Summary
O método apresentado combina a análise quantitativa das rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs), a distribuição do ciclo de pilha e o apoptose para permitir a avaliação ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB assim como as conseqüências da falha do reparo.
Abstract
O método apresentado ou versões ligeiramente modificadas foram concebidas para estudar respostas específicas de tratamento e efeitos colaterais de vários tratamentos anticancerígenos utilizados na oncologia clínica. Permite uma análise quantitativa e longitudinal da resposta de dano do ADN após o esforço genotóxico, como induzido pela radioterapia e por uma multidão de drogas anticancerígenas. O método abrange todas as fases da resposta ao dano do DNA, proporcionando desfechos para indução e reparo de quebras de dupla vertente de DNA (DSBs), prisão por ciclo celular e morte celular por apoptose em caso de falha no reparo. Combinar estas medidas fornece a informação sobre efeitos ciclo-dependentes do tratamento da pilha e permite assim um estudo detalhado do interação entre a proliferação celular e os mecanismos de enfrentamento de encontro aos danos do ADN. Como o efeito de muitos terapêutica oncológica, incluindo agentes quimioterápicos e radiação ionizante é limitado ou fortemente varia de acordo com as fases específicas do ciclo celular, análises correlativas dependem de um método robusto e viável para avaliar os efeitos do tratamento no DNA de uma forma específica do ciclo celular. Isso não é possível com ensaios de ponto de extremidade único e uma vantagem importante do método apresentado. O método não é restrito a qualquer linha celular em particular e foi exaustivamente testado em uma infinidade de tumores e linhas celulares normais do tecido. Pode ser amplamente aplicado como um ensaio de genotoxicidade abrangente em muitos campos de Oncologia, além de rádio-oncologia, incluindo avaliação de fatores de risco ambiental, triagem de drogas e avaliação da instabilidade genética em células tumorais.
Introduction
O objetivo da Oncologia é matar ou inativar as células cancerosas sem prejudicar as células normais. Muitas terapias, direta ou indiretamente, induzem o estresse genotóxico em células cancerosas, mas também para alguns se estendem em células normais. A quimioterapia ou as drogas alvejadas são combinadas frequentemente com a radioterapia para realçar a radiosensibilidade do tumor irradiado1,2,3,4,5, que permite uma redução de a dose de radiação para minimizar os danos teciduais normais.
A radiação ionizante e outros agentes genotóxicos induzem diferentes tipos de danos ao DNA, incluindo modificações de base, ligações cruzadas e quebras de fio simples ou duplo. As rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs) são as lesões as mais sérias do ADN e sua indução é chave ao efeito da matança da pilha da radiação ionizante e das várias drogas cytostatic na radioquimioterapia. Os DSBs não só prejudicam a integridade do genoma, mas também promovem a formação de mutações6,7. Conseqüentemente, as rotas diferentes do reparo de DSB, e os mecanismos para eliminar pilhas irreparàvel danificadas como o apoptose desenvolveram durante a evolução. A resposta inteira do dano do ADN (DDR) é regulada por uma rede complexa de vias de sinalização que alcangam do reconhecimento de dano do ADN e da apreensão do ciclo de pilha para permitir o reparo do ADN, à morte de pilha programada ou à inactivação em caso da falha do reparo8.
O método cytometric do do fluxo apresentado foi desenvolvido para investigar o DDR após o esforço genotóxico em um ensaio detalhado que cubra a indução e o reparo de DSB, assim como conseqüências da falha do reparo. Combina a medida do marcador amplamente aplicado γH2AX do DSB com análise do ciclo da pilha e da indução do apoptosis, usando a análise subG1 clássica e uma avaliação mais específica da ativação do caspase-3.
A combinação destes valores-limite em um ensaio reduz não somente o tempo, o trabalho e as despesas de custo, mas igualmente permite a medida ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB, assim como a ativação de caspase-3. Tais análises não seriam possíveis com ensaios conduzidos independentemente, mas são altamente relevantes para uma compreensão detalhada da resposta de dano do ADN após o esforço genotóxico. Muitas drogas anti-câncer, tais como compostos citostáticos, são dirigidas contra a divisão de células e sua eficiência é fortemente dependente da fase de ciclo celular. A disponibilidade de diferentes processos de reparo do DSB também depende do estágio do ciclo celular e da escolha do caminho que é crítico para a precisão do reparo, e por sua vez determina o destino da célula9,10,11, doze anos. Além, a medida ciclo-específica da pilha de níveis de DSB é mais exata do que a análise agrupada, porque os níveis de DSB são não somente dependentes da dose de um composto ou de uma radiação genotóxico, mas igualmente no índice do ADN da pilha.
O método tem sido utilizado para comparar a eficácia de diferentes radioterapias para superar os mecanismos de resistência no glioblastoma13 e dissecar a interação entre radiação ionizante e drogas direcionadas em osteossarcoma14,15 e cancros rhabdoid teratoides atípicos16. Adicionalmente, o método descrito tem sido amplamente utilizado para analisar os efeitos colaterais da rádio e da quimioterapia nas células-tronco mesenquimais17,18,19,20,21, 22,23,24, que são essenciais para o reparo de dano de tecido normal induzido pelo tratamento e têm uma aplicação potencial na medicina regenerativa.
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Protocol
1. preparação
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Prepare ≥ 1 x 105 células/amostra em qualquer tipo de embarcação de cultura como material de partida.
- Por exemplo, realize um experimento de curso de tempo após a exposição de células de glioblastoma U87 à radiação ionizante: irradiar células U87 subconfluentes em frascos T25 em triplicados para cada ponto de tempo. Escolha o tempo-pontos adiantados (15 minutos até 8 h após a irradiação) para seguir a cinética do reparo de DSB (nível γH2AX) e os pontos atrasados do tempo (24 h até 96 h) para avaliar níveis residuais do DSB, efeitos do ciclo de pilha e apoptosis.
Nota: O protocolo não é restrito a experimentos de irradiação ou qualquer linha celular específica. Foi testado com inúmeras linhas celulares de todos os tipos, de diferentes espécies e para várias condições de tratamento.
- Por exemplo, realize um experimento de curso de tempo após a exposição de células de glioblastoma U87 à radiação ionizante: irradiar células U87 subconfluentes em frascos T25 em triplicados para cada ponto de tempo. Escolha o tempo-pontos adiantados (15 minutos até 8 h após a irradiação) para seguir a cinética do reparo de DSB (nível γH2AX) e os pontos atrasados do tempo (24 h até 96 h) para avaliar níveis residuais do DSB, efeitos do ciclo de pilha e apoptosis.
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Prepare as seguintes soluções, incluindo 10% de excesso de volume.
- Prepare 2 mL por amostra de solução de fixação composta por 4,5% de paraformaldeído (PFA) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Prepare a solução fresca. Diluir PFA em PBS por aquecimento a 80 ° c com agitação lenta a capa de fumos. Cubra o balão com folha de alumínio para evitar a perda de calor. Deixe a solução arrefecer até à temperatura ambiente e ajuste o volume final. Passe a solução através de um filtro de celulose dobrado, grau 3hw (veja a tabela de materiais).
Atenção: Fumos de PFA são tóxicos. Realize esta etapa uma capa de fumaça e descarte os resíduos de PFA apropriadamente. - Prepare 3 mL por amostra de solução de permeabilização composta por 70% de etanol em gelo-frio H2O. conservar a-20 ° c.
- Prepare 7 mL por amostra de solução de lavagem composta por 0,5% de albumina sérica bovina (BSA) em PBS.
- Prepare 100 μL por amostra de 3% de BSA em PBS como diluente de anticorpos.
- Prepare 100-250 μL por amostra de solução de coloração de DNA composta por 1 μg/mL 4 ',6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) em PBS.
- Prepare 2 mL por amostra de solução de fixação composta por 4,5% de paraformaldeído (PFA) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Prepare a solução fresca. Diluir PFA em PBS por aquecimento a 80 ° c com agitação lenta a capa de fumos. Cubra o balão com folha de alumínio para evitar a perda de calor. Deixe a solução arrefecer até à temperatura ambiente e ajuste o volume final. Passe a solução através de um filtro de celulose dobrado, grau 3hw (veja a tabela de materiais).
- Ajuste a centrífuga para tubos de 15 mL para 5 min a 200 x g e 7 ° c. Deixe a centrífuga arrefecer e utilize estas definições para todas as etapas de centrifugação.
2. coleta de amostras
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Se o processamento de células aderentes (por exemplo, células de glioblastoma U87 cultivadas em frascos T25 com 5 mL do meio modificado de Eagle de Dulbecco suplementado com soro bovino fetal a 10% a 37 ° c e a atmosfera de dióxido de carbono a 5%), continue com os passos 2.1.1. e 2.1.2. Para as células de suspensão Prossiga diretamente para o passo 2.1.2.
- Colete o meio em um tubo de centrifugação. Separe as células usando um método de cultura de célula rotineira, que pode incluir o uso de tripsina, ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) ou outros agentes de descolamento celular.
- Para células U87, PBS pré-aquecido e tripsina/EDTA (ver a tabela de materiais) a 37 ° c, lave a camada celular com 1 ml de PBS, incubar as células por 1-2 min com 1 ml de TRIPSINA/EDTA e suporte de descolamento de células tocando no balão. Colete toda a solução de lavagem e a suspensão celular no tubo com o meio.
- Centrifugue as células, descarte o meio e ressuspender as células em 1 mL de PBS.
- Colete o meio em um tubo de centrifugação. Separe as células usando um método de cultura de célula rotineira, que pode incluir o uso de tripsina, ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) ou outros agentes de descolamento celular.
- Pipet as células para cima e para baixo várias vezes para garantir uma única suspensão celular e transferir a suspensão celular em um tubo com 2 mL de solução de fixação (4,5% PFA/PBS, 3% concentração final).
Atenção: Fumos de PFA são tóxicos. Realize esta etapa uma capa de fumaça e descarte os resíduos de PFA apropriadamente. - Incubar as células por 10 min à temperatura ambiente.
- Centrifugue as células e descarte o sobrenadante por decantação.
- Afrouxe a pelota da pilha batendo no tubo e ressuspender as pilhas em 3 mL do etanol de 70%. Prossiga diretamente com a próxima etapa ou armazene as amostras a 4 ° c por até várias semanas.
3. lavagem e coloração
- Centrifugue as células e descarte o sobrenadante por decantação.
- Afrouxe a pelota da pilha batendo no tubo. Resuspend as pilhas em 3 mL da solução de lavagem (0,5% BSA/PBS), centrifugue e descarte o sobrenadante.
- Repita o passo de lavagem 1X com 3 mL e, em seguida, 1x com 1 mL de solução de lavagem. Na última etapa, descarte o sobrenadante cuidadosamente por pipetagem. Tome cuidado para não aspirar o pellet.
- Diluir os anticorpos contra γH2AX, phospho-histone H3 (Ser10) e caspase-3 (ver a tabela de materiais) em 100 μl/amostra com diluente de anticorpo (3% BSA/PBS).
- Afrouxe a pelota da pilha batendo no tubo e ressuspender as pilhas em 100 μL da solução do anticorpo preparada na etapa 3,4. Mantenha as amostras no escuro a partir deste passo em diante.
- Incubar as amostras durante 1 h à temperatura ambiente.
- Centrifugue as células e elimine o sobrenadante com a pipetagem. Tome cuidado para não aspirar o pellet.
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Afrouxe o pellet da pilha batendo no tubo e ressuspender as células em 100-250 μL de solução de coloração de DNA (1 μg/mL DAPI/PBS).
- Use 100 μL se 1-2 X105 células estão presentes e aumentar o volume de números de células mais elevadas (250 μl para ≥ 1 x 106 células). Prossiga diretamente com a próxima etapa ou armazene as amostras no escuro a 4 ° c por até 2 semanas.
Nota: Para alguns tipos de células, otimizar a concentração de DAPI pode ajudar a melhorar a separação das fases do ciclo celular.
- Use 100 μL se 1-2 X105 células estão presentes e aumentar o volume de números de células mais elevadas (250 μl para ≥ 1 x 106 células). Prossiga diretamente com a próxima etapa ou armazene as amostras no escuro a 4 ° c por até 2 semanas.
- Pipet as amostras através da tampa do filtro da pilha de um tubo da amostra com um tamanho do pore da malha de 35 μm.
4. medição
- Coloque as amostras no gelo, inicie o citometro de fluxo (veja a tabela de materiais) configurado com uma configuração óptica de acordo com a tabela 1 e pressione o botão Prime . Se necessário, ligue o laser ultravioleta (355 NM de comprimento de onda) separadamente e defina a potência para 10 mW usando o software apropriado.
- Abra o software de aquisição (consulte a tabela de materiais), faça login e crie um novo experimento clicando no botão novo experimento na barra de ferramentas do navegador .
- Use a janela Inspector para personalizar o nome do experimento e escolha ' 5 décadas de log ' para exibição de plotagem.
- Clique no botão novo espécime na barra de ferramentas do navegador e expanda a nova entrada clicando no símbolo ' + ' no lado esquerdo para mostrar o primeiro tubo. Selecione o respectivo ícone e tipo para renomear a amostra (por exemplo, tipo de célula) e o tubo (identificador de amostra). Clique no ponteiro do tubo do primeiro tubo (seta-como símbolo à sua esquerda) para transformá-lo verde (ativo).
- Abra a guia parâmetros na janela do citometro e escolha os parâmetros de acordo com a tabela 1. Exclua todos os parâmetros desnecessários.
Nota: os nomes dos parâmetros podem variar dependendo das predefinições personalizadas (por exemplo, Cy3 em vez de Alexa555). Certifique-se de que a seleção corresponda aos filtros ópticos e detectores na tabela 1. Os trajetos claros de todos os fluoróforos são inteiramente independentes nesta instalação e a compensação da sobreposição espectral não é exigida; no entanto, poderá ser necessário se for utilizada outra configuração óptica. - Abra a janela planilha e crie plotagens de acordo com a Figura 1. Desenhe 2 parcelas de pontos e 4 histogramas usando os botões da barra de ferramentas correspondentes e clique nos rótulos dos eixos para escolher os parâmetros apropriados (dispersão frontal (FSC-A) versus dispersão lateral (SSC-A), DAPI-W versus DAPI-A e um histograma para DAPI-A e cada anticorpo acoplado fluoróforo.
- Anexe uma amostra de controle ao citometro e pressione o botão Run no instrumento. Selecione o primeiro tubo na janela do navegador do software e clique no botão adquirir dados no painel de aquisição. Ajuste o volume de injeção da amostra usando os botões baixo, médio ou alto e a roda de sintonia fina do instrumento. Preferencialmente trabalhar em baixa definição, mas tente adquirir pelo menos 100 eventos/segundo (ver painel de aquisição).
- Ajuste as tensões do detector para FSC, SSC e DAPI na guia parâmetros da janela Inspector usando as plotagens de pontos na Figura 1 como uma diretriz. Alterne para a escala logarítmica para os parâmetros FSC e SSC se a população da célula aparecer muito dispersa em uma escala linear.
- Pressione o botão STANDBY no citometro e continue com a configuração da planilha no software.
- Use a ferramenta de porta de polígono para definir a população de células no gráfico FSC-A versus SSC-a e a Rectangle Gate Tool para definir a população Singlecells na plotagem DAPI-W versus DAPI-a. Pressione Ctrl + G Keys para mostrar a hierarquia de população e clique nos nomes de portão padrão para renomeá-los.
- Subseqüentemente clique com o botão direito em todos os histogramas e escolha Mostrar populações | SingleCells no menu de contexto.
- Otimize as tensões do detector para os fluoróforos acoplados a anticorpos para cobrir a faixa dinâmica completa, adquirindo posteriormente controle e amostras tratadas. Maximize a relação sinal-ruído e evite a saturação do detector. Certifique-se de que o pico Alexa488 na população Singlecells não é truncado no controlo nem a amostra tratada.
- Pressione o botão STANDBY no citometro e, opcionalmente, execute as etapas 4.11.1-4.11.3 na janela planilha do software para obter uma estimativa aproximada dos efeitos do tratamento durante a aquisição da amostra.
- Selecione Singlecells na hierarquia de população e use a ferramenta porta retangular para definir a população G1 no gráfico DAPI-W versus DAPI-a. Clique com o botão direito do mouse no histograma Alexa488 e escolha Mostrar populações | G1 no menu de contexto.
- Clique com o botão direito do mouse no histograma Alexa488 e escolha criar exibição de estatísticas no menu de contexto. Clique com o botão direito do mouse na exibição de estatísticas e escolha Editar exibição de estatísticas. Vá para a guia estatísticas e ative a caixa de seleção para a mediana do sinal Alexa488 na população G1 (desative todas as outras opções).
- Selecione Singlecells na hierarquia de população e use a ferramenta de porta de intervalo para definir as populações subG1, M e Casp3 + no DAPI-a, Alexa555-a (Cy3-a na Figura 1) e Alexa647-A histogramas.
- Pressione o botão Run no citometro e Meça as amostras usando o painel de aquisição no software. Defina a porta de parada para todos os eventos ou o portão de células (se existirem numerosas pequenas partículas) e o número de eventos para gravar para 10.000.
- Clique em Next Tube para criar um novo exemplo, renomeá-lo na janela do navegador , clique em adquirir dados para iniciar a aquisição e gravar dados para iniciar a gravação.
- Selecione arquivo | Exportação | Experimentos na barra de menus e escolha exportação de diretório na caixa de diálogo para salvar os dados como arquivos '. FCS '. Opcionalmente, salve o experimento como um arquivo zip adicional se habilitar a reimportação do experimento em um momento posterior.
Nota: A configuração de experimentos existentes pode ser facilmente reutilizada com Edit | Duplicar sem dados.
5. avaliação de dados
- Arraste e solte os arquivos '. FCS ' no navegador de amostra do software de análise citométrica de fluxo (consulte tabela de materiais). Aplique a estratégia de gating mostrada na Figura 2. Certifique-se de que os portões se encaixam na população correspondente em todas as amostras antes de prosseguir com a próxima porta da filha.
- Para aplicar alterações em todos os exemplos, selecione o portão alterado no navegador de exemplo, copie-o pressionando Ctrl + C, selecione o portão pai, pressione Ctrl + Shift + e para selecionar os nós equivalentes em todos os exemplos e pressione Ctrl + V para colar ou Sobrescrever o portão. Não use portões de grupo.
- Clique duas vezes na primeira amostra do navegador para abrir o gráfico SSC-A vs. FSC-A. Use a ferramenta Polygon na barra de ferramentas para definir a população de células (Figura 2, plotagem 1), excluindo os detritos da análise. Certifique-se de que o portão é suficientemente largo para o canto superior direito para acomodar turnos relacionados com o tratamento, mas restringir a borda voltada para o canto inferior esquerdo do gráfico para excluir a célula de forma confiável.
- Clique duas vezes no portão de células para abrir uma nova janela de plotagem e alterar os eixos para DAPI-W (vertical) vs. DAPI-a (horizontal) clicando nos rótulos do eixo. Use a ferramenta Rectangle para definir a população singlecells (Figura 2, parcela 2), excluindo duplicetas de células ou aglomerados da análise (doublets de células G1 têm A mesma intensidade DAPI-a como G2 e células M, mas um DAPI-W consideravelmente maior de valor).
Nota: As contagens de pilha variando em amostras diferentes causarão deslocamentos na força de sinal total de DAPI-A devido à ligação do equilíbrio de DAPI ao ADN. Isso não afetará a análise do ciclo celular, mas pode ser necessário ajustar a borda direita da amostra de porta de célula única por amostra para dar conta desses turnos. - Clique duas vezes no portão Singlecells para abrir uma nova janela de plotagem e alterar os eixos para mostrar o histograma DAPI-a. Use a ferramenta Bisector para distinguir células únicas com conteúdo normal de DNA (população decellcycle ) de células apoptóticas com DNA degradado (populaçãosubG1 ). Em seguida, selecione os novos portões no navegador e pressione Ctrl + R para renomeá-los adequadamente (Figura 2, plotagem 3).
- Selecione o Cellcycle Gate no navegador e escolha Tool | Biologia | Ciclo de células... a partir da barra de menus para abrir a ferramenta de modelagem do ciclo celular. Escolha Dean-Jett-Fox25,26 na seção modelo para estimar a frequência das células na fase G1, S e G2/M (Figura 2, parcela 4). Use restrições somente em caso de mau desempenho de modelagem (Minimize a raiz média do desvio quadrado entre o modelo e os dados).
- Crie portões para a fase G1 (Ellipse Tool), S (Polygon Tool) e G2 + M (Ellipse Tool) no DAPI-W vs. DAPI-um gráfico da população do ciclo de células para ativar a medição γh2ax específica do ciclo celular ( Figura 2, lote 5). Não use a ferramenta de modelagem para a gating automática do ciclo celular com base no histograma DAPI-A, pois isso pode ser impreciso.
Nota: Pode ser necessário mover os portões ao longo da amostra do eixo DAPI-A por exemplo para dar conta dos turnos acima mencionados na força de sinal DAPI geral. Mova somente as três portas como um grupo e não mude a forma de portas individuais para evitar o viés. - Use a ferramenta Bisector para distinguir as células de fosho-histona H3-positive (m) e-Negative (m-) no histograma Alexa555-a da população do cellcycle (Figura 2, parcela 6). Segure Ctrl e selecione os portões G2 + m e m-. Pressione Ctrl + Shift + a para criar o G2 (G2 + m & m-) portão.
- Use a ferramenta Bisector para distinguir as células caspase-3-positive (Casp3 +) e-Negative (Casp3-) no histograma Alexa647-a da população singlecells (Figura 2, parcela 7). Defina o limiar de tal forma que a média da população Casp3 + nos controlos não tratados atinge ~ 0,8% para assegurar uma elevada sensibilidade e minimizar as variações do ensaio para o ensaio.
- Pressione Ctrl + T para abrir o Editor de tabela e configurá-lo de acordo com a Figura 3. Arraste e solte as diferentes populações do navegador de exemplo no Editor de tabelas e clique duas vezes nas linhas para alterar as configurações de estatística, parâmetro e nome. Remova as linhas desnecessárias que são adicionadas automaticamente após o arrastar e soltar do ícone de modelagem de ciclo de célula selecionando as linhas e pressionando del.
- Escolha o arquivo, o formato e o destino na seção de saída da faixa de opções do menu e clique em criar tabela para exportar os dados como arquivo '. xlsx '.
- Use o software de cálculo de tabela (consulte a tabela de materiais) para análise de dados adicionais de acordo com o arquivo complementar 1 (FACS_Analysis_Template_ (1). xlsx).
- Corrija as frequências das células nas diferentes fases do ciclo celular, de forma que sua soma atinge 100% aplicando a fórmula X ' = X * 100/Σ (todas as fases do ciclo celular), com X ': valor corrigido, X: valor bruto, para cada fase do ciclo celular.
Nota: Os desvios de uma soma de 100% ocorrem devido a imprecisões na modelagem do ciclo celular, mas geralmente são pequenos (< 5%). - Normalize as intensidades médias γH2AX para o conteúdo de DNA nas diferentes fases do ciclo celular dividindo os valores na fase S por 1,5 e na fase G2 e M por 2,0.
- Para calcular o nível de γH2AX normalizado combinado em toda a população de células, use a fórmula Ia = iG1 * G1 + is * s + iG2 * G2 + im * m, onde ia, iG1, is, iG2, im são intensidades medianas normalizadas γH2AX de todas, G1, S, G2, células M respectivamente e G1, S, G2, M são frequência corrigida das células na respectiva fase de ciclo celular.
- Para os níveis normalizados de γH2AX e a frequência de células subG1 e caspase-3-positivas, subtrair o valor médio dos controles não tratados de cada amostra.
- Calcule a média e o desvio padrão de cada parâmetro de todas as amostras replicantes e plotar os resultados em diagramas.
- Corrija as frequências das células nas diferentes fases do ciclo celular, de forma que sua soma atinge 100% aplicando a fórmula X ' = X * 100/Σ (todas as fases do ciclo celular), com X ': valor corrigido, X: valor bruto, para cada fase do ciclo celular.
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Representative Results
As pilhas humanas do glioblastoma U87 ou LN229 foram irradiadas com 4 GY da radiação do íon do Photon ou do carbono. Os níveis de γH2AX específicos do ciclo celular e apoptose foram medidos em diferentes pontos de tempo até 48 h após a irradiação utilizando o método citométrico de fluxo apresentado aqui (Figura 3). Em ambas as linhagens celulares, os íons de carbono induziram maiores níveis de pico de γH2AX que diminuíram mais lentamente e permaneceram significativamente elevados em 24 a 48 h em comparação com a radiação fóton na mesma dose física (Figura 4A). Isto indicou que os íons do carbono induziram uns níveis mais elevados do pico de rupturas dobro-vertente do ADN (DSBs) do que os fótons que foram reparados menos eficientemente. Para ambos os tipos de radiação, os níveis de γH2AX foram mais elevados nas células G1, provavelmente porque o reparo do DSB é limitado à via de adesão final não homológica nesta fase do ciclo celular.
Em consonância com a maior taxa de indução do DSB e a cinética de reparo mais lenta, os íons de carbono induziram uma parada de ciclo celular mais forte e duradoura na fase G2 (Figura 3B) e uma maior taxa de apoptose do que os fótons (Figura 4C). A radiação do íon do carbono pode conseqüentemente ajudar a superar os mecanismos do radioresistance observados no glioblastoma em cima da radioterapia clássica com fótons (veja Lopez Perez, et al.1 para a discussão detalhada).
Os resultados mostrados na Figura 4 são exemplos de um desfecho ótimo desse método, evidenciando diferenças claras entre as células não tratadas e irradiadas e os efeitos diferenciais estatisticamente significantes entre os diferentes tratamentos. Nos casos em que a indução de DSBs e apoptose é menos clara, é importante incluir controles positivos. Como mostrado aqui, as células fixas 1 h após a irradiação do fóton são bons controles positivos para a indução γH2AX. A radiação do fóton também é conhecida por induzir eficientemente a apoptose em linfócitos, o que os torna úteis como controles positivos para apoptose 2-4 dias após a irradiação. Outra possibilidade é usar drogas para indução de apoptose, como o inibidor do Proteassoma MG132 ou um ligante do receptor de óbito (Figura 5).
Outro aspecto importante para um resultado ideal do ensaio é a qualidade dos perfis de ciclo celular. Na Figura 4B os picos G1 e G2 foram estreitos e claramente separados, facilitando a aplicação da modelagem do ciclo celular e definindo as portas para a mensuração específica do ciclo celular de γh2ax. Dependendo do tipo de célula e da força do efeito do tratamento (Figura 6a, B), a resolução das diferentes fases do ciclo celular pode ser significativamente pior. Em alguns casos, a concentração de DAPI tem um grande impacto na qualidade do perfil do ciclo celular e precisa ser ajustada (Figura 6C). Nos casos em que nenhum pico G1 claro é detectável devido ao tratamento, a ferramenta de modelagem do ciclo celular não pode ser aplicada com precisão. É aconselhável, então, usar somente a gating manual no gráfico DAPI-A versus DAPI-W com base nos controles com um perfil de ciclo celular bem definido, conforme descrito no protocolo.
A análise de um perfil de ciclo celular sem um pico de G1 claro pode ser mais complicada se o tratamento leva a números de células baixas que resultam em grandes deslocamentos na força do sinal DAPI geral. Nesta situação, pode ser difícil julgar, se um pico é o G1 ou o G2 pico. Para evitar este problema, as pilhas podem ser contadas com uma câmara de Neubauer ou por outros meios após a última etapa de lavagem (etapa 3,3) e os números de pilha podem ser ajustados. As posições de pico nas células tratadas corresponderem aos controles.
Figura 1 : Configuração de planilha para aquisição de amostra. Plotagens e portões para exibição de sinal na janela planilha do software de citometro de fluxo (veja a tabela de materiais). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Estratégia de gating para a avaliação de dados. Árvore populacional e diagramas que mostram como as portas são definidas para definir as diferentes subpopulações no software de análise citométrica de fluxo. DJF refere-se à ferramenta de modelagem de ciclo celular usando o método Dean-Jett-Fox25,26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Tabela de exportação de dados brutos. Configuração do ' Table Editor ' para exportação de dados brutos no software de análise de citometria de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Resposta do dano do ADN de pilhas humanas do glioblastoma de U87 e de LN229 após a irradiação com 4 GY do Photon contra a radiação do íon do carbono. (A) DSB indução e reparação medidos por γH2AX níveis. A intensidade da fluorescência mediana foi normalizada para o teor de DNA relativo em cada fase do ciclo celular (G1 = 1,0, S = 1,5, G2 = 2,0) e os níveis de controle foram subtraída. Os símbolos indicam a média e as barras de erro indicam valores SD. Linhas sólidas representam ajustes de acordo com a função I (t) = (P1 * t ² + P2 * t)/(t ² + Q1 * t + Q2) | t ≥ 0, P1 < 0, P1, Q1, Q2 > 0. (B) distribuição do ciclo celular (média e DP) e histogramas representativos do marcador de conteúdo de DNA DAPI a 24 h após a irradiação de fóton ou íon de carbono. (C) indução de apoptose, medida pelas células positivas de caspase-3 e subG1 (média e DP). * P < 0, 5, * * P < 0, 1, * * * P < 0, 1 (teste t de Student de duas faces). Este número foi modificado de Lopez, et al.1 com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Apoptose-indução droga-negociada em pilhas do glioblastoma U87. U87 células foram tratadas com 5 ng/mL de um ligante de indução de apoptose (ver tabela de materiais) modificado com TNF mais 2,5 μm MG132 por 20 h antes da fixação para validar a medida de apoptose por meio da análise ativa de caspase-3 e subG1. (A) histograma do sinal de caspase-3 de células tratadas versus não tratadas. (B) histograma DAPI de células tratadas com uma população subG1, indicando degradação do DNA. O histograma de eventos caspase-3-positivos é sobreposto em vermelho, demonstrando que a maioria das células apoptóticas ainda não tinha degradado seu DNA neste momento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Fatores que influenciam a qualidade dos perfis do ciclo celular. Tratamentos muito agressivos complicam a análise do ciclo celular. (A) no pico G1 é detectável 48 h após o tratamento de células LLC (carcinoma do pulmão de Lewis) com 20 GY de radiação de fóton ou (B) 96 h após o tratamento de fibroblastos HS68 com 100 MJ de radiação UV. (C) concentração de DAPI em diferentes linhagens celulares: em HS68 fibroblastos (painel superior) o pico G2/M (ver setas) foi igualmente bem separado do pico G1 para concentrações de DAPI entre 0, 1 e 1,0 μg/ml. Por outro lado, as concentrações de DAPI abaixo de 0,75 μg/mL resultaram em má separação e definição de forma do pico G2/M (ver setas) nos fibroblastos do MRC-5 (painel inferior). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: configuração típica do citometro de fluxo. λ = comprimento de onda do laser de excitação, U = tensão do detector, log = escala logarítmica (caso contrário, linear),-A = área de sinal,-H = altura máxima do sinal,-W = largura do sinal (duração), FSC = dispersão dianteira, SSC = dispersão lateral. As especificações do filtro óptico são dadas como comprimento de onda central/largura de banda em nanometros. As configurações podem variar para diferentes citometros de fluxo e as tensões do detector precisam ser ajustadas para diferentes linhas celulares.
Complementar Figura 1: imagens microscópicas de γH2AX focos. As células U87 foram irradiadas com diferentes doses de radiação fóton, fixas e corados após 30 min de acordo com o protocolo apresentado e preparados para microscopia conforme descrito na discussão. Em 2 GY, os focos individuais podiam facilmente ser distinguidos, quando em 8 GY os focos que contam eram tendenciosos devido à sobreposição considerável. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo complementar 1: Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O método caracterizado é fácil de usar e oferece uma medida rápida, exata e reprodutível da resposta de dano do ADN que inclui a indução e o reparo da ruptura da dobro-Costa (DSB), os efeitos do ciclo de pilha e a morte da pilha apoptóticas. A combinação desses Endpoints fornece um quadro mais completo de suas inter-relações do que os ensaios individuais. O método pode ser amplamente aplicado como um ensaio de genotoxicidade abrangente nos campos de biologia de radiação, terapia e proteção, e mais geralmente em Oncologia (por exemplo, para avaliação de fatores de risco ambiental, triagem de medicamentos e avaliação de genética instabilidade nas células tumorais).
O passo mais crítico neste protocolo é a fixação das células. Para obter uma amostra limpa com uma população de células claramente definida e resolução ideal de diferentes fases do ciclo celular, é importante dar tempo suficiente células aderentes para separar do vaso de cultura e formar uma forma completamente redonda. As células devem ser transferidas para a solução de fixação como uma única suspensão celular sem Aglomerantes de células. Para separá-los, as células devem ser pipetadas para cima e para baixo ou passar por uma agulha fina várias vezes em casos difíceis. O tempo de fixação deve ser mantido constante entre todas as amostras e não deve exceder 20 min, incluindo o tempo de centrifugação antes da ressuscirepensão das células em 70% de etanol. A fixação prolongada conduzirá à perda de resumos acessíveis para a ligação do anticorpo e diminuirá a força e a sensibilidade de sinal do método.
A principal limitação da técnica é que não fornece informações sobre a qualidade dos focos γH2AX que não a intensidade em todo o núcleo. Particularmente os grandes focos de γh2ax assim como a ocorrência de uma mancha de γh2ax Pan-nuclear foram lig aos DSBs aglomerados1,27,28,29, que são lesões altamente complexas que são muito difíceis para reparar30. Tais lesões agrupadas parecem ser características para a radiação da partícula tal como a radiação clìnica aplicada do íon do carbono e podem ser a razão para a eficácia biológica superior da radiação pesada do íon comparada aos fótons31,32 ,33. A análise do tamanho dos focos γH2AX pode, portanto, ser de interesse como um indicador da complexidade dos danos. Embora seja possível usar o protocolo atual com um citômetro do córrego da imagem para visualizar os focos de γh2ax, a definição realizável não pode competir com uma aproximação microscópica clássica. Entretanto, nós preparamos com sucesso corrediças microscópicas das amostras restantes após a medida cytometric do do fluxo (Figura complementar 1) e avaliamos diversas características que incluem a contagem dos focos γH2AX, o tamanho e a intensidade Pan-nuclear usando um sistema de imagem e análise semiautomatizado. Para preparar as amostras para microscopia, 30-50 μL das células manchadas foram espalhados sobre a superfície de um 24 mm x 24 mm tampa de vidro, ar seco durante a noite em temperatura ambiente no escuro e, em seguida, incorporado com suporte de montagem em uma lâmina de vidro.
Em comparação com a avaliação microscópica dos níveis de DSB pela contagem de focos de γH2AX, a medida citométrica do fluxo é superior na taxa de transferência, na velocidade de amostragem, na escala dinâmica e na exatidão. A faixa dinâmica de contagem de focos microscópicos é limitada pela resolução óptica, levando à incapacidade de distinguir focos de sobreposição29,34. Na prática, observamos uma relação linear entre a dose de radiação e os números de focos γH2AX abaixo de 2 GY, e um forte efeito de saturação acima de 2 GY em células de glioblastoma U871. Em contrapartida, a intensidade do sinal γH2AX medida pela citometria de fluxo aumentou linearmente com a dose para toda a faixa de dose testada (0-8 GY).
A exatidão da contagem microscópica dos focos é limitada pela inabilidade distinguir entre fases diferentes do ciclo de pilha sem colorações adicionais35. O número de DSBs induzidos em uma célula não depende apenas da dose de radiação, mas também do conteúdo de DNA e, consequentemente, do estágio do ciclo celular. As células G2, por exemplo, têm duas vezes mais DNA que as células G1 e o número médio de DSBs induzida em uma certa dose de radiação é duas vezes maior para as células G2 comparadas ao G1. Isto é claramente refletido na intensidade do sinal γH2AX de G2 versus G1 células em pontos de tempo precoce após a radiação medido por citometria de fluxo. Portanto, é importante avaliar os níveis de DSB em uma maneira específica do ciclo celular para obter resultados precisos. Uma análise agrupada das pilhas em fases diferentes do ciclo de pilha, como usual em aproximações microscópicas, pode ser tendenciosa por deslocamentos na distribuição do ciclo de pilha particularmente devido à apreensão radiation-induced de G2. Para dar conta desse efeito e comparar as características de reparo do DSB entre diferentes estágios do ciclo celular, os níveis de γH2AX podem ser facilmente normalizados para o conteúdo de DNA no método de citometria de fluxo, conforme indicado no protocolo.
As extensões do protocolo atual são possíveis com relativamente pouco esforço extra. Anticorpos adicionais com rótulos de fluoróforos compatíveis podem ser incluídos na etapa 3,4 sem a necessidade de quaisquer etapas extras durante a preparação da amostra. Se uma análise mais detalhada da apoptose é desejada, os anticorpos caspase-7,-9 e-8 podem ser incluídos. Como uma outra extensão, nós incluímos recentemente uma tintura viva e inoperante da pilha, um anticorpo do troponina T e contas de contagem no protocolo para analisar especificamente os cardiomiócitos cocultivados com fibroblastos após a irradiação. A adição da mancha viva/inoperante da pilha e os grânulos de contagem expandem a capacidade do método de incluir a proliferação do fibroblasto e a morte não-apoptotic da pilha dos cardiomiócitos como uns pontos finais mais adicionais que forneçam a informação adicional útil na pilha destino após o stress genotóxico. O protocolo estendido está disponível mediante solicitação.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a equipe de facilidade de citometria de fluxo no centro de pesquisa de câncer da Alemanha (DKFZ) por seu apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1,000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| Folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
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