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Genetics

Un robusto teste basato sulla reazione alla catena di polimerasi per quantificare le ripetizioni di Trinucleotide della Citosina-guanina-guanina nel gene del retardation mentale Fragile X

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59963
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 2, 2,3, 2,3, 2, 5, 5, 6,7, 2,3
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

Un accurato e robusto saggio basato sulla reazione basato sulla reazione della catena di polimerasi per quantificare le ripetizioni della trinucleotide della citosina-guanina-guanina nel gene del ritardo mentale Fragile X-1 facilita la diagnosi molecolare e lo screening della sindrome di Fragile X e della Fragile X-correlati con tempi di consegna più brevi e investimenti in attrezzature.

Abstract

Sindrome X fragile (FXS) e disturbi associati sono causati dall'espansione della citosina-guanina-guanina (CGG) trinucleotide ripetere nella regione non tradotta 5' del promotore genico di ritardo mentale Fragile X-1(FMR1). Convenzionalmente, l'analisi del frammento di elettroforesi capillare su un analizzatore genetico viene utilizzata per il dimensionamento delle ripetizioni CGG di FMR1, ma è necessaria un'ulteriore analisi della macchia meridionale per la misurazione esatta quando il numero di ripetizione è superiore a 200. Qui, presentiamo un metodo accurato e robusto a catena di polimerasi (PCR) per la quantificazione delle ripetizioni CGG di FMR1. Il primo passo di questo test è l'amplificazione PCR delle sequenze ripetute nel 5'UTR del promotore FMR1 utilizzando un kit PCR X fragile, seguita dalla purificazione dei prodotti PCR e dal dimensionamento dei frammenti su uno strumento microfluidico di elettroforesi capillare, e successiva interpretazione del numero di ripetizioni CGG facendo riferimento a standard con ripetizioni note utilizzando il software di analisi. Questa prova basata su PCR è riproducibile e in grado di identificare l'intera gamma di ripetizioni CGG dei promotori FMR1, comprese quelle con un numero ripetuto di più di 200 (classificate come mutazione completa), da 55 a 200 (premutazione), da 46 a 54 (intermedio) e 10 a 45 (normale). Si tratta di un metodo conveniente che facilita la classificazione dei disturbi associati a FXS e Fragile X con robustezza e tempi di segnalazione rapidi.

Introduction

Sindrome di Fragile X (FXS) e fragili X disturbi associati, ad esempio, tremore e sindrome di atassia (FX-TAS), e insufficienza ovarica primaria (FX-POI) sono principalmente causati da citosina-guanina-guanina (CGG) espansione trinucleotide nel 5' non traducibile (UTR) del gene fragile X ritardo mentale-1 (FMR1) su Xq27.31,2. La proteina codificata FMR1 (FMRP) è una proteina legante all'RNA associata al poliriboso che funziona nello sviluppo neuronale e nella plasticità sinaptica regolando lo splicing alternativo, la stabilità e il trasporto dendritico di mRNA o modulando la sintesi di proteine postanitiche parziali3,4,5,6,7.

La variazione dinamica con una dimensione di ripetizione CGG di >200 è descritta come mutazione completa, che induce l'ipermetilazione aberrante e il successivo silenziamento trascrizionale del promotore FMR1 8. L'assenza o la mancanza della proteina FMRP interrompe il normale sviluppo neuronale e provoca FXS9, caratterizzato da vari sintomi clinici, tra cui disabilità intellettiva da moderata a grave, ritardo dello sviluppo, comportamenti iperattivi, contatti poveri e manifestazioni autistiche10,11,12. La presentazione in pazienti FXS femminili è generalmente più lieve di quella nei maschi. Le dimensioni di ripetizione CGG che vanno da 55 a 200 e da 45 a 54 sono classificate rispettivamente come premutation e status intermedio. A causa dell'elevato grado di premutabilità, la dimensione di ripetizione CGG in un allele intermedio si espande presumibilmente quando viene trasmessa dai genitori alla prole13,14. Così, i portatori con alleli di premutazione sono ad alto rischio di avere bambini affetti da FXS a causa dell'espansione di ripetizione, e in alcuni casi, gli alleli intermedi possono espandere la loro dimensione di ripetizione all'intera gamma di mutazioni su due generazioni15, 16. Inoltre, i maschi con premutazione trasmettono anche un aumento del rischio di sviluppare FX-TAS17ad esordiotardivo,18,19, mentre le donne premutation sono predisposte sia per FX-TAS che per FX-POI20, 21,22. Recentemente, è stato riferito che disturbi dello spettro autistico con ritardo dello sviluppo e problemi nei comportamenti sociali sono presentati nei bambini con arili FMR1 premutation23,24.

Per determinare l'esatta dimensione di ripetizione CGG è di grande importanza per la classificazione e la previsione dei disturbi ASSOCIATI a X FXS e Fragile25,26. Storicamente, la reazione a catena di polimerasi (PCR) ripetuta CGG con il dimensionamento dei frammenti più l'analisi delle macchie meridionali è stato il gold standard per la profilazione molecolare della ripetizione FMR1 CGG27. Tuttavia, la PCR specifica tradizionale è meno sensibile alle grandi premutazioni con più di 100-130 ripetizioni ed è incapace di amplificare le mutazioni complete27,28. Inoltre, l'elettroforesi capillare su un analizzatore genetico tradizionale per il dimensionamento ripetuto non riesce a rilevare i prodotti PCR FMR1 con più di 200 ripetizioni CGG. L'analisi meridionale delle macchie consente la differenziazione di una gamma più ampia di dimensioni di ripetizione, dai numeri di ripetizione della mutazione normale a quella completa, ed è stata ampiamente utilizzata per confermare le mutazioni complete (nei maschi) e differenziare gli alleli eterozigoli con una mutazione completa alleli apparentemente omozici con dimensioni di ripetizione normali (nelle femmine). Tuttavia, la risoluzione per quantificare le ripetizioni è limitata. Ancora più importante, questa strategia di test passo-passo è laboriosa, dispendiosa in termini di tempo e inefficace in termini di costi.

Qui, presentiamo un metodo preciso e robusto basato su PCR per la quantificazione delle ripetizioni CGG di FMR1. Il primo passo di questo test è l'amplificazione PCR delle sequenze ripetute nel 5'UTR del promotore FMR1 utilizzando il kit FRAGILE X PCR. I prodotti PCR vengono purificati e il dimensionamento dei frammenti viene eseguito su uno strumento di elettroforesi capillare microfluidica, e la successiva interpretazione del numero di ripetizioni CGG utilizzando il software di analisi facendo riferimento a standard con ripetizioni note basate sul logica che la lunghezza del frammento PCR è direttamente proporzionale al numero di ripetizioni CGG. Il sistema PCR include reagenti che facilitano l'amplificazione della regione di ripetizione trinucleotide altamente ricca di GC. Questa prove basata su PCR è riproducibile e in grado di identificare tutte le gamme di ripetizioni CGG dei promotori FMR1. Si tratta di un metodo conveniente che può trovare un'ampia applicazione nella diagnosi molecolare e nello screening di disturbi FXS e X fragili con meno tempi di consegna e investimenti in attrezzature e, quindi, può essere utilizzato in un più ampio spettro di malattie cliniche Laboratori.

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Protocol

L'approvazione etica è stata concessa dalla Joint Chinese University of Hong Kong - Comitato etico per la ricerca clinica dei nuovi territori (numero di riferimento: 2013.055)

1. Amplificazione PCR

  1. Prima di iniziare, rimuovere il mix di buffer PCR, i campioni didiluenti e i campioni di DNA (sia il test che il DNA di riferimento) (vedi la tabella dei materiali)dal congelatore -20 gradi centigradi e conservarli a temperatura ambiente per 20-30 min per assicurarsi che tutti i reagenti e il DNA siano completamente scongelati. Vortice e brevemente girare verso il basso prima dell'uso.
  2. Misurare la concentrazione dei campioni di DNA utilizzando uno spettrofotometro (vedere Tabella dei materiali). La concentrazione del DNA deve essere di 25 ng/L; diluire con campione diluente alla concentrazione appropriata, se necessario.
    NOT: Il DNA deve essere estratto e purificato per rimuovere le sostanze interferenti, come proteine e alte concentrazioni di sale. Il DNA non degradato e di alta qualità deve essere utilizzato per la successiva amplificazione e analisi PCR (A260/A280: 1.8–2.0 e A260/A230: >1.0).
  3. Etichettare i pozze di una piastra PCR o di tubi PCR da 0,2 mL per identificare i campioni di DNA di riferimento e testati.
  4. Calcolare il numero di reazioni PCR necessarie per i campioni di prova, 2 campioni di riferimento e campioni di controllo negativi. Preparare la PCR Master Mix sommando 15 l of PCR buffer mix, 2,6 litri di diluente del campione e 0,4 l di polimerasi per ogni reazione.
    NOT: Un controllo negativo che utilizza il diluente del campione è essenziale per monitorare le prestazioni pcR. Preparare il mix master PCR a temperatura ambiente, NON pipetta sul ghiaccio. Il mix di buffer PCR è viscoso. Mescolare il tubo e poi ruotare brevemente verso il basso prima dell'uso.
  5. Vortex il master mix PCR da passo 1.4 per 10–20 s e spin down. Distribuiscono lentamente 18 l della miscela in ogni pozzo o tubo.
  6. Vortex e far girare giù i campioni di DNA. Pipetta 2 - L di ogni DNA nel pozzo appropriato o tubo per un volume PCR finale di 20 .L. Mescolare pipetting su e giù 5 volte.
    NOT: La quantità totale di DNA per reazione dovrebbe essere 50-100 ng. Quantità di DNA superiori a 150 ng per 20 : la reazione PCR può provocare una scarsa amplificazione di grandi alleli di ripetizione. Per le DNA a basso concentrato, la quantità di campione diluente nel mix master PCR può essere sostituita da una soluzione di DNA.
  7. Sigillare la piastra con il sigillante adesivo o con tappi a tubo.
  8. Collocare la piastra PCR sigillata o i tubi nel circolatore termico con coperchio riscaldato. Eseguire il programma con le seguenti impostazioni: 95 s per 5 min, seguito da 25 cicli di denatura a 98 gradi centigradi per 35 s, annealing a 59 s per 35 s, ed estensione a 72 s per 4 min; un passo finale a 72 s per 10 min. Tenere i prodotti PCR a 4 gradi centigradi nel ciclore fino alla rimozione per un'ulteriore lavorazione.
  9. Dopo l'amplificazione della PCR, purificare e analizzare immediatamente i prodotti, o conservarli a 2 o 8 gradi centigradi durante la notte. In alternativa, il prodotto può essere conservato per un massimo di 30 giorni a -30 a -16 gradi centigradi.

2. Purificazione dei prodotti PCR

  1. Preriscaldare lo shaker dell'incubatore a 65 gradi centigradi.
  2. Per ogni reazione PCR, aggiungere 80 L di 1x TE buffer (vedere la Tabella dei Materiali) al 20 l di ogni prodotto PCR dalla sezione 1.
  3. Trasferire la miscela del campione in una piastra di pulizia PCR (vedere Tabella dei materiali)utilizzando una pipetta multicanale.
  4. Tenere la piastra scoperta e metterla nello shaker dell'incubatrice, e incubare a 65 gradi centigradi mentre si agita a 1.200 giri/mm per 10 min.
  5. Dopo l'incubazione, impostare lo strumento a vuoto a 250 mbar (o 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 in Hg) e aspirare la soluzione attraverso il filtro per 15 min.
  6. Raffreddare lo shaker dell'incubatrice fino a 25 gradi centigradi.
  7. Dopo la prima aspirazione, spegnere il vuoto e aggiungere 50 loff di 1 1 x buffer TE ad ogni pozzo. Non mescolare. Aspirare la soluzione per 10 min utilizzando le impostazioni di vuoto nel passaggio 2.5.
  8. Asciugare il fondo della piastra di filtro premendolo saldamente su una pila di asciugamani di carta.
  9. Aggiungere 20 l di 1x TE buffer nel centro inferiore di ogni pozzo. Collocare la piastra nello shaker dell'incubatore e incubare a 25 gradi centigradi agitando a 1.200 giri al secondo per 5 min.
  10. Dopo l'incubazione, trasferire >15 l di ogni DNA PCR purificato dal passo 2.9 a una piastra PCR fresca 96-well. Il DNA purificato può essere analizzato direttamente, o in alternativa può essere conservato a -30 a -16 gradi centigradi fino a quando richiesto.

3. Frammento di dimensionamento dei prodotti PCR

  1. Prima di iniziare, consentire il concentrato di colorante del DNA, la matrice del gel di DNA, il marcatore del DNA, la scalata del DNA e i campioni di DNA purificato dal punto 2 all'equilibrate a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Impostare la stazione di innesco.
    1. Sostituire la siringa (vedere Tabella dei materiali) quando si utilizza un nuovo batch di reagenti.
    2. Regolare la piastra di base, rilasciare la leva della clip di siringa e farla scorrere fino alla posizione superiore.
  3. Avviare il software di dimensionamento (vedere Tabella dei materiali)e preparare il mix gel-dye.
  4. Vortex tinrito concentrato per 10 s e girare verso il basso. Aggiungere 25 - L del colorante ad una fiala a matrice di gel. Vorticare bene la soluzione mista e girare verso il basso.
    1. Trasferire il mix gel-dye su un filtro di spin. Posizionare il filtro di spin in una microcentrifuga e ruotare per 10 min a temperatura ambiente a 1.500 x g - 20%.
      NOT: Proteggere la soluzione con tintura dalla luce e conservare a 4 gradi centigradi dopo l'uso. Il mix gel-dye può essere utilizzato per circa 15 chip una volta preparato. Lasciare che il mix gel-dye eguaglia a temperatura ambiente per 30 min ogni volta prima dell'uso.
  5. Caricare il mix gel-dye.
    1. Inserire un nuovo chip di DNA sulla stazione di innesco. Aggiungere 9 oL di miscela gel-dye nel pozzo marcato con "G". Assicurarsi che lo stantuffo sia posizionato in corrispondenza del contrassegno di 1 mL, quindi chiudere la stazione di innesco.
    2. Premere lo stantuffo della siringa fino a quando non viene tenuta dalla clip. Attendere esattamente 30 s quindi rilasciare la clip. Attendere 5 s, e poi tirare lentamente lo stantuffo di nuovo alla posizione 1 mL.
    3. Aprire la stazione di innesco e aggiungere 9 oL di gel-dye mix nei pozzi contrassegnati con "G".
  6. Aggiungete 5 l di pennarello nel pozzo contrassegnato con il simbolo della scala e aggiungete anche 5 l' di marker in ciascuno dei 12 pozze campione. Non lasciare alcun pozzo vuoto.
  7. Aggiungete 1 : L di scala del DNA nel pozzo contrassegnato con il simbolo della scala. Aggiungete 1 - L di prodotto PCR (pozzi usati) dal passo 3.1 o 1 - L di acqua ultrapura (pozzi inutilizzati) in ciascuno dei 12 pozze campione. Mettere il chip orizzontalmente nell'adattatore del miscelatore vortice e vortice per 1 min all'impostazione indicata (2.400 rpm).
  8. Inserire il chip nello strumento di bioanalisi ed eseguire il chip nello strumento entro 5 min.
  9. Al termine del test, rimuovere immediatamente il chip usato dallo strumento.
  10. Aggiungere lentamente 350 l di acqua deionizzata in uno dei pozzi del pulitore dell'elettrodo. Aprire il coperchio del bio/resi/re e posizionare il detergente elettrodo in esso. Chiudere il coperchio e incubare per circa 10 s. Aprire il coperchio e rimuovere il pulitore di elettrodo. Attendere altri 10 s per consentire all'acqua degli elettrodi di evaporare e quindi chiudere il coperchio.

4. Analizzare i risultati del dimensionamento dei frammenti

NOT: I campioni di riferimento devono essere amplificati e analizzati dallo stesso ciclonte termico e bioanalizzatore nello stesso lotto con i campioni sconosciuti.

  1. Al termine dell'esecuzione del bioanalizzatore, esportare i dati di picco da ogni esecuzione come file di tabella CSV per l'analisi successiva.
  2. Avviare il software di analisi e aprire il file della tabella di picco .csv esportato dal passaggio 4.1.
  3. Tramite la scheda del menu QC, rivedere la retta di regressione adattata ai quattro punti (mostrati come diamanti blu sul grafico) dai due campioni di riferimento. Il valore R2 della retta di regressione deve essere >0.98 (i valori tipici superano 0,999).
  4. Tramite la scheda del menu Risultati, controllare la dimensione di ripetizione di ogni campione la cui lunghezza(e) di frammento viene tracciata automaticamente rispetto alla curva standard di regressione lineare derivata dai campioni di riferimento. Il software fornisce anche la classificazione di ogni campione in base alle diverse linee guida.
  5. Tramite la scheda del menu Esporta, esportare il report dei risultati per ogni campione con i numeri di ripetizione e la classificazione diagnostica, nonché un riepilogo delle informazioni di esempio e del report QC per ogni esecuzione.
    NOT: Il software di analisi consente l'uso di linee guida di classificazione personalizzate, come le linee guida dell'American College of Medical Genetics (ACMG) o della Clinical Molecular Genetics Society/European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG), nonché la classificazione predefinita Criteri.

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Representative Results

I risultati di dimensionamento del campione di riferimento femminile di premutazione (NA20240, dimensioni di ripetizione di 30 e 80) e del campione di riferimento femminile di mutazione completa (NA20239, dimensioni ripetute di 20 e 200) sono illustrati rispettivamente nella Figura 1A e nella Figura 1B. In genere, due picchi marcatori (marcatore inferiore 50 coppie di base [bp] e marcatore superiore 10.380 bp) sono inclusi nel profilo dimensione del frammento. Di solito c'è un picco complesso primer con una dimensione di quasi 95 bp. Tramite l'esempio di riferimento, è possibile costruire una curva standard di regressione lineare con quattro punti, come illustrato nella Figura 1C.

Le caratteristiche di dimensioni rappresentative dei campioni clinici normali, intermedi, premutivi e di mutazione completi sono illustrate nella Figura 2A–D. In particolare, le mutazioni complete del mosaico con due picchi di frammenti espansi e un picco normale sono presentate nella Figura 2E. In alcuni casi femminili, nei risultati dell'elettroforesi microfluidica viene visualizzato un solo picco, come illustrato nella Figura 2F. Questo può essere spiegato dalla presentazione di normali alleli omozici (con gli stessi numeri di ripetizione CGG nei due alleli) in questi casi o l'incapacità di differenziare gli alleli eterozici che hanno differenze di numero ripetuto di quattro o meno29. Tuttavia, questi risultati di un solo picco potrebbero essere classificati come normali, perché è stato convalidato che la pipeline basata su PCR consente una robusta amplificazione e rilevamento di alleli di mutazione completa o premutazione, il che riduce al minimo la possibilità di falsi negativi questa situazione. Un tipo di situazione non ottimale è la distorsione della linea di base, come illustrato nella Figura 2G, che potrebbe produrre risultati ambigui o non interpretabili in alcuni casi. Tale condizione è sospettata di essere causata da un problema dello strumento. Le dimensioni dei frammenti misurati di campioni sconosciuti vengono tracciate rispetto alla curva standard di regressione lineare derivata dai campioni di riferimento per calcolare automaticamente le dimensioni di ripetizione utilizzando il software di analisi, come mostrato nella Figura 2H. Le dimensioni dei frammenti inferiori a 200 ripetizioni vengono interpolate nella curva standard di regressione lineare, mentre le dimensioni degli alleli a mutazione completa più grandi vengono misurate estrapolando lungo la stessa linea standard. Il software visualizza anche la classificazione di ogni campione in base alle diverse linee guida.

Figure 1
Figura 1: I risultati del dimensionamento dei campioni di riferimento femminile e della curva di regressione lineare corrispondente. (A, B) mostrano le caratteristiche delle dimensioni del campione di riferimento femminile premutazione (NA20240, dimensioni ripetute di 30 e 80) e del campione di riferimento femminile a mutazione completa (NA20239, dimensioni ripetute di 20 e 200), rispettivamente. Due marcatori (marcatore inferiore, 50 bp e marcatore superiore 10380 bp) sono inclusi nel risultato dell'elettroforesi per ogni campione. Il picco con una dimensione di quasi 95 bp indica un complesso di primer. Le frecce nere indicano la dimensione massima del complesso del primer, e le frecce blu rappresentano la lunghezza del frammento del campione di riferimento. (C) La curva standard di regressione lineare con quattro punti (diamanti blu) dei due campioni di riferimento è costruita nel software di analisi. Gli assi orizzontale e verticale mostrano i numeri di ripetizione CGG calcolati e la lunghezza del frammento misurato nell'elettroforesi microfluidica. Il valore R2 della regressione era 0,99967. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: I risultati rappresentativi di campioni clinici con dimensioni di ripetizione CGG diverse. (A-E) mostrano le caratteristiche di dimensione rappresentative per bioanalizzatore in ordine normale (con lunghezze di frammentazione di 328 bp e 353 bp, corrispondenti ai numeri di ripetizione di 28 e 36), intermedi (con lunghezze di frammentazione di 335 bp e 390 bp, corrispondenti al ripetere i numeri di 30 e 49 premut), (con lunghezze di frammentazione di 332 bp e 439 bp, corrispondenti ai numeri di ripetizione di 29 e 65), mutazione completa (con lunghezze di frammentazione di 337 bp e 1911bp, corrispondenti ai numeri di ripetizione di 31 e 545) e mosaico pieno mutazioni (con lunghezze di frammentazione di 349 bp, 1201 bp e 2688 bp, corrispondenti ai numeri ripetuti di 33, 294 e 751) campioni. (F) presenta un risultato di elettroforesi microfluidica a piccio (con una lunghezza di frammento di 334 bp, corrispondente al numero di ripetizione di 30) di una femmina che probabilmente ha alleli omozici (con gli stessi numeri di ripetizione CGG nei due alleli) o alleli eterozigosi (con il numero di ripetizione CGG differenze di quattro o meno). (G) mostra un tipo di situazione non ottimale che è la distorsione della linea di base. Le frecce nere indicano la dimensione massima del complesso del primer, e le frecce rosse rappresentano la lunghezza del frammento del campione. (H) visualizza l'interfaccia dei risultati principali del software di analisi. Le dimensioni dei frammenti misurati di campioni sconosciuti vengono tracciate in base alla curva standard di regressione lineare per calcolare automaticamente le dimensioni di ripetizione. L'allele normale del campione femminile a doppia mutazione del mosaico mostrato nella (E) è mappato alla curva standard nell'angolo inferiore sinistro dell'asse delle coordinate (tracciato in verde) e agli alleli di mutazione completa più grandi (tracciati in rosso) estrapolati oltre il quattro punti standard (diamanti blu sulla curva). Le sezioni tabulari nella metà inferiore della figura presentano le dimensioni dei frammenti e la classificazione diagnostica corrispondente in base ai limiti delle linee guida ACMG scelti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

FXS è la seconda causa più comune di compromissione intellettuale dopo la trisomia 21, che rappresenta quasi la metà del ritardo mentale X-linked30, che può colpire circa 1 su 4.000 maschi e 1 su 8.000 femmine. Ancora più importante, quasi 1 su 250-1.000 femmine portano una premutation, e questa frequenza è 1 in 250–1,600 nei maschi26,31,32,33. Poiché il rischio di espansione di ripetizione CGG a mutazioni complete durante la trasmissione di alleli premutation alla prole aumenta drammaticamente, ad esempio, dal 4% quando la dimensione della ripetizione materna è 55-59 al 98% quando la dimensione è 100–20014, la determinazione del CGG la dimensione ripetuta a una gamma più ampia potrebbe facilitare la diagnosi di FXS e lo screening dei portatori di premutation per la loro pianificazione riproduttiva. Il metodo basato su PCR qui introdotto è accurato, rapido e robusto per amplificare le sequenze ripetute nell'UTR 5'UTR del promotore FMR1 e quantificare l'intero spettro dei numeri di ripetizione CGG su uno strumento microfluidico di elettroforesi capillare, e quindi può potenziare la sua ampia applicazione nella diagnosi molecolare e nello screening di disturbi FXS e fragili legati a X con meno tempi di svolta e investimenti in attrezzature. Lo strumento bioanalizzatore può essere utilizzato con sicurezza in impostazioni di test di velocità effettiva da basso a moderata per la misurazione delle dimensioni ripetute. L'apparecchiatura è molto più piccola, meno costosa e più semplice da mantenere rispetto ad altri strumenti capillari di elettroforesi, come gli analizzatori genetici capillari ABI. Per lo screening ad alto volume, il sistema MultiDX contenente fino a 384 campioni offre una notevole flessibilità e velocità effettiva per i test.

Il saggio include quattro fasi principali: amplificazione PCR delle sequenze ripetute nel 5'UTR del promotore FMR1 (pcR set-up e amplificazione PCR prende quasi 3,5 h), purificazione dei prodotti PCR (prende quasi 1 h), dimensionamento frammento su un microfluidico strumento di elettroforesi capillare (prende quasi 1 h), e l'interpretazione del numero di ripetizioni CGG utilizzando il software di analisi deducendo dagli standard di riferimento con ripetizioni note (prende quasi 0,5 h). In totale, il tempo di consegna di questo saggio è di circa 6 h. Per ottenere prestazioni ottimali, i campioni di DNA devono essere purificati per rimuovere sostanze interferenti putative come proteine e alte concentrazioni di sale. Inoltre, la quantità raccomandata di DNA di input è 50-100 ng per 20 - L di reazione PCR. Quantità di DNA superiori a 150 ng per 20 -L del sistema PCR hanno dimostrato di provocare una scarsa amplificazione di grandi alleli di ripetizione. Inoltre, si consiglia vivamente di impostare almeno due campioni di riferimento con dimensioni di ripetizione ben caratterizzate in ogni PCR eseguita per l'analisi simultanea dei numeri di ripetizione come controllo di qualità e successiva dimensionamento automatico dei frammenti nel software di analisi 29. In genere, il valore R2 della curva di regressione lineare derivata dai campioni di riferimento deve essere maggiore di 0,98. Inoltre, i prodotti PCR devono essere purificati prima dell'elettroforesi capillarica microfluidica per migliorare l'efficienza di rilevamento. Poiché il primer PCR è etichettato con fluorescenza FAM29, il dimensionamento dei frammenti con un sistema di elettroforesi appropriato (ad esempio, il bioanalisi e il sistema MultiDX) può essere eseguito direttamente senza etichettatura aggiuntiva.

Una varietà di metodologie per la diagnosi e lo studio di FXS e disturbi correlati sono stati ampiamente rivisto da Bruce E. Hayward et al., tra cui saggi basati sul DNA e analisi di proteine FMRP34. Poiché nella maggior parte dei casi la base molecolare dell'FXS è la mutazione dinamica caratterizzata da una ripetizione CGG di espansione nella regione promotrice del gene FMRP1, i testsays basati sul gonfiore meridionale e sull'amplificazione utilizzando il DNA genomico sono i saggi più comunemente usati per determinazione del numero di ripetizione. È risaputo che i saggi basati su PCR superano il gonfio del sud in termini di economicità e di requisiti minimi di quantità di DNA. Tuttavia, l'amplificazione del CGG-repeat è una sfida principale poiché un elevato contenuto di GC può influenzare l'efficienza, e molto sforzo è stato fatto per l'ottimizzazione del sistema PCR nel corso degli anni34. Il fragile kit X PCR è stato ottimizzato per un'amplificazione accurata dell'intera ripetizione trinucleotide CGG, e uno studio di convalida sulle prestazioni di questo metodo basato su PCR è stato precedentemente riportato dal nostro gruppo29. Un metodo simile basato su PCR è stato segnalato da Mailick Seltzer et al. nel 201235, ma lo strumento ABI 3730xl è stato utilizzato per la determinazione delle dimensioni di ripetizione e sono stati identificati solo individui con dimensioni ripetute inferiori a 200. Ciò può essere dovuto al fatto che la loro piattaforma scelta non è stata in grado di rilevare le ripetizioni più grandi con dimensioni di ripetizione superiori a 200. Al contrario, lo strumento bioanalyzer che usiamo offre un saggio di dimensionamento dei frammenti più robusto, in quanto è in grado di rilevare in modo accurato ed economico l'intero spettro della ripetizione FMR1 CGG, comprese le mutazioni complete29.

Tranne il numero ripetuto, molti altri fattori devono essere accertati anche per una diagnosi appropriata dei disturbi FXS e correlati agli FXS, tra cui la mutazione FMR1, l'entità della metilazione e il mosaicismo34. Lo stato di metilazione può essere monitorato con vari metodi, come l'incorporazione di fasi di pre-digestione utilizzando l'enzima di restrizione sensibile alla metilazione o il saggio di modifica bisulfita34, tuttavia, il nostro saggio non è in grado di determinare il metilazione del 5'UTR del promotore FMR1. Inoltre, il rischio di espansione di un allele FMR1 dipende anche dalla presenza di interruzioni AGG, che possono stabilizzare il gene durante la trasmissione. I saggi ripetuti basati su PCR sono stati modificati per rilevare le interruzioni dell'AGG, mentre l'instabilità degli enzimi di digestione è una delle principali limitazioni. PCR Triplicato (TP) utilizzando un'associazione PCR ibrida nelle ripetizioni CGG o interruzioni AGG è un altro tipo di analisi PCR in grado di rilevare contemporaneamente le dimensioni della ripetizione CGG e le interruzioni AGG. Tuttavia, il metodo PCR specifico del gene FMR1 che abbiamo descritto non è in grado di identificare le interruzioni dell'AGG a meno che non venga eseguito il sequenziamento genico FMR1 dopo l'esecuzione dell'amplificazione. Recentemente, Hayward ealtri hanno riferito i metodi PCR utilizzati nel proprio laboratorio per determinare tutti i parametri necessari per un esame genetico completo o uno studio approfondito di laboratorio, compresi i saggi in grado di rilevare il numero di ripetizione, lo stato di interruzione AGG e stato di metilazione36. Purtroppo, nessuno dei due saggi è in grado di determinare in modo completo tutti questi fattori fino ad oggi.

Vale la pena notare che il saggio non è in grado di rilevare delezioni o varianti mononucleotidi all'interno del gene FMR1, che rappresenta circa l'1% dei casi FXS27. Raramente, in individui che hanno mosaicismo cellulare per la ripetizione Di FMR1, PCR può dare un risultato falso negativo a causa del fallimento nel rilevare il mosaicismo per premutazioni più grandi e alleli full-mutation37,38. È stato dimostrato che la soglia di questo saggio basato su PCR per il campione maschile a mutazione completa del mosaico (341 ripetizioni) è del 2,5% quando la soglia del rilevatore di picco è fissata a tre unità di fluorescenza al di sopra della linea di base29. L'analisi delle macchie meridionali è raccomandata nei casi in cui sono indicati gli alleli a mosaico. Inoltre, per quanto riguarda le piattaforme di elettroforesi, uno studio precedente ha indicato che rispetto ai sistemi di elettroforesi capillare (ad esempio, lo strumento ABI 3130XL), lo strumento bioanalisi non è in grado di differenziare il normale omilismo campioni femminili con picchi di frammenti individuali da campioni femminili con dimensioni di ripetizione eterozigole che hanno differenze di numero ripetuto di quattro o meno29. Tuttavia, questi campioni a picco singolo potrebbero essere classificati come normali, perché è stato convalidato che questa pipeline basata su PCR consente una robusta amplificazione e rilevamento di alleli di mutazione o premutazione completa, il che riduce al minimo la possibilità di falsi effetti negativi questa situazione. Indipendentemente dalle limitazioni di cui sopra, il metodo può essere utilizzato come una pipeline di primo livello per l'identificazione molecolare di FXS e malattie fragili associate a X con convenienza, robustezza e tempi di segnalazione rapidi, integrati dal sequenziamento del Gene FMR1 e analisi southern blot dei livelli di metilazione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del NSFC Emergency Management Project (Grant no. N. di sovvenzione AB16380219), la China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant no. 2018M630993) e la Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

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Genetica Numero 151 Reazione a catena polimerasi elettroforesi capillare microfluidica citosina-guanina-guanina ripetizioni trinucleotide Fragile X ritardo mentale-1 promoter sindrome di X fragile mutazione completa premutation
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Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).

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