bevestigen van volledige mutaties (bij mannetjes) en het differentiëren van heterozygoot allelen met een volledige mutatie uit blijkbaar homozygoot allelen met normale herhaalde maten (bij vrouwtjes). De resolutie voor het kwantificeren van de herhalingen is echter beperkt. Nog belangrijker is dat deze stapsgewijze teststrategie arbeidsintensieve, tijdrovende en kosten ineffectief is.
Hier presenteren we een accurate en robuuste PCR-gebaseerde methode voor de kwantificering van de CGG herhalingen van FMR1. De eerste stap van deze test is de PCR-versterking van de herhalings sequenties in de 5 ' UTR van de FMR1 Promoter met behulp van de FRAGIELE X PCR Kit. De PCR-producten worden gezuiverd en fragment dimensionering wordt uitgevoerd op een microfluïdisch capillair elektroforese instrument, en de daaropvolgende interpretatie van het aantal CGG herhalingen met behulp van de analyse software door te verwijzen naar normen met bekende herhalingen op basis van de de reden dat de lengte van het PCR-fragment recht evenredig is aan het aantal CGG-herhalingen. Het PCR-systeem omvat reagentia die de versterking van het zeer GC-rijke trinucleotide herhalingsgebied vergemakkelijken. Deze PCR-gebaseerde test is reproduceerbaar en kan alle bereiken van CGG-herhalingen van FMR1 -promotors identificeren. Dit is een kosteneffectieve methode die een brede toepassing kan vinden in de moleculaire diagnostiek en screening van FXS en fragiele X-gerelateerde aandoeningen met minder turn-around tijd en investeringen in apparatuur en dus kan worden gebruikt in een breder spectrum van klinische Laboratoria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische goedkeuring werd verleend door de joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East cluster klinisch onderzoek ethiek Commissie (referentienummer: 2013,055)
1. PCR-versterking
- Verwijder vóór het starten de PCR-buffer mix, monster verdunningsmiddel en DNA-monsters (zowel test-als referentie-DNA) (Zie de tabel met materialen) van de-20 °c vriezer en bewaar ze gedurende 20 – 30 minuten op kamertemperatuur om te controleren of alle reagentia en DNA volledig ontdooid zijn. Vortex en draai kort voor gebruik.
- Meet de concentratie van de DNA-monsters met behulp van een spectrofotometer (Zie tabel met materialen). De DNA-concentratie moet 25 ng/μL zijn; verdunnen met monster verdunningsmiddel naar de juiste concentratie indien nodig.
Opmerking: Het DNA moet worden geëxtraheerd en gezuiverd om storende stoffen, zoals eiwitten en hoge zoutconcentraties, te verwijderen. Niet-gedegradeerd, kwalitatief hoogwaardig DNA moet worden gebruikt voor volgende PCR-amplificatie en-analyse (A260/A280:1.8 – 2.0 en A260/A230: > 1.0). - Label putten van een PCR-plaat of 0,2 mL PCR-buizen om referentie-en geteste DNA-monsters te identificeren.
- Bereken het aantal PCR-reacties dat nodig is voor de test monsters, 2 referentiemonsters en een negatief controlemonster. Bereid de PCR-Master mix voor door toevoeging van 15 μL PCR-buffer mengsel, 2,6 μL monster verdunningsmiddel en 0,4 μL polymerase voor elke reactie.
Opmerking: Een negatieve controle met behulp van verdunningsmiddel is essentieel om de PCR-prestaties te bewaken. Bereid de PCR-Master Mix bij kamertemperatuur, Pipetteer niet op ijs. De PCR-buffer mix is visceus. Meng de buis en draai kort vóór gebruik. - Vortex de PCR-Master mix van stap 1,4 voor 10 – 20 s en draai naar beneden. Doseer langzaam 18 μL van het mengsel in elke put of buis.
- Vortex en draai de DNA-samples om. Pipetteer 2 μL van elk DNA in de juiste put of buis voor een laatste PCR-volume van 20 μL. Meng door 5 keer op en neer te pipetteren.
Opmerking: De totale hoeveelheid DNA per reactie moet 50 – 100 ng zijn. DNA-bedragen groter dan 150 ng per 20 μL PCR-reactie kunnen resulteren in een slechte versterking van grote herhaalde allelen. Voor lagere geconcentreerde Dna's kan de hoeveelheid monster verdunningsmiddel in de PCR-Master mix worden vervangen door een DNA-oplossing. - Sluit de plaat af met zelfklevende sealer of met buis doppen.
- Plaats de verzegelde PCR-plaat of-buizen in de thermische cycler met verwarmde deksel. Voer het programma uit met de volgende instellingen: 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 25 cycli denaturering bij 98 °C voor 35 s, gloeien bij 59 °C voor 35 s en verlenging bij 72 °C gedurende 4 minuten; een laatste stap bij 72 °C gedurende 10 min. Houd de PCR-producten bij 4 °C in de cycler tot de verwijdering voor verdere verwerking.
- Na PCR-amplificatie worden de producten onmiddellijk gezuiverd en geanalyseerd, of gedurende een nacht op + 2 tot + 8 °C bewaard. Als alternatief kan het product tot 30 dagen worden bewaard bij-30 tot-16 °C.
2. zuivering van de PCR-producten
- Verwarm de couveuse Shaker voor op 65 °C.
- Voeg voor elke PCR-reactie 80 μL 1x TE buffer (Zie de tabel met materialen) toe aan de 20 μL van elk PCR-product uit rubriek 1.
- Breng het monster mengsel over in een PCR-opschoon plaat (Zie tabel met materialen) met behulp van een meerkanaalspipet.
- Houd de plaat onbedekt en plaats deze in de incubator, en incureren bij 65 ° c terwijl het schudden bij 1.200 rpm gedurende 10 minuten.
- Stel na incubatie het vacuüm instrument in op 250 mbar (of 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 in Hg) en zuig de oplossing door het filter 15 min. putten mogen geen vloeistof resterend hebben.
- Koel de incubator Shaker af tot 25 °C.
- Schakel na de eerste aspiratie het vacuüm uit en voeg 50 μL 1x TE buffer aan elke put toe. Niet mengen. Aspirate de oplossing voor 10 min met behulp van de vacuüm-instellingen in stap 2,5.
- Droog de bodem van het filter plaatje door het stevig op een stapel papieren handdoeken te drukken.
- Voeg 20 μL 1x TE buffer toe aan het midden van elke put. Plaats de plaat in de incubator en bebroed bij 25 °C terwijl u gedurende 5 minuten met 1.200 tpm schudt.
- Breng na incubatie > 15 μL van elk gezuiverd PCR-DNA van stap 2,9 over naar een nieuwe 96-well PCR-plaat. Het gezuiverde DNA kan direct worden geanalyseerd, of als alternatief kan worden opgeslagen bij-30 tot-16 °C tot dat nodig is.
3. fragment dimensionering van PCR-producten
- Laat voorafgaand aan het starten het DNA-kleurstof concentraat, de DNA-gel-matrix, de DNA-marker, de DNA-ladder en de gezuiverde DNA-monsters van stap 2 toe op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
-
Het priming station instellen.
- Vervang de spuit (Zie tabel van de materialen) bij gebruik van een nieuwe batch reagentia.
- Pas de basisplaat aan en laat de hendel van de spuit clip los en schuif deze omhoog naar de bovenste positie.
- Start de dimensioneringssoftware (Zie tabel met materialen) en bereid de gel-Dye mix voor.
-
Vortex Dye concentraat voor 10 sec. en spin naar beneden. Voeg 25 μL van de kleurstof toe aan een gel matrix flacon. Vortex de gemengde oplossing goed en spin naar beneden.
- Breng de gel-Dye mix over naar een spin filter. Plaats het spin filter in een micro centrifuge en draai gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 1.500 x g ± 20%.
Opmerking: Bescherm de oplossing met kleurstof uit licht en bewaar na gebruik bij 4 °C. De gel-Dye mix kan worden gebruikt voor ongeveer 15 chips eenmaal voorbereid. Laat de gel-Dye mix elke keer voor gebruik op kamertemperatuur gaan voor 30 minuten.
- Breng de gel-Dye mix over naar een spin filter. Plaats het spin filter in een micro centrifuge en draai gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 1.500 x g ± 20%.
-
Laad de gel-Dye mix.
- Plaats een nieuwe DNA-chip op het priming station. Voeg 9 μL gel-Dye mix toe aan de goed gemarkeerde met "G". Controleer of de zuiger op het 1 mL-merk is geplaatst en sluit vervolgens het priming-station.
- Druk de zuiger van de spuit naar beneden totdat deze door de clip wordt vastgehouden. Wacht exact 30 sec. en laat de clip los. Wacht 5 sec. en trek de zuiger langzaam terug naar de 1 mL positie.
- Open het priming station en voeg 9 μL gel-Dye mix toe aan de putten gemarkeerd met "G".
- Voeg 5 μL Marker toe aan de goed gemarkeerde met het ladder symbool en voeg ook 5 μL Marker toe aan elk van de 12 monster putten. Laat geen putjes leeg.
- Voeg 1 μL DNA ladder toe aan de goed gemarkeerde met het ladder symbool. Voeg 1 μL PCR-product (gebruikte putten) toe uit stap 3,1 of 1 μL ultrapuur water (ongebruikte putten) in elk van de 12 monster putten. Plaats de chip horizontaal in de adapter van Vortex mixer en Vortex gedurende 1 minuut bij de aangegeven instelling (2.400 rpm).
- Steek de chip in het instrument van de bioanalyzer en voer de chip in het instrument binnen 5 min.
- Nadat de test is voltooid, verwijdert u onmiddellijk de gebruikte chip uit het instrument.
- Voeg langzaam 350 μL gedeïoniseerd water toe aan een van de putjes van de elektrode reiniger. Open de deksel van de bioanalyzer en plaats de elektrode reiniger erin. Sluit de deksel en incuberen voor ongeveer 10 s. Open het deksel en verwijder de elektrode reiniger. Wacht nog eens 10 s om het water op de elektroden te laten verdampen en sluit vervolgens het deksel.
4. Analyseer de fragment Dimensionerings resultaten
Opmerking: De referentiemonsters moeten worden versterkt en geanalyseerd door dezelfde thermische cycler en bioanalyzer in dezelfde batch met de onbekende monsters.
- Nadat de bioanalyzer-uitvoering is voltooid, exporteert u de piek gegevens van elke uitvoering als een CSV-tabel bestand voor volgende analyse.
- Start de analyse software en open het geëxporteerde. CSV-piek tabel bestand uit stap 4,1.
- Controleer via het tabblad menu van QC de regressielijn die is aangebracht op de vier punten (weergegeven als blauwe diamanten op het perceel) uit de twee referentiemonsters. De R2 -waarde van de regressielijn moet > 0,98 (typische waarden overschrijden 0,999).
- Controleer via het menu tabblad resultaten de herhalings grootte van elk monster waarvan de fragment lengte (s) automatisch wordt uitgezet tegen de standaard curve van de lineaire regressie die is afgeleid van de referentiemonsters. De software biedt ook de classificatie van elk monster volgens verschillende richtlijnen.
- Via de exporteren menu tabblad, exporteert u het resultaatrapport voor elk voorbeeld met de herhalings nummers en diagnostische classificatie, evenals een samenvatting van de voorbeeld informatie en het QC-rapport voor elke uitvoering.
Opmerking: Analyse software maakt het gebruik van aangepaste classificatie richtlijnen, zoals American College of Medical Genetics (ACMG) of klinische moleculaire genetica Society/European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG) richtsnoeren, evenals vooraf gedefinieerde classificatie Criteria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De dimensionerings resultaten van het vrouwelijke referentiemonster van de premutatie (NA20240, herhalings grootten van 30 en 80) en het vrouwelijke referentiemonster voor de volledige Mutatie (NA20239, herhalings grootten van 20 en 200) worden respectievelijk weergegeven in Figuur 1a en Figuur 1b. Meestal zijn twee markerings pieken (lagere marker 50 basis paren [BP] en bovenste marker 10.380 BP) opgenomen in het fragment grootte profiel. Er is meestal een primer complexe piek met een grootte van bijna 95 BP. Door middel van het referentiemonster kan een lineaire regressie standaard curve met vier punten worden geconstrueerd, zoals tentoongesteld in figuur 1c.
De representatieve grootte kenmerken van klinische normale, tussentijdse, premutatie en volledige mutatie monsters worden weergegeven in Figuur 2A – D. Met name mozaïek volledige mutaties met twee uitgebreide fragment pieken en één normale piek worden weergegeven in figuur 2e. In sommige vrouwelijke gevallen wordt slechts één piek weergegeven in de resultaten van de microfluïdische elektroforese, zoals weergegeven in figuur 2F. Dit kan worden verklaard door de presentatie van normale homozygoot allelen (met dezelfde CGG herhalings getallen in de twee allelen) in deze gevallen of het onvermogen van het differentiëren van heterozygoot allelen die herhaalde aantal verschillen hebben van vier of minder29. Deze single-Peak resultaten kunnen echter als normaal worden geclassificeerd, omdat is gevalideerd dat de PCR-gebaseerde pijpleiding robuuste versterking en detectie van volledige mutatie of premutatie allelen mogelijk maakt, waardoor de kans op vals negatief in deze situatie. Een type suboptimale situatie is Baseline bias, zoals weergegeven in afbeelding 2g, die in sommige gevallen ambigue of oninterpretabel resultaten kan opleveren. Een dergelijke voorwaarde wordt vermoedelijk veroorzaakt door een instrument probleem. De gemeten fragment grootten van onbekende monsters worden uitgezet tegen de standaard curve van de lineaire regressie die is afgeleid van de referentiemonsters om automatisch de herhalings grootten te berekenen met behulp van de analyse software, zoals weergegeven in afbeelding 2H. Fragment grootten van minder dan 200 herhalingen worden geïntermuleerd in de standaard curve van de lineaire regressie terwijl grotere volledige-mutatie allel-grootten worden gemeten door te extrapoleren langs dezelfde standaardlijn. De software toont ook de classificatie van elk monster volgens verschillende richtlijnen.
Figuur 1: de dimensionerings resultaten van de vrouwelijke referentiemonsters en de corresponderende lineaire regressie curve. (A, B) tonen de grootte kenmerken van de premutatie vrouwelijke referentiemonster (NA20240, herhalings grootten van 30 en 80) en de volledige mutatie vrouwelijke referentiemonster (NA20239, herhaalde maten van 20 en 200), respectievelijk. Twee markers (onderste marker, 50 BP en bovenste marker 10380 BP) zijn opgenomen in het elektroforese resultaat voor elk monster. De piek met een grootte van bijna 95 BP duidt op een primer complex. Zwarte pijlen geven de piekgrootte van het primer complex aan en blauwe pijlen geven de fragment lengte van het referentiemonster aan. C) de standaard curve van de lineaire regressie met vier punten (blauwe diamanten) uit de twee referentiemonsters wordt in de analyse software geconstrueerd. De horizontale en verticale assen tonen de berekende CGG herhalings nummers en de gemeten fragment lengte in microfluïdische elektroforese. De R2 -waarde van de regressie was 0,99967. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: de representatieve resultaten van klinische monsters met verschillende CGG herhalings grootte. (A – E) de representatieve grootte kenmerken van bioanalyzer in de volgorde van normaal (met fragment lengtes van 328 bp en 353 BP, overeenkomend met de herhalings nummers van 28 en 36), Intermediate (met fragment lengten van 335 bp en 390 BP, overeenkomend met de Herhaal nummers van 30 en 49), premutatie (met fragment lengtes van 332 BP en 439 BP, overeenkomend met de herhalings aantallen van 29 en 65), volledige Mutatie (met fragment lengtes van 337 BP en 1911bp, overeenkomend met de herhalings aantallen van 31 en 545) en mozaïek vol mutaties (met fragment lengtes van 349 BP, 1201 BP en 2688 BP, overeenkomend met het herhalings getal van 33, 294 en 751) monsters. (F) presenteert een microfluidisch elektroforese-resultaat met één piek (met een fragment lengte van 334 BP, overeenkomend met het herhalingsnummer van 30) van een vrouwtje dat waarschijnlijk homozygoot-allelen heeft (met dezelfde CGG-herhalings getallen in de twee allelen) of heterozygoot allelen (met de CGG herhalingen aantal verschillen van vier of minder). (G) toont één type van de suboptimale situatie die Baseline bias is. Zwarte pijlen geven de piekgrootte van het primer complex aan en rode pijlen geven de fragment lengte van het monster aan. (H) toont de belangrijkste resultaat interface van de analyse software. De gemeten fragment grootten van onbekende monsters worden uitgezet tegen de standaard curve van de lineaire regressie om de herhalings grootten automatisch te berekenen. Het normale allel van het in (E) weergegeven vrouwelijke mozaïek met volledige mutatie wordt toegewezen aan de standaard curve in de linkerbenedenhoek van de coördinaat-as regio (uitgezet in het groen), en de grotere volledige mutatie allelen (uitgezet in rood) geëxtreerd buiten de vier standaardpunten (blauwe diamanten op de curve). De secties in tabelvorm in de onderste helft van de afbeelding presenteren de fragment grootten en de bijbehorende diagnostische classificatie volgens de gekozen ACMG richtlijn grenzen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FXS is de tweede meest voorkomende oorzaak van verstandelijke beperking na trisomie 21, die bijna de helft van de X-gebonden mentale retardatie30, die ongeveer 1 bij 4.000 mannetjes en 1 in 8.000 vrouwtjes kan treffen. Nog belangrijker is dat bijna 1 op de 250 – 1000 vrouwtjes een premutatie dragen, en deze frequentie is 1 in 250 – 1600 bij mannetjes26,31,32,33. Omdat het risico van CGG herhaalde expansie naar volledige mutaties bij het overbrengen van premutatie allelen naar nakomelingen dramatisch verhekert, bijvoorbeeld van 4% wanneer de grootte van de moeder herhaling 55 – 59 tot 98% is wanneer de grootte 100 – 20014is, is de bepaling van het CGG Herhaal grootte in een breder bereik kan de diagnose van FXS en screening van premutatie dragers voor hun reproductieve planning vergemakkelijken. De PCR-gebaseerde methode die hier is geïntroduceerd, is nauwkeurig, snel en robuust om de herhalings sequenties in de 5 ' UTR van de FMR1 Promoter te versterken en het volledige spectrum van CGG herhalings nummers te kwantificeren op een microfluïdisch capillair elektroforese instrument, en kan dus Stimuleer de brede toepassing in moleculaire diagnostiek en screening van FXS en fragiele X-gerelateerde aandoeningen met minder turn-around tijd en investering in apparatuur. Het instrument van de bioanalyzer kan met vertrouwen worden gebruikt in lage tot matige doorvoer testinstellingen voor herhaalde grootte meting. De apparatuur is veel kleiner, minder kostbaar en eenvoudiger te onderhouden dan andere capillaire elektroforese-instrumenten, zoals ABI-capillaire genetische analyzers. Voor een hoge volume screening biedt het MultiDX-systeem met maximaal 384-sample model een uitgebreide flexibiliteit en doorvoer voor de tests.
De test omvat vier hoofdstappen: PCR-versterking van de herhalings sequenties in de 5 ' UTR van de FMR1 PROMOTER (PCR-opstelling en PCR-amplificatie duurt bijna 3,5 uur), zuivering van de PCR-producten (neemt bijna 1 uur in), fragment dimensionering op een microfluïdische capillaire elektroforese instrument (neemt bijna 1 h), en de interpretatie van het aantal CGG herhalingen met behulp van de analyse software door afleiden van de referentienormen met bekende herhalingen (neemt bijna 0,5 h). In totaal is de turn-around tijd van deze test ongeveer 6 uur. Voor optimale prestaties moeten DNA-monsters worden gezuiverd om putstorende interfererende stoffen zoals eiwitten en hoge zoutconcentraties te verwijderen. Bovendien is de aanbevolen hoeveelheid invoer-DNA 50 – 100 ng per 20 μL PCR-reactie. DNA-bedragen die groter zijn dan 150 ng per 20 μL van het PCR-systeem, hebben aangetoond dat het grote herhaalde allelen een slechte versterking krijgt. Bovendien wordt het sterk aanbevolen om ten minste twee referentiemonsters in te stellen met goed gekarakteriseerde herhalings grootten in elke PCR-run voor gelijktijdige analyse van herhalings getallen als kwaliteitscontrole en daaropvolgende geautomatiseerde fragment dimensionering in de analyse software 29. normaalgesproken moet de R2 -waarde van de lineaire regressie kromme die is afgeleid van de referentiemonsters groter zijn dan 0,98. Bovendien moeten de PCR-producten worden gezuiverd vóór microfluïdische capillaire elektroforese om de detectie-efficiëntie te verbeteren. Aangezien de PCR-primer is gelabeld met FAM fluorescentie29, kan fragment dimensionering met een geschikt elektroforese systeem (bv., bioanalyzer en het multidx-systeem) direct worden uitgevoerd zonder extra labeling.
Een verscheidenheid van methodologieën voor de diagnose en studie van FXS en aanverwante aandoeningen zijn uitgebreid beoordeeld door Bruce E. Hayward et al., met inbegrip van DNA-gebaseerde assays en FMRP eiwit assays34. Zoals in de meeste gevallen is de moleculaire basis van FXS dynamische mutatie die wordt gekenmerkt door een uitbreiding CGG REPEAT in de Promoter regio van FMRP1 Gene, Southern blotting en amplificatie assays met behulp van GENOMISCH DNA zijn de meest gebruikte assays voor bepaling van het herhalingsnummer. Het is bekend dat PCR-gebaseerde assays overwogen de zuidelijke blotting in kosteneffectiviteit en minimale DNA-bedrag eis. De versterking van de CGG-REPEAT is echter een belangrijke uitdaging, omdat een hoog GC-gehalte de efficiëntie kan beïnvloeden, en er is veel inspanning geleverd voor de optimalisatie van het PCR-systeem in de jaren34. De fragiele X PCR-Kit is geoptimaliseerd voor nauwkeurige versterking van de gehele CGG trinucleotide-herhalingen, en een valideringsonderzoek naar de prestaties van deze PCR-gebaseerde methode is eerder gerapporteerd door onze groep29. Een soortgelijke PCR-gebaseerde methode werd gerapporteerd door Mailick Seltzer et al. in 201235, maar het instrument Abi 3730xl werd gebruikt voor de bepaling van de herhaalde grootte en alleen personen met een herhalings grootte van minder dan 200 werden geïdentificeerd. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat hun gekozen platform was niet in staat om de grotere herhalingen met REPEAT grootte boven te detecteren 200. Daarentegen biedt het bioanalyseinstrument dat we gebruiken een robuustere fragment dimensionerings test, omdat het het volledige spectrum van de FMR1 CGG Repeat, inclusief volledige mutaties29, nauwkeurig en kosteneffectief kan detecteren.
Behalve herhalingsnummer, moeten ook verschillende andere factoren worden vastgesteld voor een adequate diagnose van FXS-en FXS-gerelateerde aandoeningen, waaronder FMR1-mutatie, de omvang van methylatie en mosaicisme34. De methylatiestatus kan worden bewaakt door verschillende methoden zoals het opnemen van pre-verterings stappen met behulp van methylatiegevoelig restrictie enzym of natriumbisulfiet modificatie test34, maar onze test is niet in staat om de methylatiestatus van de 5 ' UTR van de FMR1 promotor. Daarnaast is het uitbreidings risico van een FMR1 allel ook afhankelijk van de aanwezigheid van AGG-onderbrekingen, die het gen tijdens de overdracht kunnen stabiliseren. PCR-gebaseerde herhaalde tests zijn aangepast om AGG-onderbrekingen te detecteren, terwijl de verterings enzym instabiliteit een van de belangrijkste beperkingen is. Triplet-primed (TP) PCR met behulp van een hybride PCR-primer binding in CGG-herhalingen of AGG-onderbrekingen is een ander type PCR-assay dat CGG-herhalings grootte en AGG-onderbrekingen tegelijkertijd kan detecteren. De FMR1 gen-specifieke PCR-methode die we hebben beschreven, is echter niet in staat de AGG-onderbrekingen te identificeren, tenzij FMR1 gensequencing na de versterking wordt uitgevoerd. Onlangs, Hayward et al. rapporteerde de PCR-methoden die in hun eigen laboratorium werden gebruikt voor het bepalen van alle parameters die nodig zijn voor een volledig genetisch werk of grondig laboratoriumonderzoek, inclusief assays die herhalingsnummer, AGG-onderbrekings status kunnen detecteren en methylatiestatus36. Helaas is geen enkele bepaling in staat om al deze factoren tot op heden uitvoerig te bepalen.
Het is vermeldenswaard dat de assay niet in staat is om verwijderingen of single-nucleotide varianten in het FMR1 gen op te sporen, wat goed is voor ongeveer 1% van de FXS gevallen27. Zelden, bij personen die cellulaire mosaicism voor de FMR1 herhalen, PCR kan een vals negatief resultaat geven vanwege falen bij het opsporen van mosaicisme voor grotere premutatie en volledige mutatie allelen37,38. Aangetoond is dat de drempel van deze PCR-gebaseerde test voor Mosaic Full-mutatie mannelijk monster (341 herhalingen) 2,5% is wanneer de piekdetector drempel is ingesteld op drie fluorescentie-eenheden boven Baseline29. Southern blot analyse wordt aanbevolen in de gevallen als mozaïek allelen zijn geïndiceerd. Bovendien heeft de vorige studie met betrekking tot de elektroforese platformen aangegeven dat in vergelijking met capillaire elektroforese systemen (bijv. ABI 3130XL-instrument), het bioanalyseinstrument niet in staat is de normale homozygoot te differentiëren vrouwelijke monsters met een individueel fragment pieken van vrouwelijke monsters met heterozygoot herhalings grootten met herhaalde aantal verschillen van vier of minder29. Deze single-Peak samples kunnen echter worden geclassificeerd als normaal, omdat is gevalideerd dat deze PCR-gebaseerde pijpleiding robuuste versterking en detectie van volledige mutatie of premutatie allelen mogelijk maakt, waardoor de kans op vals negatief in deze situatie. Ongeacht de bovenstaande beperkingen, de methode kan worden gebruikt als een eerste laag pijplijn voor moleculaire identificatie van FXS en fragiele X-geassocieerde ziekten met kosteneffectiviteit, robuustheid en snelle rapportage tijd, aangevuld met sequencing van de FMR1 gen en Southern blot analyse van methylatieanalyse niveaus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van het NSFC Emergency Management project (Grant No. 81741004), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), het belangrijkste onderzoeksplan van de provinciale wetenschap en technologiestichting van Guangxi ( Grant No. AB16380219), de China postdoctoral Science Foundation subsidie (Grant No. 2018M630993), en de Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
| Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
| Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
| Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
References
- Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
- Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
- Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
- Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
- Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
- Ascano, M. Jr, et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
- Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
- Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
- Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
- Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
- Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
- Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
- Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
- Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
- Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
- Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
- Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
- Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
- Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
- Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
- Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
- Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
- Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
- Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
- Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
- Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
- Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
- Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
- Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
- Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
- Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
- Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
- Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
- Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
- Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
- Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
- Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
- Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).
