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Genetics

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59963
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 2, 2,3, 2,3, 2, 5, 5, 6,7, 2,3
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

Un test précis et robuste basé sur la réaction en chaîne de polymérase pour quantifier les répétitions de trinucleotide cytosine-guanine-guanine dans le gène fragile x de retardmental-1 facilite le diagnostic moléculaire et le criblage du syndrome de LX fragile et du X fragile-connexe avec un délai d'attente plus court et des investissements dans l'équipement.

Abstract

Le syndrome de X fragile (FXS) et les désordres associés sont provoqués par l'expansion du cytosine-guanine-guanine (CGG) répétition de trinucleotide dans la région non traduite de 5' (UTR) du retardement mental fragile x-1 (FMR1) promoteur de gène. Traditionnellement, l'analyse de fragment d'électrophoresis capillaire sur un analyseur génétique est utilisée pour le dimensionnement des répétitions CGG de FMR1, mais une analyse supplémentaire de tache méridionale est nécessaire pour la mesure exacte lorsque le nombre de répétition est supérieur à 200. Ici, nous présentons une méthode précise et robuste de réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour quantifier les répétitions de CGG de FMR1. La première étape de ce test est l'amplification PCR des séquences répétitifs dans le 5'UTR du promoteur FMR1 à l'aide d'un kit Fragile X PCR, suivie de la purification des produits PCR et du dimensionnement par fragment sur un instrument d'électrophorèse capillaire microfluidique, et l'interprétation ultérieure du nombre de répétitions cGG en faisant référence à des normes avec des répétitions connues à l'aide du logiciel d'analyse. Cet analyse à base de PCR est reproductible et capable d'identifier toute la gamme des répétitions CGG des promoteurs FMR1, y compris ceux avec un nombre répété de plus de 200 (classés comme mutation complète), 55 à 200 (prémutation), 46 à 54 (intermédiaire), et 10 à 45 (normal). Il s'agit d'une méthode rentable qui facilite la classification des troubles associés au FXS et à l'X fragile avec robustesse et temps de déclaration rapide.

Introduction

Le syndrome de L'X fragile (FXS) et les troubles associés à l'X fragile, par exemple, le syndrome des tremblements et de l'ataxie (FX-TAS) et l'insuffisance ovarienne primaire (FX-POI) sont principalement causés par l'expansion du trinuccléotide cytosine-guanine-guanine (CGG) dans le 5' non traduit région (UTR) du fragile X mental retardation-1 (FMR1) gène sur Xq27.31,2. La protéine codée FMR1 (FMRP) est une protéine liant l'ARN associée au polyribosome qui fonctionne dans le développement neuronal et la plasticité synaptique en régulant l'épissage alternatif, la stabilité, et le transport dendritique de l'ARNm ou la synthèse modulatrice des protéines postsynaptiques partielles3,4,5,6,7.

La variation dynamique avec une taille de répétition CGG de 'gt;200 est décrite comme mutation complète, qui induit l'hyperméthylation aberrante et le silençage transcriptionnel suivant du promoteur FMR1 8. L'absence ou l'absence résultante de la protéine FMRP perturbe le développement neuronal normal et cause FXS9, caractérisé par divers symptômes cliniques, y compris une déficience intellectuelle modérée à sévère, retard de développement, comportements hyperactifs, contacts pauvres et manifestations autistiques10,11,12. La présentation dans les patients féminins de FXS est généralement plus douce que cela chez les mâles. La taille de répétition de CGG s'étendant de 55 à 200 et 45 à 54 sont classifiées comme prémutation et statut intermédiaire, respectivement. En raison du degré élevé d'instabilité, la taille de répétition de CGG dans un allèle de prémutation ou intermédiaire se développe vraisemblablement une fois transmise des parents à la progéniture13,14. Ainsi, les porteurs avec des allèles de prémutation sont à haut risque d'avoir des enfants affectés avec FXS en raison de l'expansion répétée, et dans certains cas, les allèles intermédiaires peuvent augmenter leur taille de répétition à la gamme complète de mutation sur deux générations15, 16. En outre, les mâles avec la prémutation transmettent également le risque accru de développer le FX-TAS de tard-de-démarrage17,18,19, tandis que les femelles de prémutation sont prédisposées pour FX-TAS et FX-POI20, 21,22. Récemment, il a été rapporté que les désordres de spectre autistique avec le retard développemental et les problèmes dans les comportements sociaux sont présentés chez les enfants avec des alleles fMR1 de prémutation23,24.

Pour déterminer la taille exacte de répétition de CGG est d'une grande importance pour la classification et la prévision des désordres FXS et X-associés fragiles25,26. Historiquement, la réaction en chaîne de polymérase (PCR) spécifique à la région de CGG avec le dimensionnement de fragment plus l'analyse méridionale de tache ont été l'étalon-or pour le profilage moléculaire de la répétition de FMR1 CGG27. Cependant, pcR spécifique traditionnel est moins sensible aux grandes prémutations avec plus de 100 à 130 répétitions et est incapable d'amplifier les mutations complètes27,28. En outre, l'électrophoresis capillaire sur un analyseur génétique traditionnel pour le dimensionnement répété ne détecte pas les produits FMR1 PCR avec plus de 200 répétitions CGG. L'analyse de tache méridionale permet la différenciation d'une plus large gamme de taille de répétition, des nombres normaux aux nombres complets de répétition de mutation, et a été employée couramment pour confirmer des mutations complètes (chez les mâles) et différencier des allèles hétérozygotes avec une mutation complète de apparemment homozygous alleles avec des tailles normales de répétition (chez les femelles). Cependant, la résolution pour quantifier les répétitions est limitée. Plus important encore, cette stratégie de test étape par étape est laborieuse, longue et inefficace sur le plan des coûts.

Ici, nous présentons une méthode précise et robuste basée sur PCR pour quantifier les répétitions CGG de FMR1. La première étape de ce test est l'amplification PCR des séquences répétées dans le 5'UTR du promoteur FMR1 à l'aide du kit Fragile X PCR. Les produits PCR sont purifiés et le dimensionnement des fragments est effectué sur un instrument d'électrophorèse capillaire microfluidique, et l'interprétation ultérieure du nombre de répétitions CGG à l'aide du logiciel d'analyse en faisant référence à des normes avec des répétitions connues basées sur le justification que la longueur du fragment de PCR est directement proportionnelle au nombre de répétitions CGG. Le système PCR comprend des réactifs qui facilitent l'amplification de la région de répétition du trinucleotide très riche en GC. Cet analyse à base de PCR est reproductible et capable d'identifier toutes les gammes de répétitions CGG des promoteurs FMR1. Il s'agit d'une méthode rentable qui peut trouver une large application dans le diagnostic moléculaire et le dépistage des maladies et des troubles liés à l'X fragile avec moins de temps de contournement et d'investissement dans l'équipement et, par conséquent, peut être utilisé dans un plus large éventail de cliniques Laboratoires.

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Protocol

L'approbation éthique a été accordée par le Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee (Numéro de référence: 2013.055)

1. Amplification de PCR

  1. Avant de commencer, retirez le mélange tampon PCR, les échantillons de diluant et d'ADN (ADN de test et d'ADN de référence) (voir le tableau des matériaux)du congélateur de -20 oC et gardez-les à température ambiante pendant 20 à 30 min pour s'assurer que tous les réactifs et l'ADN sont complètement décongelés. Vortex et tourner brièvement vers le bas avant utilisation.
  2. Mesurer la concentration des échantillons d'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux). La concentration d'ADN doit être de 25 ng/L; diluer avec le diluant d'échantillon à la concentration appropriée si nécessaire.
    REMARQUE: L'ADN doit être extrait et purifié pour éliminer les substances interférantes, telles que les protéines et les fortes concentrations de sel. L'ADN non dégradé et de haute qualité devrait être utilisé pour l'amplification et l'analyse ultérieures de PCR (A260/A280 : 1.8-2.0 et A260/A230 : '1.0).
  3. Étiqueter les puits d'une plaque PCR ou de tubes PCR de 0,2 ml pour identifier les échantillons d'ADN de référence et testés.
  4. Calculer le nombre de réactions DE PCR requises pour les échantillons d'essai, 2 échantillons de référence et l'échantillon de contrôle négatif. Préparer pcR Master Mix en ajoutant 15 l de mélange tampon PCR, 2,6 l de diluant d'échantillon et 0,4 L de polymérase pour chaque réaction.
    REMARQUE: Un contrôle négatif à l'aide d'un diluant d'échantillon est essentiel pour surveiller les performances du PCR. Préparer le mélange PCR maître à température ambiante, ne PAS pipette sur la glace. Le mélange de mémoire tampon PCR est visqueux. Mélanger le tube, puis tourner brièvement vers le bas avant l'utilisation.
  5. Vortex le mélange PCR maître de l'étape 1.4 pour 10-20 s et spin vers le bas. Distribuer lentement 18 l de mélange dans chaque puits ou tube.
  6. Vortex et faire tourner les échantillons d'ADN. Pipette 2 'L de chaque ADN dans le puits ou le tube approprié pour un volume final de PCR de 20 L. Mélanger par pipetting de haut en bas 5 fois.
    REMARQUE: La quantité totale d'ADN par réaction doit être de 50 à 100 ng. Les quantités d'ADN supérieures à 150 ng par réaction PCR de 20 L peuvent entraîner une mauvaise amplification des grands allèles répétitifs. Pour les ADN moins concentrés, la quantité de diluant d'échantillon dans le mix principal PCR peut être remplacée par une solution d'ADN.
  7. Scellez la plaque avec un scellant adhésif ou des bouchons tubulaires.
  8. Placez la plaque ou les tubes PCR scellés dans le cycleur thermique avec le couvercle chauffé. Exécuter le programme avec les réglages suivants : 95 oC pendant 5 min, suivi de 25 cycles de dénaturation à 98 oC pour 35 s, d'annealing à 59 oC pour 35 s et d'extension à 72 oC pendant 4 min; une dernière étape à 72 oC pendant 10 min. Maintenir les produits PCR à 4 oC dans le cycler jusqu'à ce qu'ils soient enlevés pour un traitement ultérieur.
  9. Après l'amplification du PCR, purifie et analysez immédiatement les produits, ou entreposez-les à 2 à 8 oC pendant la nuit. Alternativement, le produit peut être stocké jusqu'à 30 jours à -30 à -16 oC.

2. Purification des produits PCR

  1. Préchauffer le shaker de l'incubateur à 65 oC.
  2. Pour chaque réaction PCR, ajoutez 80 L de tampon 1x TE (voir le Tableau des Matériaux) aux 20 L de chaque produit PCR de la section 1.
  3. Transférer le mélange d'échantillons dans une plaque de nettoyage PCR (voir Tableau des matériaux) à l'aide d'une pipette multicanal.
  4. Gardez la plaque à découvert et placez-la dans le shaker de l'incubateur, et incubez-la à 65 oC tout en secouant à 1 200 tr/min pendant 10 min.
  5. Après l'incubation, mettre l'instrument à vide à 250 mbar (ou 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 po hg) et aspirer la solution à travers le filtre pendant 15 min. Wells ne devrait plus avoir de liquide.
  6. Refroidir le shaker de l'incubateur jusqu'à 25 oC.
  7. Après la première aspiration, éteignez le vide et ajoutez 50 L de tampon 1x TE à chaque puits. Ne pas mélanger. Aspirez la solution pendant 10 min en utilisant les réglages du vide à l'étape 2.5.
  8. Séchez le fond de la plaque de filtre en la pressant fermement sur une pile de serviettes en papier.
  9. Ajouter 20 l de tampon 1x TE dans le centre inférieur de chaque puits. Placer la plaque dans le shaker de l'incubateur et couver à 25 oC tout en secouant à 1 200 tr/min pendant 5 min.
  10. Après l'incubation, transférer l'ADN PCR purifié de l'étape 2.9 à une plaque PCR fraîche de 96 puits. L'ADN purifié peut être analysé directement, ou alternativement peut être stocké à -30 à -16 oC jusqu'à ce que nécessaire.

3. Fragment de dimensionnement des produits PCR

  1. Avant de commencer, laissez le concentré de teinture d'ADN, la matrice de gel d'ADN, le marqueur d'ADN, l'échelle d'ADN et les échantillons d'ADN purifiés de l'étape 2 à l'équilibre à la température ambiante pendant 30 min.
  2. Installez la station d'amorçage.
    1. Remplacer la seringue (voir Tableau des matériaux)lors de l'utilisation d'un nouveau lot de réactifs.
    2. Ajustez la plaque de base, relâchez le levier de l'agrafe de seringue et faites-la glisser jusqu'à la position supérieure.
  3. Démarrer le logiciel de dimensionnement (voir Tableau des matériaux) et préparer le mélange gel-teinture.
  4. Concentré de colorant Vortex pendant 10 s et spin vers le bas. Ajouter 25 l l de la teinture dans un flacon de matrice de gel. Vortex la solution mixte bien et spin vers le bas.
    1. Transférer le mélange gel-teint dans un filtre à spin. Placer le filtre de spin dans un microcentrifugeet et tourner pendant 10 min à température ambiante à 1 500 x g et 20 %.
      REMARQUE: Protégez la solution avec du colorant de la lumière et entreposez-le à 4 oC après utilisation. Le mélange gel-teinture peut être utilisé pour environ 15 croustilles une fois préparé. Laisser le mélange gel-teint raccorder à la température ambiante pendant 30 minutes à chaque fois avant l'utilisation.
  5. Chargez le mélange gel-teinture.
    1. Insérez une nouvelle puce d'ADN sur la station d'amorçage. Ajouter 9 ll de mélange gel-teinture dans le bien marqué avec "G". S'il vous plaît assurez-vous que le piston est positionné à la marque 1 mL, puis fermer la station d'amorçage.
    2. Appuyez sur le piston de seringue vers le bas jusqu'à ce qu'il soit tenu par le clip. Attendez exactement 30 s puis relâchez le clip. Attendez 5 s, puis tirez lentement le piston vers la position de 1 ml.
    3. Ouvrez la station d'amorçage et ajoutez 9 l de mélange gel-teinture dans les puits marqués de « G ».
  6. Ajouter 5 ll de marqueur dans le puits marqué avec le symbole de l'échelle et ajouter 5 ll de marqueur dans chacun des 12 puits d'échantillon. Ne laissez pas les puits vides.
  7. Ajouter 1 l l d'échelle d'ADN dans le puits marqué avec le symbole de l'échelle. Ajouter 1 l de produit PCR (puits usagés) à partir de l'étape 3.1 ou 1 L d'eau ultrapure (puits inutilisés) dans chacun des 12 puits d'échantillonnage. Placez la puce horizontalement dans l'adaptateur du mélangeur à vortex et vortex pendant 1 min au réglage indiqué (2 400 tr/min).
  8. Insérez la puce dans l'instrument de bioanalyseur et exécutez la puce dans l'instrument dans un délai de 5 minutes.
  9. Une fois l'extrait terminé, retirez immédiatement la puce utilisée de l'instrument.
  10. Ajoutez lentement 350 l'eau déionisée dans l'un des puits du nettoyant pour électrodes. Ouvrez le couvercle du bioanalyseur et placez le nettoyant d'électrode dedans. Fermer le couvercle et couver pendant environ 10 s. Ouvrez le couvercle et retirez le nettoyant pour électrodes. Attendez encore 10 s pour permettre à l'eau sur les électrodes de s'évaporer, puis fermez le couvercle.

4. Analyser les résultats de dimensionnement des fragments

REMARQUE: Les échantillons de référence doivent être amplifiés et analysés par le même cycleur thermique et bioanalyseur dans le même lot avec les échantillons inconnus.

  1. Une fois l'exécution de bioanalyseur terminée, exportez les données de pointe de chaque exécution comme fichier de table .csv pour l'analyse ultérieure.
  2. Démarrez le logiciel d'analyse et ouvrez le fichier de table de pointe exporté .csv à partir de l'étape 4.1.
  3. À travers l'onglet menu QC, passez en revue la ligne de régression adaptée aux quatre points (indiqués comme diamants bleus sur la parcelle) à partir des deux échantillons de référence. La valeur R2 de la ligne de régression doit être de 0,98 (les valeurs typiques dépassent 0,999).
  4. À travers l'onglet Menu Résultats, vérifiez la taille répétée de chaque échantillon dont la longueur du fragment est automatiquement tracée par rapport à la courbe standard de régression linéaire dérivée des échantillons de référence. Le logiciel fournit également la classification de chaque échantillon selon des directives différentes.
  5. Grâce à l'onglet Menu Exportation, exportez le rapport de résultat pour chaque échantillon avec les numéros de répétition et la classification diagnostique, ainsi qu'un résumé de l'information de l'échantillon et le rapport QC pour chaque exécution.
    REMARQUE: Le logiciel d'analyse permet l'utilisation de lignes directrices de classification personnalisées, telles que l'American College of Medical Genetics (ACMG) ou la Clinical Molecular Genetics Society/European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG), ainsi que des classifications prédéfinies critères.

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Representative Results

Les résultats de dimensionnement de l'échantillon de référence féminin de prémutation (NA20240, tailles de répétition de 30 et 80) et de l'échantillon de référence féminin de mutation complète (NA20239, tailles de répétition de 20 et 200) sont indiqués dans la figure 1A et la figure 1B,respectivement. En règle générale, deux pics de marqueurs (marqueur inférieur 50 paires de base [bp] et marqueur supérieur 10 380 pb) sont inclus dans le profil de taille du fragment. Il y a habituellement un pic complexe d'apprêt avec une taille de presque 95 bp. Grâce à l'échantillon de référence, une courbe standard de régression linéaire à quatre points peut être construite, comme le montre la figure 1C.

Les caractéristiques de taille représentative des échantillons cliniques normaux, intermédiaires, de prémutation et de mutation complète sont indiquées dans la figure 2A-D. En particulier, les mutations complètes de mosaïque avec deux pics étendus de fragment et un pic normal sont présentées dans la figure 2E. Dans certains cas féminins, un seul pic est affiché dans les résultats de l'électrophoresis microfluidique, comme le montre la figure 2F. Cela peut s'expliquer par la présentation d'allèles homozygous normaux (avec les mêmes numéros de répétition CGG dans les deux allèles) dans ces cas ou l'incapacité de différencier les allèles hétérozygotes qui ont des différences de nombre de répétition de quatre ou moins29. Cependant, ces résultats à pic unique pourraient être classés comme normaux, car il a été validé que le pipeline basé sur PCR permet une amplification robuste et la détection des allèles de mutation ou de prémutation complète, ce qui minimise la possibilité de faux négatifs dans cette situation. Un type de situation sous-optimale est le biais de base, comme le montre la figure 2G, qui pourrait produire des résultats ambigus ou ininterprétables dans certains cas. Une telle condition est soupçonnée d'être causée par un problème d'instrument. Les tailles de fragments mesurées d'échantillons inconnus sont tracées en fonction de la courbe standard de régression linéaire dérivée des échantillons de référence pour calculer automatiquement les tailles de répétition à l'aide du logiciel d'analyse, tel qu'indiqué dans la figure 2H. Les tailles de fragments inférieures à 200 répétitions sont interpolées dans la courbe standard de régression linéaire, tandis que les plus grandes tailles d'allèle à pleine mutation sont mesurées en extrapolant le long de la même ligne standard. Le logiciel affiche également la classification de chaque échantillon selon des directives différentes.

Figure 1
Figure 1 : Les résultats de dimensionnement des échantillons de référence féminins et la courbe de régression linéaire correspondante. (A, B) montrent les caractéristiques de taille de l'échantillon de référence féminin de prémutation (NA20240, tailles de répétition de 30 et 80) et de l'échantillon de référence femelle de mutation complète (NA20239, tailles de répétition de 20 et 200), respectivement. Deux marqueurs (marqueur inférieur, 50 pb et marqueur supérieur 10380 pb) sont inclus dans le résultat de l'électrophorèse pour chaque échantillon. Le pic d'une taille de près de 95 pb indique un complexe d'amorce. Les flèches noires indiquent la taille maximale du complexe d'apprêt, et les flèches bleues représentent la longueur du fragment de l'échantillon de référence. (C) La courbe standard de régression linéaire avec quatre points (diamants bleus) des deux échantillons de référence est construite dans le logiciel d'analyse. Les axes horizontaux et verticaux montrent les nombres de répétitions CGG calculés et la longueur mesurée du fragment en électrophorèse microfluidique. La valeur R2 de la régression était de 0,99967. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs d'échantillons cliniques ayant une taille de répétition CGG différente. (A-E) montrent les caractéristiques de taille représentative par bioanalyseur dans l'ordre normal (avec des longueurs de fragment de 328 bp et 353 bp, correspondant aux nombres répétés de 28 et 36), intermédiaires (avec des longueurs de fragment de 335 bp et 390 bp, correspondant à la nombres répétés de 30 et 49), prémutation (avec des longueurs de fragment de 332 bp et 439 bp, correspondant aux nombres répétés de 29 et 65), mutation complète (avec des longueurs de fragment de 337 bp et 1911bp, correspondant aux nombres répétés de 31 et 545) et mosaïque complète mutations (avec des longueurs de fragment de 349 bp, 1201 bp et 2688 bp, correspondant aux nombres répétés de 33, 294 et 751) échantillons. (F) présente un résultat d'électrophoresis microfluidique à pic unique (avec une longueur de fragment de 334 pb, correspondant au nombre répété de 30) d'une femelle qui a probablement des allèles homozygotes (avec les mêmes numéros de répétition CGG dans les deux allèles) ou allèles hétérozygotes (avec les différences de nombre de répétition cGG de quatre ou moins). (G) montre un type de situation sous-optimale qui est le biais de base. Les flèches noires indiquent la taille maximale du complexe d'apprêt, et les flèches rouges représentent la longueur du fragment de l'échantillon. (H) affiche l'interface de résultat principal du logiciel d'analyse. Les tailles de fragments mesurées d'échantillons inconnus sont tracées en fonction de la courbe standard de régression linéaire pour calculer automatiquement les tailles de répétition. L'allèle normal de l'échantillon féminin de la mosaïque pleine mutation montré dans (E) est cartographié à la courbe standard au coin inférieur gauche de la région de l'axe de coordination (tracé en vert), et les allèles plus grands pleine mutation (tracés en rouge) extrapolés au-delà de la quatre points standard (diamants bleus sur la courbe). Les sections tabulaires de la moitié inférieure de la figure présentent les tailles de fragments et la classification diagnostique correspondante selon les limites de la ligne directrice ACMG choisies. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

FXS est la deuxième cause la plus fréquente de déficience intellectuelle après la trisomie 21, représentant près de la moitié du retard mental lié à l'X30, qui peut affecter environ 1 homme sur 4 000 et 1 femme sur 8 000. Plus important encore, près d'une femme sur 250 à 1 000 porte une prémutation, et cette fréquence est de 1 sur 250 à 1 600 chez les hommes26,31,32,33. Étant donné que le risque de répétition de CGG à des mutations complètes lors de la transmission des allèles de prémutation à la progéniture augmente considérablement, par exemple, de 4% lorsque la taille de répétition maternelle est de 55-59 à 98% lorsque la taille est de 100 à 20014, la détermination de la CGG la taille de répétition à une gamme plus large pourrait faciliter le diagnostic de FXS et le criblage des porteurs de prémutation pour leur planification reproductrice. La méthode basée sur PCR introduite ici est précise, rapide et robuste pour amplifier les séquences de répétition dans le 5'UTR du promoteur FMR1 et quantifier le spectre complet des nombres de répétition cGG sur un instrument d'électrophorèse capillaire microfluidique, et peut donc augmenter son application large dans le diagnostic moléculaire et le dépistage des désordres FXS et Fragile X-connexes avec moins de temps de turn-around et d'investissement dans l'équipement. L'instrument de bioanalyse peut être utilisé en toute confiance dans les paramètres de test de débit faible à modéré pour la mesure de la taille répétée. L'équipement est beaucoup plus petit, moins coûteux et plus simple à entretenir que d'autres instruments d'électrophorèse capillaire, tels que les analyseurs génétiques capillaires ABI. Pour le criblage à volume élevé, le système MultiDX contenant jusqu'à 384 échantillons offre une grande flexibilité et un débit pour les tests.

L'analyse comprend quatre étapes principales : amplification PCR des séquences répétées dans le 5'UTR du promoteur FMR1 (mise en place pcR et amplification PCR prend près de 3,5 h), purification des produits PCR (prend près de 1 h), fragmentation du dimensionnement sur un microfluidique instrument d'électrophorèse capillaire (prend près de 1 h), et l'interprétation du nombre de répétitions CGG à l'aide du logiciel d'analyse en inférant des normes de référence avec des répétitions connues (prend près de 0,5 h). Au total, le délai d'incetour de cet arrêt est d'environ 6 h. Pour une performance optimale, les échantillons d'ADN devraient être purifiés pour éliminer les substances interférant esputatives telles que les protéines et les concentrations élevées de sel. En outre, la quantité recommandée d'ADN d'entrée est de 50 à 100 ng par 20 OL de réaction PCR. Des quantités d'ADN supérieures à 150 ng par 20 L du système PCR ont été montrées pour avoir comme conséquence l'amplification pauvre des grands allèles de répétition. En outre, il est fortement recommandé de mettre en place au moins deux échantillons de référence avec des tailles de répétition bien caractérisées dans chaque PCR exécuter pour l'analyse simultanée des nombres de répétition comme contrôle de la qualité et le dimensionnement automatisé ultérieur des fragments dans le logiciel d'analyse 29. En règle générale, la valeur R2 de la courbe de régression linéaire dérivée des échantillons de référence devrait être supérieure à 0,98. En outre, les produits PCR devraient être purifiés avant électrophoresis capillaire microfluidique pour améliorer l'efficacité de détection. Comme l'amorce PCR est étiquetée avec la fluorescence FAM29, le dimensionnement des fragments avec un système d'électrophorèse approprié (p. ex., bioanalyseur et système MultiDX) peut être effectué directement sans étiquetage supplémentaire.

Une variété de méthodologies pour le diagnostic et l'étude de FXS et des désordres connexes ont été examinés de manière exhaustive par Bruce E. Hayward et autres, y compris des essais basés sur l'ADN et des essais de protéine de FMRP34. Comme dans la plupart des cas, la base moléculaire de FXS est une mutation dynamique caractérisée par une répétition CGG d'expansion dans la région promoteur du gène FMRP1, les essais basés sur le ballonnement et l'amplification du Sud en utilisant l'ADN génomique sont les essais les plus couramment utilisés pour détermination du nombre de répétitions. Il est bien connu que les essais basés sur PCR surpèsent le ballonnement du Sud dans la rentabilité et l'exigence minimale de quantité d'ADN. Cependant, l'amplification de la répétition CGG est un défi principal puisque la teneur élevée de GC peut affecter l'efficacité, et beaucoup d'efforts ont été faits pour l'optimisation du système de PCR au cours des années34. Le fragile kit X PCR a été optimisé pour une amplification précise de l'ensemble des répétitions de trinucleotide CGG, et une étude de validation sur les performances de cette méthode basée sur PCR a déjà été rapportée par notre groupe29. Une méthode similaire basée sur le PCR a été rapportée par Mailick Seltzer et coll. en 201235, mais l'instrument ABI 3730xl a été utilisé pour la détermination de la taille répétée et seules les personnes dont la taille de répétition est inférieure à 200 ont été identifiées. Cela peut être dû au fait que leur plate-forme choisie n'a pas été en mesure de détecter les répétitions plus grandes avec la taille de répétition au-dessus de 200. En revanche, l'instrument bioanalyseur que nous utilisons offre un analyse de dimensionnement de fragment plus robuste, car il peut détecter avec précision et de manière rentable le spectre complet de la répétition FMR1 CGG, y compris les mutations complètes29.

À l'exception du nombre de répétitions, plusieurs autres facteurs doivent également être déterminés pour un diagnostic approprié des troubles liés au FXS et au FXS, y compris la mutation FMR1, l'étendue de la méthylation et le mosaïsme34. Le statut de méthylation peut être surveillé par diverses méthodes telles que l'incorporation des étapes de pré-digestion utilisant l'enzyme de restriction méthylation-sensible ou l'essai de modification de bisulfite34,cependant, notre essai est incapable de déterminer le l'état de méthylation du 5'UTR du promoteur FMR1. En outre, le risque d'expansion d'un allèle FMR1 dépend également de la présence d'interruptions d'AGG, qui peuvent stabiliser le gène pendant la transmission. Les essais répétés à base de PCR ont été modifiés pour détecter les interruptions d'AGG tandis que l'instabilité d'enzyme de digestion est l'une des limitations principales. Triplet-primed (TP) PCR en utilisant une liaison hybride PCR amorce dans les répétitions CGG ou interruptions AGG est un autre type d'analyse PCR qui peut détecter la taille de répétition CGG et les interruptions AGG simultanément. Cependant, la méthode DE PCR spécifique au gène FMR1 que nous avons décrite est incapable d'identifier les interruptions d'AGG à moins que le séquençage du gène FMR1 après l'amplification soit effectué. Récemment, Hayward et coll. ont signalé les méthodes de PCR utilisées dans leur propre laboratoire pour déterminer tous les paramètres nécessaires à une analyse génétique complète ou à une étude de laboratoire approfondie, y compris des essais qui peuvent détecter le nombre de répétitions, l'état d'interruption de l'AGG et statut de méthylation36. Malheureusement, ni l'un ni l'autre n'est capable de déterminer de manière exhaustive tous ces facteurs à ce jour.

Il est à noter que l'analyse est incapable de détecter les suppressions ou les variantes à nucléotide unique dans le gène FMR1, qui représente environ 1% des cas FXS27. Rarement, dans les individus qui ont le mosaicism cellulaire pour la répétition de FMR1, PCR peut donner un résultat négatif faux en raison de l'échec en détectant le mosaicism pour de plus grandes prémutations et allèles de pleine-mutation37,38. Il a été démontré que le seuil de cet analyse à base de PCR pour l'échantillon mâle à mutation complète de la mosaïque (341 répétitions) est de 2,5 % lorsque le seuil de détecteur de pointe est fixé à trois unités de fluorescence au-dessus de la ligne de base29. L'analyse méridionale de tache est recommandée dans les cas si des allèles de mosaïque sont indiqués. En outre, en ce qui concerne les plates-formes d'électrophoresis, une étude précédente a indiqué que par rapport aux systèmes d'électrophoresis capillaires (par exemple, l'instrument ABI 3130XL), l'instrument de bioanalyseur est incapable de différencier les homozygous normaux des échantillons femelles avec des pics de fragment individuels à partir d'échantillons femelles avec des tailles de répétition hétérozygotes qui ont des différences de nombre de répétition de quatre ou moins29. Cependant, ces échantillons à pic unique pourraient être classés comme normaux, car il a été validé que ce pipeline basé sur PCR permet une amplification robuste et la détection des allèles de mutation ou de prémutation complète, ce qui minimise la possibilité de faux négatifs dans cette situation. Indépendamment des limitations ci-dessus, la méthode peut être utilisée comme un pipeline de premier niveau pour l'identification moléculaire des maladies associées à fxS et Fragile X avec rentabilité, robustesse et temps de déclaration rapide, complétée par le séquençage de la Gène FMR1 et analyse de tache méridionale des niveaux de méthylation.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette recherche a été appuyée par des subventions du NSFC Emergency Management Project (Grant no 81741004), de la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), du Plan de recherche majeur de la Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Subvention No. AB16380219), la China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) et la Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

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Génétique Numéro 151 Réaction en chaîne de polymère électrophoresis capillaire microfluidique répétitions cytosine-guanine-guanine trinucleotide fragile X retardement mental-1 promoteur syndrome x fragile mutation complète prémutation
A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene
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Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).

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