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Genetics

एक मजबूत पॉलिमरेज चेन रिएक्शन-आधारित परख के लिए क्वांटाइज़िंग साइटोसाइन-गुआनीन-गुआनीन ट्राइन्यूक्लिओटाइड नाजुक एक्स मानसिक सुधार-1 जीन में दोहराता है

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59963
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 2, 2,3, 2,3, 2, 5, 5, 6,7, 2,3
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

एक सटीक और मजबूत polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया आधारित परख cytosine-guanine-guanine trinucleotide नाजुक एक्स मानसिक मंदता में दोहराता है के लिए-1 जीन आणविक निदान और नाजुक एक्स सिंड्रोम और नाजुक एक्स से संबंधित की स्क्रीनिंग की सुविधा कम बारी के आसपास समय और उपकरणों में निवेश के साथ विकारों.

Abstract

नाजुक एक्स सिंड्रोम (FXS) और जुड़े विकारों साइटोसाइन-गुआनीन (सीजीजी) trinucleotide दोहराने के विस्तार के कारण कर रहे हैं 5' untranslated क्षेत्र (UTR) के नाजुक एक्स मानसिक मंदता-1(FMR1) जीन प्रमोटर. परंपरागत रूप से, एक आनुवंशिक विश्लेषक पर केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस टुकड़ा विश्लेषण FMR1के CGG दोहराता के आकार के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन अतिरिक्त दक्षिणी दाग विश्लेषण सटीक माप के लिए आवश्यक है जब दोहराने की संख्या 200 से अधिक है. यहाँ, हम FMR1के CGG दोहराता के परिमाणीकरण के लिए एक सटीक और मजबूत बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) आधारित विधि प्रस्तुत करते हैं। इस परीक्षण का पहला चरण एक नाजुक एक्स पीसीआर किट का उपयोग कर FMR1 प्रमोटर के 5'UTR में दोहराने दृश्यों की पीसीआर प्रवर्धन है, पीसीआर उत्पादों की शुद्धि और एक microfluidic केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस साधन पर आकार टुकड़ा द्वारा पीछा किया, और CGG की संख्या के बाद व्याख्या विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ज्ञात दोहराता के साथ मानकों को संदर्भित करके दोहराता है. इस पीसीआर आधारित परख reproduible और FMR1 प्रमोटरों की CGG दोहराता की पूरी श्रृंखला की पहचान करने में सक्षम है, 200 से अधिक की एक दोहराने की संख्या के साथ उन सहित (पूर्ण उत्परिवर्तन के रूप में वर्गीकृत), 55 से 200 (पूर्वागम), 46 से 54 (मध्यस्थ), और 10 करने के लिए 45 (सामान्य).। यह एक लागत प्रभावी तरीका है कि मजबूतता और तेजी से रिपोर्टिंग समय के साथ FXS और नाजुक एक्स संबद्ध विकारों के वर्गीकरण की सुविधा है.

Introduction

नाजुक एक्स सिंड्रोम (FXS) और नाजुक एक्स जुड़े विकारों, जैसे, कंपन और ataxia सिंड्रोम (FX-TAS), और प्राथमिक डिम्बग्रंथि कमी (FX-POI) मुख्य रूप से साइटोसाइन-गुआनीन -guanine (CGG) trinuctide दोहराने विस्तार के कारण कर रहे हैं 5' untranslated क्ष27.31,2पर नाजुक X मानसिक मंदन-1 (एफएमआर1) जीन का क्षेत्र (UTR ) . FMR1 एनकोडेड प्रोटीन (FMRP) एक polyribosome संबद्ध आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन है कि न्यूरॉन विकास और synaptic प्लास्टिक में कार्य करता है वैकल्पिक splicing को विनियमित करने के द्वारा, स्थिरता, और MRNA या नियमन संश्लेषण के डेन्ड्रिटिक परिवहन आंशिक पदों के प्रोटीन3,4,5,6,7.

के एक CGG दोहराने आकार के साथ गतिशील भिन्नता पूर्ण उत्परिवर्तन के रूप में वर्णित है, जो aberant hypermethylation और बाद में FMR1 प्रमोटर8के प्रतिलेखन silencing प्रेरित करता है. जिसके परिणामस्वरूप अनुपस्थिति या FMRP प्रोटीन की कमी सामान्य न्यूरॉन विकास को बाधित करती है और FXS9का कारण बनता है , विभिन्न नैदानिक लक्षणों की विशेषता, गंभीर बौद्धिक विकलांगता के लिए मध्यम सहित, विकास में देरी, अतिसक्रिय व्यवहार, खराब संपर्क और ऑटिस्टिकअभिव्यक्तियां 10,11,12. महिला FXS रोगियों में प्रस्तुति आम तौर पर पुरुषों में है कि तुलना में मामूली है. 55 से 200 और 45 से 54 तक के सीजीजी दोहराने के आकार को क्रमशः पूर्वपरिवर्तन और मध्यवर्ती स्थिति के रूप में वर्गीकृत किया गया है। अस्थिरता की उच्च डिग्री के कारण , सीजीजी एक premutation या मध्यवर्ती एलील में दोहराने आकार शायद फैलता है जब माता पिता से वंश13,14को प्रेषित . इस प्रकार, premutation alleles के साथ वाहक दोहराने के विस्तार की वजह से FXS के साथ प्रभावित बच्चों होने के उच्च जोखिम में हैं, और कुछ मामलों में, मध्यवर्ती alleles दो पीढ़ियों से अधिक पूर्ण उत्परिवर्तन रेंज के लिए अपने दोहराने के आकार का विस्तार कर सकते हैं15, 16. इसके अलावा, premutation के साथ पुरुषों को भी देर से शुरू FX-TAS17,18,19विकसित करने का खतरा बढ़ व्यक्त करते हैं, जबकि premutation महिलाओं दोनों FX-TAS और FX-POI20के लिए predisposed हैं, 21,22. हाल ही में, यह सूचित किया गया है कि विकासमेंषद विलंब और सामाजिक व्यवहार में समस्याओं के साथ ऑटिस्टिक स्पेक्ट्रम विकार बच्चों में पूर्व परिवर्तन FMR1 एलेस23,24के साथ प्रस्तुत किए जाते हैं .

सटीक सीजीजी दोहराने आकार निर्धारित करने के लिए FXS और नाजुक एक्स संबद्ध विकारों25,26के वर्गीकरण और भविष्यवाणी के लिए बहुत महत्व का है. ऐतिहासिक रूप से, सीजीजी दोहराने क्षेत्र-विशिष्ट polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) टुकड़ा आकार के साथ साथ दक्षिणी धब्बा विश्लेषण FMR1 CGG दोहराने27की आणविक रूपरेखा के लिए सोने के मानक किया गया है. हालांकि, पारंपरिक विशिष्ट पीसीआर 100 से 130 से अधिक दोहराव के साथ बड़े premutations के प्रति कम संवेदनशील है और पूर्ण उत्परिवर्तन बढ़ाना करने में असमर्थ है27,28. इसके अलावा, दोहराने आकार देने के लिए एक पारंपरिक आनुवंशिक विश्लेषक पर केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस 200 से अधिक CGG दोहराता के साथ FMR1 पीसीआर उत्पादों का पता लगाने में विफल रहता है। दक्षिणी दाग विश्लेषण दोहराने आकार की एक व्यापक रेंज के भेदभाव सक्षम बनाता है, सामान्य से पूर्ण उत्परिवर्तन दोहराने की संख्या के लिए, और व्यापक रूप से पूर्ण उत्परिवर्तन की पुष्टि के लिए इस्तेमाल किया गया है (पुरुषों में) और differentiating विषमयुग्मज alleles से एक पूर्ण उत्परिवर्तन के साथ सामान्य दोहराने आकार (महिलाओं में) के साथ जाहिरा तौर पर समयुग्मज alleles. हालांकि, दोहराव की मात्रा निर्धारित करने के लिए संकल्प सीमित है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह कदम-दर-कदम परीक्षण रणनीति श्रम-प्रधान, समय लेने वाली, और लागत-प्रभावी है।

यहाँ, हम FMR1के CGG दोहराता के परिमाणीकरण के लिए एक सटीक और मजबूत पीसीआर आधारित विधि प्रस्तुत करते हैं। इस परीक्षण का पहला चरण नाजुक एक्स पीसीआर किट का उपयोग कर FMR1 प्रमोटर के 5'UTR में दोहराने दृश्यों के पीसीआर प्रवर्धन है। पीसीआर उत्पादों को शुद्ध कर रहे हैं और टुकड़ा आकार एक microfluidic केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस साधन पर किया जाता है, और CGG की संख्या के बाद व्याख्या ज्ञात दोहराता के आधार पर मानकों को संदर्भित करके विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग दोहराता है तर्क है कि पीसीआर टुकड़ा लंबाई सीधे CGG दोहराता है की संख्या के लिए आनुपातिक है. पीसीआर प्रणाली में अभिकर्मक शामिल हैं जो अत्यधिक जीसी-रिच ट्राइन्यूलाइड दोहराने क्षेत्र के प्रवर्धन को सुविधाजनक बनाते हैं। इस पीसीआर आधारित परख reproduible और FMR1 प्रमोटरों के CGG दोहराता के सभी श्रेणियों की पहचान करने में सक्षम है. यह एक लागत प्रभावी तरीका है कि आणविक निदान और FXS और नाजुक एक्स की स्क्रीनिंग में व्यापक आवेदन मिल सकता है कम बारी के आसपास समय और उपकरणों में निवेश के साथ और इस प्रकार, नैदानिक की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में उपयोग किया जा सकता है प्रयोगशालाओं.

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Protocol

एथिकल अनुमोदन हांगकांग के संयुक्त चीनी विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया था-न्यू टेररियों पूर्व क्लस्टर नैदानिक अनुसंधान आचार समिति (संदर्भ संख्या: 2013.055)

1. पीसीआर प्रवर्धन

  1. शुरू करने से पहले, पीसीआर बफर मिश्रण, नमूना diluent और डीएनए नमूने (दोनों परीक्षण और संदर्भ डीएनए) को हटाने (सामग्री की मेजदेखें) -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से और उन्हें कमरे के तापमान पर रखने के लिए 20-30 मिनट यकीन है कि सभी अभिकर्मकों और डीएनए पूरी तरह से thawed हैं. भंवर और संक्षेप में उपयोग करने से पहले नीचे स्पिन.
  2. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर डीएनए नमूनों की एकाग्रता को मापने (सामग्री की तालिकादेखें) ). डीएनए एकाग्रता 25 एनजी/ यदि आवश्यक हो तो उचित एकाग्रता के लिए नमूना diluent के साथ पतला.
    नोट: डीएनए निकाला जाना चाहिए और इस तरह के प्रोटीन और उच्च नमक सांद्रता के रूप में हस्तक्षेप पदार्थों को दूर करने के लिए शुद्ध. गैर degraded, उच्च गुणवत्ता डीएनए बाद पीसीआर प्रवर्धन और विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए (A260/A280: 1.8-2.0 और A260/A230: gt;1.0).
  3. संदर्भ और परीक्षण डीएनए नमूनों की पहचान करने के लिए एक पीसीआर प्लेट या 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों के लेबल कुओं।
  4. परीक्षण के नमूने, 2 संदर्भ नमूने और नकारात्मक नियंत्रण नमूने के लिए आवश्यक पीसीआर प्रतिक्रियाओं की संख्या की गणना। पीसीआर बफर मिश्रण के 15 डिग्री सेल्सियस, नमूना diluent के 2.6 डिग्री सेल्सियस और प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए polymerase के 0.4 डिग्री एल जोड़कर पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें।
    नोट: नमूना diluent का उपयोग कर एक नकारात्मक नियंत्रण पीसीआर प्रदर्शन की निगरानी के लिए आवश्यक है। कमरे के तापमान पर पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार, बर्फ पर पिपेट नहीं है। पीसीआर बफर मिश्रण चिपचिपा है. ट्यूब मिक्स और फिर संक्षेप में उपयोग करने से पहले नीचे स्पिन.
  5. भंवर पीसीआर मास्टर मिश्रण चरण 1.4 से 10-20 s के लिए और नीचे स्पिन. धीरे-धीरे मिश्रण के 18 डिग्री सेल्सियस को प्रत्येक कुएं या ट्यूब में वितरित करें।
  6. भंवर और डीएनए नमूने नीचे स्पिन. पिपेट 2 प्रत्येक डीएनए के प्रत्येक डीएनए के 2 डिग्री एल को 20 डिग्री सेल्सियस की अंतिम पीसीआर मात्रा के लिए उपयुक्त कुएं या ट्यूब में 5 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
    नोट: प्रति प्रतिक्रिया डीएनए की कुल मात्रा 50-100 एनजी होनी चाहिए। डीएनए मात्रा से अधिक 150 एनजी प्रति 20 डिग्री सेल्सियस पीसीआर प्रतिक्रिया बड़े दोहराने alleles के एक गरीब प्रवर्धन में परिणाम हो सकता है. कम केंद्रित DNAs के लिए, पीसीआर मास्टर मिश्रण में नमूना diluent की राशि डीएनए समाधान द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
  7. चिपकने वाला प्लेट सीलर के साथ, या ट्यूब टोपियां के साथ थाली सील।
  8. थर्मल चक्र में सील पीसीआर प्लेट या ट्यूब गर्म ढक्कन के साथ रखें। निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ कार्यक्रम चलाने के लिए: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 35 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर denaturing के 25 चक्र के बाद, 35 s के लिए 59 डिग्री सेल्सियस पर annealing, और विस्तार पर 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 मिनट; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम कदम. आगे की प्रक्रिया के लिए हटाने तक चक्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर उत्पादों पकड़ो।
  9. पीसीआर प्रवर्धन के बाद, उत्पादों को तुरंत शुद्ध और विश्लेषण करें, या रात भर +8 डिग्री सेल्सियस के लिए +2 पर स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, उत्पाद -30 से -16 डिग्री सेल्सियस पर 30 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

2. पीसीआर उत्पादों का शुद्धिकरण

  1. इनक्यूबेटर शेकर को 65 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
  2. प्रत्येक PCR प्रतिक्रिया के लिए, अनुभाग 1 से प्रत्येक PCR उत्पाद के 20 $L में 1x TE बफर (सामग्री की तालिकादेखें) का 80 $L जोड़ें.
  3. एक पीसीआर क्लीन-अप प्लेट में नमूना मिश्रण स्थानांतरण (सामग्री की तालिकादेखें) एक multichannel pipette का उपयोग कर.
  4. प्लेट को खुला रखें और इसे इनक्यूबेटर शेकर में रखें, और 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर करें, जबकि 10 मिनट के लिए 1,200 आरपीएम पर मिलाते हुए।
  5. ऊष्मायन के बाद, वैक्यूम उपकरण को 250 mbar (या 25 kPa, 188 mmHg, 7.4 में Hg) पर सेट करें और 15 मिनट के लिए फिल्टर के माध्यम से समाधान को प्रेरित करें। वेल्स में कोई तरल शेष नहीं होना चाहिए।
  6. इनक्यूबेटर शेकर को 25 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  7. पहली आकांक्षा के बाद, वैक्यूम बंद कर देते हैं और प्रत्येक अच्छी तरह से 1x TE बफर के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। मिश्रण मत करो. चरण 2.5 में वैक्यूम सेटिंग्स का उपयोग कर 10 मिनट के लिए समाधान Aspirate.
  8. फिल्टर प्लेट के नीचे को कागज के तौलिए के ढेर पर मजबूती से दबाकर सुखाएं।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे केंद्र में 1x TE बफर के 20 डिग्री एल जोड़ें. इनक्यूबेटर शेकर में प्लेट रखें और 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जबकि 5 मिनट के लिए 1,200 आरपीएम पर हिलते हैं।
  10. इनक्यूबेशन के बाद, स्थानांतरण और प्रत्येक शुद्ध पीसीआर डीएनए के 15 $L चरण 2.9 से एक ताजा 96-वेल PCR प्लेट के लिए। शुद्ध डीएनए सीधे विश्लेषण किया जा सकता है, या वैकल्पिक रूप से -30 से -16 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक आवश्यक.

3. पीसीआर उत्पादों के अंश आकार

  1. शुरू करने से पहले, डीएनए डाई ध्यान, डीएनए जेल मैट्रिक्स, डीएनए मार्कर, डीएनए सीढ़ी और शुद्ध डीएनए नमूने चरण 2 से 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए बराबर करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. प्राइमिंग स्टेशन की स्थापना करें।
    1. अभिकर्मकों के एक नए बैच का उपयोग करते समय सिरिंज को बदलें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. बेस प्लेट समायोजित करें, और सिरिंज क्लिप का लीवर जारी करें और इसे शीर्ष स्थान तक स्लाइड करें।
  3. आकार सॉफ्टवेयर शुरू (सामग्री की तालिकादेखें) और जेल डाई मिश्रण तैयार करते हैं.
  4. भंवर डाई 10 s के लिए ध्यान केंद्रित और नीचे स्पिन. एक जेल मैट्रिक्स शीशी के लिए डाई के 25 $L जोड़ें. मिश्रित समाधान को अच्छी तरह से घुमाएं और स्पिन करें।
    1. एक स्पिन फिल्टर करने के लिए जेल डाई मिश्रण स्थानांतरण. एक microcentrifuge में स्पिन फिल्टर प्लेस और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए स्पिन 1,500 x g पर $ 20%.
      नोट: उपयोग के बाद प्रकाश से डाई के साथ समाधान को सुरक्षित रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। जेल डाई मिश्रण के बारे में 15 चिप्स एक बार तैयार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उपयोग करने से पहले हर बार 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान को बराबर करने के लिए जेल डाई मिश्रण की अनुमति दें।
  5. जेल डाई मिश्रण लोड करें.
    1. प्राइमिंग स्टेशन पर एक नया डीएनए चिप डालें। "जी" के साथ चिह्नित अच्छी तरह से में जेल डाई मिश्रण के 9 डिग्री एल जोड़ें. कृपया सुनिश्चित करें कि प्लंजर 1 एमएल निशान पर तैनात है और फिर प्राइमिंग स्टेशन को बंद करें।
    2. सीरिंज प्लंजर को तब तक दबाएँ जब तक कि वह क्लिप द्वारा न हो जाए। वास्तव में 30 s के लिए प्रतीक्षा करें तो क्लिप जारी. 5 s के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर धीरे धीरे 1 एमएल स्थिति के लिए वापस प्लंजर खींच.
    3. प्राइमिंग स्टेशन खोलें और "जी" के साथ चिह्नित कुओं में जेल-डी मिश्रण के 9 $L जोड़ें।
  6. सीढ़ी प्रतीक के साथ चिह्नित अच्छी तरह से में मार्कर के 5 डिग्री एल जोड़ें और भी 12 नमूना कुओं में से प्रत्येक में मार्कर के 5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. किसी भी कुएं को खाली न छोड़ें।
  7. सीढ़ी प्रतीक के साथ चिह्नित अच्छी तरह से में डीएनए सीढ़ी के 1 $L जोड़ें. 12 नमूना कुओं में से प्रत्येक में पीसीआर उत्पाद (प्रयुक्त कुओं) के चरण 3.1 या 1 $L से 1 $L जोड़ें। संकेत सेटिंग (2,400 आरपीएम) पर 1 मिनट के लिए भंवर मिक्सर और भंवर के एडाप्टर में क्षैतिज चिप रखो.
  8. bioanalyzer साधन में चिप डालें और 5 मिनट के भीतर साधन में चिप चलाते हैं।
  9. परख के बाद पूरा हो गया है, तुरंत साधन से इस्तेमाल किया चिप हटा दें।
  10. धीरे-धीरे इलेक्ट्रोड क्लीनर के कुओं में से एक में deionized पानी के 350 डिग्री एल जोड़ें. बायोऐलेज़र का ढक्कन खोलें और इलेक्ट्रोड क्लीनर को उसमें रखें। ढक्कन को बंद करें और लगभग 10 s के लिए इनक्यूबेट करें ढक्कन खोलें और इलेक्ट्रोड क्लीनर को हटा दें। इलेक्ट्रोड पर पानी वाष्पित करने के लिए अनुमति देने के लिए एक और 10 s प्रतीक्षा करें और फिर ढक्कन बंद करें।

4. खंड आकार परिणाम का विश्लेषण

नोट: संदर्भ नमूने परिलक्षित और अज्ञात नमूनों के साथ एक ही बैच में एक ही थर्मल साइकिल और bioanalyzer द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए.

  1. bioanalyzer चलाने के बाद पूरा हो जाता है, बाद के विश्लेषण के लिए एक .csv तालिका फ़ाइल के रूप में प्रत्येक रन से पीक डेटा निर्यात करें।
  2. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और चरण 4.1 से निर्यात किया गया .csv पीक तालिका फ़ाइल खोलें.
  3. क्यूसी मेनू टैब के माध्यम से, दो संदर्भ नमूनों से चार बिंदुओं (प्लाट पर नीले हीरे के रूप में दिखाया गया है) के लिए फिट प्रतिगमन लाइन की समीक्षा करें। प्रतिगमन पंक्ति का R2 मान होना चाहिए और 0.98 (सामान्य मान 0.999 से अधिक) होना चाहिए।
  4. परिणाम मेनू टैब के माध्यम से, प्रत्येक नमूने जिसका टुकड़ा लंबाई (ओं) स्वचालित रूप से संदर्भ नमूने से व्युत्पन्न रैखिक प्रतिगमन मानक वक्र के खिलाफ साजिश रची है की दोहराने आकार की जाँच करें. सॉफ्टवेयर भी विभिन्न दिशा निर्देशों के अनुसार प्रत्येक नमूने का वर्गीकरण प्रदान करता है।
  5. निर्यात मेनू टैब के माध्यम से, दोहराने की संख्या और नैदानिक वर्गीकरण के साथ प्रत्येक नमूने के लिए परिणाम रिपोर्ट निर्यात, साथ ही प्रत्येक रन के लिए नमूना जानकारी और QC रिपोर्ट का सारांश.
    नोट: विश्लेषण सॉफ्टवेयर कस्टम वर्गीकरण दिशा निर्देशों के उपयोग की अनुमति देता है, जैसे अमेरिकन कॉलेज ऑफ मेडिकल जेनेटिक्स (ACMG) या नैदानिक आण्विक आनुवंशिकी सोसायटी / यूरोपीय सोसायटी ऑफ ह्यूमन जेनेटिक्स (CMGS/ESHG) दिशा निर्देशों, साथ ही पूर्वनिर्धारित वर्गीकरण मापदंड.

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Representative Results

पूर्वाश्म महिला संदर्भ नमूने (NA20240, दोहराने के आकार 30 और 80) और पूर्ण उत्परिवर्तन महिला संदर्भ नमूना (NA20239, 20 और 200 के दोहराने आकार) के आकार के आकार क्रमशः चित्र 1A और चित्र 1Bमें दिखाए जाते हैं। आमतौर पर, दो मार्कर चोटियों (कम मार्कर 50 आधार जोड़े [bp] और ऊपरी मार्कर 10,380 bp) टुकड़ा आकार प्रोफ़ाइल में शामिल हैं. वहाँ आमतौर पर लगभग 95 बीपी के आकार के साथ एक प्राइमर जटिल चोटी है. संदर्भ नमूने के माध्यम से, चार बिंदुओं के साथ एक रेखीय प्रतिगमन मानक वक्र का निर्माण किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 1 ब्में दिखाया गया है।

नैदानिक सामान्य, मध्यवर्ती, पूर्वपरिवर्तन, और पूर्ण उत्परिवर्तन नमूनों की प्रतिनिधि आकार विशेषताओं चित्र 2ए-डीमें दिखाए गए हैं। विशेष रूप से, दो विस्तारित खंड चोटियों और एक सामान्य शिखर के साथ मोज़ेक पूर्ण उत्परिवर्तन चित्र 2Eमें प्रस्तुत किए गए हैं। कुछ मादा मामलों में, केवल एक चोटी माइक्रोफ्लूइडिक इलेक्ट्रोफोरोसिस परिणामों में प्रदर्शित होती है, जैसा कि चित्र 2 एफमें दर्शाया गया है। यह सामान्य समयुग्मज alleles की प्रस्तुति द्वारा समझाया जा सकता है (एक ही CGG दो alleles में दोहराने संख्या के साथ) इन मामलों में या विषमयुग्मज alleles है कि चार या उससे कम29की संख्या मतभेद दोहराने की अक्षमता . हालांकि, इन एकल पीक परिणाम सामान्य के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, क्योंकि यह मान्य किया गया है कि पीसीआर आधारित पाइप लाइन मजबूत प्रवर्धन और पूर्ण उत्परिवर्तन या premutation alleles का पता लगाने में सक्षम बनाता है, जो में झूठी नकारात्मक की संभावना को कम करता है इस स्थिति. उप-अनुकूल स्थिति का एक प्रकार आधारभूत पूर्वाग्रह है, जैसा कि चित्र 2जीमें दिखाया गया है, जो कुछ मामलों में अस्पष्ट या अपूर्व परिणाम उत्पन्न कर सकता है। ऐसी स्थिति किसी उपकरण के मुद्दे के कारण होने का संदेह है। अज्ञात नमूनों के मापित खंड आकारों को संदर्भ नमूनों से व्युत्पन्न रैखिक प्रतिगमन मानक वक्र के विरुद्ध प्लॉट किया जाता है ताकि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पुन: दोहराने के आकारों की स्वचालित रूप से गणना की जा सके, जैसा कि चित्र 2Hमें प्रदर्शित किया गया है। 200 से कम दोहराता खंड आकार रैखिक प्रतिगमन मानक वक्र में interpolated रहे हैं, जबकि बड़ा पूर्ण उत्परिवर्तन allele आकार एक ही मानक लाइन के साथ extrapolating द्वारा मापा जाता है. सॉफ्टवेयर भी विभिन्न दिशा निर्देशों के अनुसार प्रत्येक नमूने के वर्गीकरण को प्रदर्शित करता है।

Figure 1
चित्र 1: महिला संदर्भ नमूनों और इसी रैखिक प्रतिगमन वक्र के आकार देने के परिणाम. (ए, बी) premutation महिला संदर्भ नमूना के आकार सुविधाओं को दिखाने (NA20240, 30 और 80 के दोहराने आकार) और पूर्ण उत्परिवर्तन महिला संदर्भ नमूना (NA20239, दोहराने के आकार 20 और 200), क्रमशः. दो मार्कर (कम मार्कर, 50 बीपी और ऊपरी मार्कर 10380 बीपी) प्रत्येक नमूने के लिए इलेक्ट्रोफोरोसिस परिणाम में शामिल हैं। लगभग 95 बीपी के आकार के साथ चोटी एक प्राइमर जटिल इंगित करता है। काले तीर प्राइमर कॉम्प्लेक्स के शिखर आकार का संकेत देते हैं, और नीले तीर संदर्भ नमूने के खंड लंबाई का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ग)विश्लेषण सॉफ्टवेयर में दो संदर्भ नमूनों से चार बिंदुओं (नीले हीरों) के साथ रैखिक प्रतिगमन मानक वक्र का निर्माण किया गया है। क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर अक्षों की गणना CGG दोहराने संख्या और microfluidic electrophoresis में मापा टुकड़ा लंबाई दिखा. प्रतिगमन के R2 मान 0.99967 था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: विभिन्न CGG दोहराने आकार के साथ नैदानिक नमूनों के प्रतिनिधि परिणाम. (ए-ई) सामान्य के क्रम में bioanalyzer द्वारा प्रतिनिधि आकार सुविधाओं को दिखाने ( 328 बीपी और 353 बीपी के टुकड़े लंबाई के साथ, 28 और 36 की दोहराने संख्या के लिए इसी), मध्यवर्ती ( 335 बीपी और 390 बीपी के टुकड़े लंबाई के साथ, करने के लिए इसी 30 और 49 की दोहराने की संख्या), premutation (332 बीपी और 439 बीपी के टुकड़े लंबाई के साथ, 29 और 65 की दोहराने की संख्या के लिए इसी), पूर्ण उत्परिवर्तन (337 बीपी और 1911bp के टुकड़े लंबाई के साथ, 31 और 545 की दोहराने की संख्या के लिए इसी) और मोज़ेक पूर्ण उत्परिवर्तन (349 बीपी, 1201 बीपी और 2688 बीपी के टुकड़े लंबाई के साथ, 33, 294 और 751) नमूनों की दोहराने की संख्या के अनुरूप. (एफ)एक एकल-पीक microfluidic electrophoresis परिणाम प्रस्तुत करता है (334 बीपी के एक टुकड़े की लंबाई के साथ, 30 की दोहराने की संख्या के लिए इसी) एक महिला जो शायद समयुग्मज alleles है (एक ही CGG दो alleles में संख्या दोहराने के साथ) या विषमयुग्मज alleles (CGG दोहराने की संख्या चार या उससे कम के अंतर के साथ). (छ) एक प्रकार की उप-ऑप्टिमल स्थिति को दर्शाता है जो आधारभूत पूर्वाग्रह है। काले तीर प्राइमर कॉम्प्लेक्स के शिखर आकार का संकेत देते हैं, और लाल तीर नमूने के टुकड़े लंबाई का प्रतिनिधित्व करते हैं। (एच) विश्लेषण सॉफ्टवेयर के मुख्य परिणाम इंटरफ़ेस प्रदर्शित करता है. अज्ञात नमूनों के मापा टुकड़ा आकार रैखिक प्रतिगमन मानक वक्र के खिलाफ साजिश रची स्वचालित रूप से दोहराने आकार की गणना करने के लिए कर रहे हैं. में दिखाया मोज़ेक पूर्ण उत्परिवर्तन महिला नमूना के सामान्य allele (ई) निर्देशांक अक्ष क्षेत्र के निचले बाएँ कोने पर मानक वक्र करने के लिए मैप किया जाता है (हरे रंग में plotted), और बड़ा पूर्ण उत्परिवर्तन alleles (लाल रंग में plotted) से परे extrapolated चार मानक अंक (वक्र पर नीले हीरे). आंकड़ा के निचले आधे में सारणीबद्ध वर्गों टुकड़ा आकार और चुना ACMG दिशानिर्देश सीमाओं के अनुसार इसी नैदानिक वर्गीकरण प्रस्तुत करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

FXS trisomy 21 के बाद बौद्धिक हानि का दूसरा सबसे आम कारण है, एक्स से जुड़े मानसिक मंदता30के लगभग एक आधे के लिए लेखांकन, जो लगभग 1 में 4,000 पुरुषों और 1 में 8,000 महिलाओं को प्रभावित कर सकता है. इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि 250-1,000 में लगभग 1 महिलाओं में एक पूर्वपरिवर्तन होता है , और यह आवृत्ति पुरुषों में26,31,32,33में 1 है . के बाद से पूरा उत्परिवर्तन करने के लिए सीजीजी दोहराने विस्तार के जोखिम जब वंश के लिए premutation alleles संचारण नाटकीय रूप से तरक्की, 4% से जब मातृ दोहराने का आकार 55-59 से 98% है जब आकार 100-20014है , CGG का दृढ़ संकल्प एक व्यापक रेंज में दोहराने आकार FXS के निदान और उनके प्रजनन योजना के लिए premutation वाहक की स्क्रीनिंग की सुविधा सकता है. पीसीआर आधारित विधि यहाँ शुरू की सटीक, तेजी से और मजबूत FMR1 प्रमोटर के 5'UTR में दोहराने दृश्यों बढ़ाना और एक microfluidic केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस साधन पर CGG दोहराने संख्या का पूरा स्पेक्ट्रम परिमाणित करने के लिए है, और इस प्रकार कर सकते हैं आणविक निदान और कम बारी के आसपास समय और उपकरणों में निवेश के साथ FXS और नाजुक एक्स से संबंधित विकारों की स्क्रीनिंग में अपनी व्यापक आवेदन को बढ़ावा देने के। bioanalyzer साधन आत्मविश्वास दोहराने आकार माप के लिए मध्यम प्रवाह परीक्षण सेटिंग्स को कम करने में उपयोग किया जा सकता है. उपकरण बहुत छोटा है, कम महंगा है और इस तरह के ABI केशिका आनुवंशिक analyzers के रूप में अन्य केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस उपकरणों की तुलना में बनाए रखने के लिए सरल. उच्च मात्रा स्क्रीनिंग के लिए, 384 नमूना मॉडल युक्त MultiDX प्रणाली परीक्षण के लिए एक व्यापक लचीलापन और थ्रूपुट प्रदान करता है.

परख चार मुख्य कदम शामिल हैं: पीसीआर FMR1 प्रमोटर के 5'UTR में दोहराने दृश्यों के प्रवर्धन (पीसीआर सेट अप और पीसीआर प्रवर्धन लगभग 3.5 एच लेता है), पीसीआर उत्पादों की शुद्धि (लगभग 1 एच लेता है), एक microfluidic पर टुकड़ा आकार केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस उपकरण (लगभग 1 ज लेता है), और CGG की संख्या की व्याख्या ज्ञात दोहराता के साथ संदर्भ मानकों से infering द्वारा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग दोहराता है (लगभग 0.5 ज लेता है). कुल में, इस परख के बारी के आसपास समय लगभग 6 ज है. इष्टतम प्रदर्शन के लिए, डीएनए नमूने प्रोटीन और उच्च नमक सांद्रता जैसे putative हस्तक्षेप पदार्थों को दूर करने के लिए शुद्ध किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, इनपुट डीएनए की सिफारिश की मात्रा पीसीआर प्रतिक्रिया के 20 डिग्री सेल्सियस प्रति 50-100 एनजी है। पीसीआर प्रणाली के प्रति 20 डिग्री सेल्सियस से अधिक डीएनए मात्रा बड़े दोहराने alleles के गरीब प्रवर्धन में परिणाम करने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, यह दृढ़ता से गुणवत्ता नियंत्रण और बाद में विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आकार स्वचालित टुकड़ा के रूप में दोहराने की संख्या के एक साथ विश्लेषण के लिए प्रत्येक पीसीआर में अच्छी तरह से विशेषता दोहराने आकार के साथ कम से कम दो संदर्भ नमूने स्थापित करने के लिए सिफारिश की है 29. आमतौर पर संदर्भ नमूनों से व्युत्पन्न रैखिक प्रतिगमन वक्र का R2 मान 0ण्98 से अधिक होना चाहिए। इसके अलावा, पीसीआर उत्पादों का पता लगाने दक्षता में सुधार करने के लिए microfluidic केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस से पहले शुद्ध किया जाना चाहिए। के रूप में PCR प्राइमर FAM फ्लोरोसेंट29के साथ लेबल है, एक उपयुक्त इलेक्ट्रोफोरोसिस प्रणाली (जैसे, bioanalyzer और MultiDX प्रणाली) के साथ टुकड़ा आकार सीधे अतिरिक्त लेबलिंग के बिना किया जा सकता है.

FXS और संबंधित विकारों के निदान और अध्ययन के लिए तरीकों की एक किस्म व्यापक रूप से ब्रूस ई. Hayward एट अल द्वारा समीक्षा की गई है, डीएनए आधारित परख और FMRP प्रोटीन परख34सहित . ज्यादातर मामलों में के रूप में FXS के आणविक आधार गतिशील उत्परिवर्तन FMRP1 जीन के प्रमोटर क्षेत्र में एक विस्तार CGG दोहराने की विशेषता है, दक्षिणी blotting और वर्धन आधारित परख जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके सबसे अधिक इस्तेमाल किया परख के लिए कर रहे हैं दोहराने की संख्या का निर्धारण. यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि पीसीआर आधारित लागत प्रभावशीलता और न्यूनतम डीएनए राशि की आवश्यकता में दक्षिणी blotting overweigh पराखते हैं. हालांकि, CGG-पुनरावृत्ति के प्रवर्धन एक मुख्य चुनौती के बाद से उच्च जीसी सामग्री दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं, और बहुत प्रयास34वर्षों में पीसीआर प्रणाली के अनुकूलन के लिए किया गया है. नाजुक एक्स पीसीआर किट पूरे CGG trinucleotide दोहराता की सटीक प्रवर्धन के लिए अनुकूलित किया गया है, और इस पीसीआर आधारित विधि के प्रदर्शन पर एक सत्यापन अध्ययन पहले हमारे समूह द्वारा सूचित किया गया है29. इसी तरह की पीसीआर आधारित विधि Mailick Seltzer एट अल द्वारा 201235में रिपोर्ट किया गया था, लेकिन ABI 3730xl साधन दोहराने आकार निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया गया था और केवल दोहराने के आकार के साथ व्यक्तियों की पहचान की गई 200. यह तथ्य यह है कि उनके चुने हुए मंच 200 से ऊपर दोहराने आकार के साथ बड़ा दोहराता का पता लगाने में असमर्थ था के कारण हो सकता है. इसके विपरीत, bioanalyzer साधन हम उपयोग एक और अधिक मजबूत टुकड़ा आकार परख प्रदान करता है, के रूप में यह सही है और लागत प्रभावी ढंग से पूर्णउत्परिवर्तनों सहितFMR1 CGG दोहराने के पूर्ण स्पेक्ट्रम का पता लगा सकते हैं 29 .

दोहराने की संख्या को छोड़कर, कई अन्य कारकों को भी FXS और FXS से संबंधित विकारों के उचित निदान के लिए पता लगाने की जरूरत है, FMR1 उत्परिवर्तन सहित, मिथाइलेशन और मोज़ेकवाद34की हद तक . मिथाइलेशन स्थिति मिथाइल-संवेदी प्रतिबंध एंजाइम या बिस्लफाइट संशोधन परख34का उपयोग करपूर्व पाचन चरणों को शामिल करने जैसे विभिन्न तरीकों द्वारा निगरानी की जा सकती है, हालांकि, हमारी परख निर्धारित करने में असमर्थ है FMR1 प्रमोटर के 5'UTR के methylation स्थिति. इसके अतिरिक्त, एक FMR1 एलील के विस्तार जोखिम भी AGG रुकावट है, जो संचरण के दौरान जीन को स्थिर कर सकते हैं की उपस्थिति पर निर्भर करता है. पीसीआर आधारित दोहराने परख AGG रुकावट का पता लगाने के लिए संशोधित किया गया है, जबकि पाचन एंजाइम अस्थिरता मुख्य सीमाओं में से एक है. Triplet-primed (TP) PCR CGG दोहराता है या AGG रुकावट में एक संकर PCR प्राइमर बाइंडिंग का उपयोग करके पीसीआर पीसीआर परख का एक अन्य प्रकार है जो सीजीजी दोहराने के आकार और AGG रुकावट एक साथ पता लगा सकते हैं। हालांकि, FMR1 जीन-विशिष्ट PCR विधि हमने वर्णित किया है जब तक कि प्रवर्धन के बाद FMR1 जीन अनुक्रमण नहीं किया जाता है AGG रुकावटों की पहचान करने में असमर्थ है. हाल ही में, Hayward एट अल एक पूर्ण आनुवंशिक workup या पूरी तरह से प्रयोगशाला अध्ययन के लिए आवश्यक सभी मापदंडों के निर्धारण के लिए अपनी प्रयोगशाला में इस्तेमाल पीसीआर तरीकों की सूचना दी, परख है कि दोहराने की संख्या का पता लगा सकते हैं सहित, AGG रुकावट की स्थिति और मेथिलेशन स्थिति36| दुर्भाग्य से, न तो परख व्यापक तारीख तक इन सभी कारकों का निर्धारण करने में सक्षम है.

यह ध्यान देने योग्य बात है कि परख FMR1 जीन के भीतर विलोपन या एकल न्यूक्लिओटाइड वेरिएंट का पता लगाने में असमर्थ है, जो FXS मामलों के लगभग 1% के लिए खातों27. शायद ही कभी, व्यक्तियों, जो FMR1 दोहराने के लिए सेलुलर मोज़ेकवाद है में, पीसीआर बड़ा premutation और पूर्ण उत्परिवर्तन alleles37,38के लिए मोज़ेकवाद का पता लगाने में विफलता की वजह से एक झूठी नकारात्मक परिणाम दे सकता है. यह प्रदर्शित किया गया है कि इस पीसीआर आधारित मोज़ेक पूर्ण उत्परिवर्तन पुरुष नमूने के लिए परख की दहलीज (341 दोहराता है) 2.5% है जब शिखर डिटेक्टर दहलीज आधार रेखा29से ऊपर तीन फ्लोरोसेंट इकाइयों पर सेट किया गया है. यदि मोज़ेक एलेल्स संकेत दिए जाते हैं तो मामलों में दक्षिणी दाग विश्लेषण की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, इलेक्ट्रोफोरोसिस प्लेटफार्मों के संबंध में, पिछले अध्ययन ने संकेत दिया है कि केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस सिस्टम (उदाहरण के लिए, ABI 3130XL उपकरण) की तुलना में, bioanalyzer साधन सामान्य समयुग्मज अंतर करने में असमर्थ है विषमयुग्मज दोहराने के आकार के साथ महिला नमूनों से अलग-अलग टुकड़े चोटियों के साथ महिला नमूने जो चार या उससे कम29की दोहराने संख्या मतभेद है . हालांकि, इन एकल पीक नमूने सामान्य के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, क्योंकि यह मान्य किया गया है कि इस पीसीआर आधारित पाइप लाइन मजबूत प्रवर्धन और पूर्ण उत्परिवर्तन या premutation alleles का पता लगाने में सक्षम बनाता है, जो में झूठी नकारात्मक की संभावना को कम करता है इस स्थिति. उपरोक्त सीमाओं के बावजूद, विधि FXS और लागत प्रभावशीलता, मजबूती और तेजी से रिपोर्टिंग समय के साथ नाजुक एक्स संबद्ध रोगों की आणविक पहचान के लिए एक प्रथम स्तरीय पाइप लाइन के रूप में उपयोग किया जा सकता है, के अनुक्रमण द्वारा पूरक FMR1 जीन और मिथाइल के स्तर के दक्षिणी धब्बा विश्लेषण.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध NSFC आपातकालीन प्रबंधन परियोजना (ग्रेंट नंबर 81741004), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 81860272), गुआंगशी के प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी फाउंडेशन के प्रमुख अनुसंधान योजना से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ( अनुदान सं. AB16380219), चीन Postdoctoral विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (ग्रेंट नंबर 2018M630993), और गुआंगशी प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 2018GXNSFAA281067).।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

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