Summary
Den presenterade metoden kombinerar den kvantitativa analysen av DNA dubbel-strand raster (DSBs), cell Cycle distribution och apoptos att möjliggöra cell Cycle-specifik utvärdering av DSB induktion och reparation samt konsekvenserna av reparations fel.
Abstract
Den presenterade metoden eller något modifierade versioner har utformats för att studera specifika behandlingssvar och biverkningar av olika anti-cancerbehandlingar som används i klinisk onkologi. Det möjliggör en kvantitativ och longitudinell analys av DNA-skadesvaret efter genotoxisk stress, som induceras av strålbehandling och en mängd läkemedel mot cancer. Metoden täcker alla stadier av DNA-skadesvaret, vilket ger endpoints för induktion och reparation av DNA dubbel-strand raster (DSBs), cellcykelarrest och celldöd genom apoptos vid reparations fel. Kombinationen av dessa mätningar ger information om cell cykel beroende behandlingseffekter och möjliggör därmed en djupgående studie av samspelet mellan cellulär proliferation och coping mekanismer mot DNA-skador. Eftersom effekten av många cancer Therapeutics inklusive kemoterapeutiska medel och joniserande strålning är begränsad till eller starkt varierar beroende på specifika cell cykel faser, korrelera analyser förlitar sig på en robust och genomförbar metod för att bedöma Behandlingseffekterna på DNA i ett cell cykel-specifikt sätt. Detta är inte möjligt med Single-Endpoint-analyser och en viktig fördel med den presenterade metoden. Metoden är inte begränsad till någon särskild cellinjer och har testats grundligt i en mängd tumör-och normala vävnads celllinjer. Det kan allmänt tillämpas som en omfattande genotoxicitetstest i många områden av onkologi förutom radio-onkologi, inklusive miljö riskfaktor bedömning, Drug screening och utvärdering av genetisk instabilitet i tumörceller.
Introduction
Målet med onkologi är att döda eller att inaktivera cancerceller utan att skada normala celler. Många terapier antingen direkt eller indirekt inducera genotoxisk stress i cancerceller, men också att vissa sträcker sig i normala celler. Kemoterapi eller riktade läkemedel kombineras ofta med strålbehandling för att förbättra radio känsligheten hos den bestrålade tumören1,2,3,4,5, vilket möjliggör en minskning av stråldosen för att minimera normal vävnadsskada.
Joniserande strålning och andra genotoxiska medel inducerar olika typer av DNA-skador, inklusive bas modifikationer, strand tvärlänkar och enkel-eller dubbel Strands raster. DNA dubbel-strand raster (DSBs) är de allvarligaste DNA-lesioner och deras induktion är nyckeln till cell dödande effekt av joniserande strålning och olika cytostatika i radiokemoterapi. DSBs skadar inte bara genomets integritet, utan främjar också bildandet av mutationer6,7. Därför, olika DSB reparations vägar, och mekanismer för att eliminera irreparabelt skadade celler som apoptos har utvecklats under evolutionen. Hela DNA-skadesvaret (DDR) regleras av ett komplext nätverk av signalvägar som når från DNA-skadeigenkänning och cellcykelarrest för att möjliggöra DNA-reparationer, programmerad celldöd eller inaktivering vid reparations fel8.
Den presenterade flödescytometriska metoden har utvecklats för att undersöka DDR efter genotoxisk stress i en omfattande analys som täcker DSB induktion och reparation, samt konsekvenserna av reparations fel. Den kombinerar mätningen av den allmänt tillämpade DSB-markören γH2AX med analys av cellcykeln och induktion av apoptos, med hjälp av klassisk subG1 analys och mer specifik utvärdering av kaspas-3 aktivering.
Kombinationen av dessa endpoints i en analys minskar inte bara tid, arbete och kostnader kostnader, men också möjliggör cell Cycle-specifik mätning av DSB induktion och reparation, samt caspase-3 aktivering. Sådana analyser skulle inte vara möjliga med oberoende genomförda analyser, men de är mycket relevanta för en omfattande förståelse av DNA-skadesvaret efter genotoxisk stress. Många läkemedel mot cancer, såsom cytostatiska föreningar, riktas mot att dela celler och deras effektivitet är starkt beroende av cellcykeln skede. Tillgängligheten av olika DSB reparationsprocesser är också beroende av cellcykeln skede och väg val som är avgörande för reparation noggrannhet, och i sin tur bestämmer ödet för cellen9,10,11, 12. Dessutom, cellcykelspecifik mätning av DSB-nivåer är mer exakt än poolad analys, eftersom DSB-nivåerna är inte bara beroende av dosen av en genotoxisk förening eller strålning, men också på DNA-halten i cellen.
Metoden har använts för att jämföra effekten av olika radioterapier för att övervinna resistensmekanismer i glioblastoma13 och för att dissekera samspelet mellan joniserande strålning och riktade läkemedel i osteosarkom14,15 och atypiska teratoid rabdoid cancer16. Dessutom, den beskrivna metoden har använts i stor utsträckning för att analysera biverkningar av radio-och kemoterapi på mesenkymala stamceller17,18,19,20,21, 22,23,24, som är nödvändiga för reparation av behandling-inducerad normal vävnadsskada och har en potentiell tillämpning i regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelser
-
Förbered ≥ 1 x 105 celler/prov i alla typer av odlingskärl som utgångsmaterial.
- Till exempel genomföra en tid-kurs experiment efter exponering av U87 glioblastoma celler till joniserande strålning: bestråla sub-confluent U87 celler i T25 flaskor i tre exemplar för varje gång punkt. Välj tidig tid-poäng (15 min upp till 8 h efter bestrålning) att följa kinetik av DSB Repair (γH2AX nivå) och sena tidpunkter (24 h upp till 96 h) för att bedöma kvarvarande DSB nivåer, cell cykel effekter och apoptos.
Anmärkning: Protokollet är inte begränsat till strålnings experiment eller någon specifik cellinjer. Det har testats med många cellinjer av alla slag, från olika arter och för olika behandlingsförhållanden.
- Till exempel genomföra en tid-kurs experiment efter exponering av U87 glioblastoma celler till joniserande strålning: bestråla sub-confluent U87 celler i T25 flaskor i tre exemplar för varje gång punkt. Välj tidig tid-poäng (15 min upp till 8 h efter bestrålning) att följa kinetik av DSB Repair (γH2AX nivå) och sena tidpunkter (24 h upp till 96 h) för att bedöma kvarvarande DSB nivåer, cell cykel effekter och apoptos.
-
Förbered följande lösningar inklusive 10% överskottsvolym.
- Bered 2 mL per prov av Fixeringslösning sammansatt av 4,5% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Förbered lösningen fräsch. Späd PFA i PBS genom upphettning till 80 ° c med långsam omrörning under draghuven. Täck kolven med aluminiumfolie för att förhindra värmeförlust. Låt lösningen svalna till rumstemperatur och justera den slutliga volymen. Passera lösningen genom ett vikta cellulosa filter, grad 3hw (se tabell över material).
Försiktighet: PFA-ångor är giftiga. Utför detta steg under en draghuv och kassera PFA-avfallet på lämpligt sätt. - Förbered 3 mL per prov av permeabiliseringslösning som består av 70% etanol i iskallt H2O. Förvara vid-20 ° c.
- Bered 7 mL per prov av tvättlösning som består av 0,5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
- Bered 100 μL per prov av 3% BSA i PBS som antikropps spädningsmedel.
- Bered 100-250 μL per prov av DNA-Färgnings lösning sammansatt av 1 μg/mL 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) i PBS.
- Bered 2 mL per prov av Fixeringslösning sammansatt av 4,5% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Förbered lösningen fräsch. Späd PFA i PBS genom upphettning till 80 ° c med långsam omrörning under draghuven. Täck kolven med aluminiumfolie för att förhindra värmeförlust. Låt lösningen svalna till rumstemperatur och justera den slutliga volymen. Passera lösningen genom ett vikta cellulosa filter, grad 3hw (se tabell över material).
- Ställ centrifugen för 15 mL rör till 5 min vid 200 x g och 7 ° c. Låt centrifugen svalna och Använd dessa inställningar för alla centrifugeringssteg.
2. provtagning
-
Om behandling av anhängare celler (t. ex. U87 glioblastoma celler som odlas i T25 flaskor med 5 mL av Dulbecco är modifierad Eagle ' s medium kompletteras med 10% foster bovint serum vid 37 ° c och 5% koldioxid atmosfär), Fortsätt med steg 2.1.1. och 2.1.2. För upphängnings celler gå direkt till steg 2.1.2.
- Samla upp mediet i ett centrifugeringsrör. Ta loss cellerna med hjälp av en rutin cell odlingsmetod, som kan innefatta användning av Trypsin, etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller andra cell avlossning agenter.
- För U87 celler, förvärmt PBS och trypsin/EDTA (se tabellen av material) till 37 ° c, tvätta cell skiktet med 1 ml PBS, inkubera cellerna för 1-2 min med 1 ml trypsin/EDTA och stöd cell avlossning genom att knacka på kolven. Samla alla tvättlösning och cellsuspensionen i röret med mediet.
- Centrifugera cellerna, kassera mediet och Omsuspendera cellerna i 1 mL PBS.
- Samla upp mediet i ett centrifugeringsrör. Ta loss cellerna med hjälp av en rutin cell odlingsmetod, som kan innefatta användning av Trypsin, etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller andra cell avlossning agenter.
- Pipet cellerna upp och ner flera gånger för att säkerställa en enda cellsuspension och överföra cellsuspensionen i ett rör med 2 mL Fixeringslösning (4,5% PFA/PBS, 3% slutkoncentration).
Försiktighet: PFA-ångor är giftiga. Utför detta steg under en draghuv och kassera PFA-avfallet på lämpligt sätt. - Inkubera cellerna i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera cellerna och Kassera supernatanten genom decantation.
- Lossa cellpelleten genom att knacka på röret och Omsuspendera cellerna i 3 mL 70% etanol. Fortsätt direkt med nästa steg eller förvara proverna vid 4 ° c i upp till flera veckor.
3. tvättning och färgning
- Centrifugera cellerna och Kassera supernatanten genom decantation.
- Lossa cellpelleten genom att knacka på röret. Omsuspendera cellerna i 3 mL tvättlösning (0,5% BSA/PBS), Centrifugera och Kassera supernatanten.
- Upprepa tvättsteg 1x med 3 mL, och sedan 1x med 1 mL tvättlösning. I det sista steget, Kassera supernatanten noggrant genom pipettering. Var noga med att inte aspirera pelleten.
- Späd ut antikropparna mot γH2AX, Phospho-histone H3 (Ser10) och caspase-3 (se tabell över material) i 100 μl/prov med antikropps spädningsmedel (3% BSA/PBS).
- Lossa cellpelleten genom att knacka på röret och Omsuspendera cellerna i 100 μL av antikroppslösningen som bereds i steg 3,4. Håll proverna i mörkret från det här steget och framåt.
- Inkubera proverna i 1 h vid rumstemperatur.
- Centrifugera cellerna och Kassera supernatanten noggrant genom pipettering. Var noga med att inte aspirera pelleten.
-
Lossa cellpelleten genom att knacka på röret och Omsuspendera cellerna i 100-250 μL DNA-Färgnings lösning (1 μg/mL DAPI/PBS).
- Använd 100 μL om 1-2 X105 celler är närvarande och öka volymen för högre cell nummer (250 μl för ≥ 1 x 106 celler). Fortsätt direkt med nästa steg eller förvara proverna i mörker vid 4 ° c i upp till 2 veckor.
Anmärkning: För vissa celltyper optimera DAPI koncentrationen kan bidra till att förbättra separationen av cellcykeln faser.
- Använd 100 μL om 1-2 X105 celler är närvarande och öka volymen för högre cell nummer (250 μl för ≥ 1 x 106 celler). Fortsätt direkt med nästa steg eller förvara proverna i mörker vid 4 ° c i upp till 2 veckor.
- Pipet proverna genom cellen SIL locket av ett prov rör med en maska porstorlek på 35 μm.
4. mätning
- Placera proverna på isen, starta flödescytometern (se material tabellen) konfigurerad med en optisk inställning enligt tabell 1 och tryck på knappen Prime . Om det behövs, slå på ultraviolett laser (355 nm våglängd) separat och Ställ in strömmen till 10 mW med hjälp av lämplig programvara.
- Öppna anskaffningsprogram varan (se tabell över material), logga in och skapa ett nytt experiment genom att klicka på knappen nytt experiment i webbläsarens verktygsfält.
- Använd fönstret granskare för att anpassa namnet på experimentet och välj "5 log årtionden" för Plot display.
- Klicka på knappen nytt preparat i webbläsarens verktygsfält och expandera den nya posten genom att klicka på symbolen ' + ' på vänster sida för att visa det första röret. Välj respektive ikon och typ för att byta namn på preparatet (t. ex. celltyp) och röret (prov identifierare). Klicka på rör pekaren på det första röret (Pilliknande symbol till vänster) för att aktivera det grönt (aktivt).
- Öppna fliken parametrar i fönstret cytometer och välj parametrarna enligt tabell 1. Ta bort alla onödiga parametrar.
Obs: parameternamnen kan variera beroende på de anpassade för inställningarna (t. ex. Cy3 i stället för Alexa555). Se till att markeringen överensstämmer med de optiska filtren och detektorerna i tabell 1. Ljus banorna för alla fluoroforer är helt oberoende i denna inställning och kompensation av spektralöverlappning krävs inte. Det kan dock vara nödvändigt om en annan optisk inställning används. - Öppna kalkylblads fönstret och skapa diagram enligt figur 1. Rita 2 dot tomter och 4 histogram med hjälp av motsvarande knappar i verktygsfältet och klicka på axeletiketterna för att välja lämpliga parametrar (Front scatter (FSC-A) kontra sida scatter (SSC-A), DAPI-W kontra DAPI-A och ett histogram för DAPI-A och varje antikropp-kopplade fluorophore.
- Koppla ett kontrollprov till cytometern och tryck på Run -knappen på instrumentet. Välj det första röret i webbläsarfönstret av programvaran och klicka på Hämta data knappen i förvärvs instrumentpanelen. Justera prov insprutnings volymen med hjälp av knapparna Low, Mid eller High och fin justeringshjulet på instrumentet. Helst arbeta på låg inställning, men försök att förvärva minst 100 händelser/sekund (se förvärv Dashboard).
- Justera detektor spänningarna för FSC, SSC och DAPI på fliken parametrar i fönstret granskare med hjälp av punktdiagram i figur 1 som riktlinje. Växla till logaritmisk skala för FSC-och SSC-parametrarna om cellpopulationen verkar vara för spridd på en linjär skala.
- Tryck på standby-knappen på flödescytometerns och fortsätt med kalkylblads inställningarna i programvaran.
- Använd verktyget polygon Gate för att definiera CELLERNA population i FSC-A kontra SSC-en tomt och Rectangle Gate -verktyget för att definiera Singlecells -populationen i DAPI-W kontra DAPI-a Plot. Tryck på CTRL + G nycklar för att visa populationshierarkin och klicka på standardgrind namnen för att byta namn på dem.
- Därefter högerklickar du på alla histogram och välj Visa populationer | SingleCells från snabbmenyn.
- Optimera detektorspänningarna för de antikroppkopplade fluoroforerna för att täcka hela det dynamiska omfånget genom att därefter förvärva kontroll och behandlade prover. Maximera signal-brus-förhållandet och Undvik detektormättnaden. Kontrollera att Alexa488-toppen i Singlecells -populationen varken trunkeras i kontrollen eller det behandlade provet.
- Tryck på standby-knappen på flödescytometerns och eventuellt utföra steg 4.11.1-4.11.3 i kalkylbladsfönstret i programvaran för att få en grov uppskattning av behandlingseffekter under prov förvärvet.
- Välj Singlecells i populationshierarkin och Använd verktyget Rectangle Gate för att definiera G1-populationen i DAPI-W kontra DAPI-A-Plot. Högerklicka på histogrammet Alexa488 och välj Visa populationer | G1 från snabbmenyn.
- Högerklicka på histogrammet Alexa488 och välj skapa statistikvy på snabbmenyn. Högerklicka i vyn statistik och välj Redigera statistikvy. Gå till fliken statistik och aktivera kryssrutan för medianvärdet för Alexa488 signalen i G1-populationen (avaktivera alla andra alternativ).
- Välj Singlecells i populationshierarkin och Använd verktyget intervall grind för att definiera populationerna subG1, M och Casp3 + i DAPI-a, Alexa555-a (Cy3-a i figur 1) och Alexa647-en histograms.
- Tryck på Run -knappen på flödescytometerns och mät proverna med hjälp av förvärvs översikten i programvaran. Ställ in stopp porten på alla händelser eller cellerna Gate (om många små partiklar finns) och antalet händelser att spela in till 10 000.
- Klicka på Nästa rör för att skapa ett nytt exempel, Byt namn på det i webbläsarfönstret, klicka på Hämta data för att starta förvärvet och registrera data för att starta inspelningen.
- Välj fil | Export | Experiment från menyraden och välj katalog export i dialogrutan för att spara data som '. FCS '-filer. Du kan också spara experimentet som en extra zip-fil om du vill aktivera återimportera experimentet vid en senare tidpunkt.
Anmärkning: Installationen av befintliga experiment kan enkelt återanvändas med Edit | Duplicera utan data.
5. utvärdering av uppgifter
- Dra och släpp '. FCS '-filerna till exempel bläddraren för flödescytometriska analysprogram varan (se tabell över material). Tillämpa den gating strategi som visas i figur 2. Se till att grindarna passar till motsvarande population i alla prover innan du fortsätter med nästa dotter grind.
- Om du vill tillämpa ändringar på alla exempel markerar du den ändrade porten i exempel bläddraren, kopierar den genom att trycka på CTRL + C, markerar den överordnade porten, trycker på CTRL + SKIFT + E för att välja motsvarande noder i alla exempel och trycker på CTRL + V för att klistra in eller skriva över grinden. Använd inte grupp grindar.
- Dubbelklicka på det första exemplet i webbläsaren för att öppna SSC-A vs. FSC-A Plot. Använd polygonverktyget i verktygsfältet för att definiera cellerna population (figur 2, tomt 1), exklusive skräp från analysen. Se till att grinden är tillräckligt bred mot det övre högra hörnet för att rymma behandlingsrelaterade Skift, men begränsa gränsen mot det nedre vänstra hörnet av tomten för att tillförlitligt utesluta cellen.
- Dubbelklicka på cellen Gate för att öppna ett nytt tomt fönster och ändra axlarna till DAPI-W (vertikal) vs. DAPI-a (horisontell) genom att klicka på axeletiketterna. Använd rektangelverktyget för att definiera singlecells -populationen (figur 2, Plot 2), exklusive cell dubbletter eller klumpar från analysen (dubbletter av G1-celler har samma DAPI-A-intensitet som G2 och M-celler, men en betydligt högre DAPI-W värde).
Anmärkning: Varierande antal celler i olika prover kommer att orsaka förändringar i den övergripande DAPI-en signalstyrka på grund av jämvikts bindning av DAPI till DNA. Detta kommer inte att påverka cell cykel analysen, men det kan vara nödvändigt att justera den högra gränsen för Single cell Gate-provet med prov för att redovisa dessa SKIFT. - Dubbelklicka på Singlecells -porten för att öppna ett nytt tomt fönster och ändra axlarna så att DAPI-a-histogrammet visas. Använd Bisector -verktyget för att särskilja enstaka celler med normal DNA-halt (cellcykelpopulation ) från apoptotiska celler med degraderad DNA (subG1 population). Välj därefter de nya portarna i webbläsaren och tryck på CTRL + R för att byta namn på dem i enlighet med detta (figur 2, Plot 3).
- Välj cell Cycle Gate i webbläsaren och välj verktyg | Biologi | Cell cykel... från menyraden för att öppna verktyget cell cykel modellering. Välj Dean-Jett-Fox25,26 i den modell avsnitt för att uppskatta frekvensen av celler i G1, S och G2/M fas (figur 2, Plot 4). Använd begränsningar endast vid dåliga modellerings prestanda (minimera den genomsnittliga kvadratavvikelsen mellan modellen och data).
- Skapa grindar för G1 (Ellipse Tool), S (polygon Tool) och G2 + M (Ellipse Tool) fas i DAPI-W vs. DAPI-en sammansvärjning av cellcycle populationen för att aktivera cell cykelspecifika γh2ax-mätningar ( Figur 2, diagram 5). Använd inte modellerings verktyget för automatisk cell Cycle gating baserat på DAPI-A histogram, eftersom detta kan vara felaktiga.
Anmärkning: Det kan vara nödvändigt att flytta portarna längs DAPI-A-axelprovet genom att ta prov för att redovisa de ovan nämnda förskjutningarna i total DAPI-signalstyrka. Bara flytta de tre portarna som en grupp och inte ändra formen på enskilda grindar för att undvika bias. - Använd verktyget Bisector för att skilja fosho-Histone H3-positiva (m) och-negativa (m-) celler i Alexa555-ett histogram över cellcycle befolkningen (figur 2, Plot 6). Håll ned CTRL och välj portarna G2 + m och m-. Tryck på CTRL + Skift + A för att skapa G2 -porten (G2 + m & m-).
- Använd verktyget Bisector för att särskilja caspase-3-positiva (Casp3 +) och-negativa (Casp3-) celler i Alexa647-ett histogram över singlecells -populationen (figur 2, diagram 7). Ställ in tröskeln så att genomsnittet av Casp3 + befolkningen i de obehandlade kontrollerna uppgår till ~ 0,8% för att säkerställa hög känslighet och minimera assay-till-assay variationer.
- Tryck på CTRL + T för att öppna tabell redigeraren och konfigurera den enligt figur 3. Dra och släpp de olika populationerna från exempel bläddraren till tabell redigeraren och dubbelklicka på raderna för att ändra statistik, parameter och namn inställningar. Ta bort onödiga rader som läggs till automatiskt efter dra och släpp av cellen cykel modellering ikonen genom att välja rader och trycka på del.
- Välj till fil, format och mål i utdatadelen av menyfliken och klicka på Skapa tabell för att exportera data som ". xlsx"-fil.
- Använd tabell beräkningsprogramvara (se tabell över material) för ytterligare dataanalys enligt kompletterande fil 1 (FACS_Analysis_Template_ (1). xlsx).
- Korrigera cellernas frekvenser i de olika cell cykel faserna så att deras summa uppgår till 100% genom att använda formeln X ' = X * 100/Σ (alla cell cykel faser), med X ': korrigerat värde, X: RAW-värde, till varje cell cykels fas.
Anmärkning: Avvikelser från en summa på 100% uppstår på grund av felaktigheter i cellcykelns modellering, men är vanligtvis små (< 5%). - Normalisera median γH2AX-intensiteterna till DNA-halten i de olika cell cykel faserna genom att dividera värdena i S-fasen med 1,5 och i G2 och M-fasen med 2,0.
- För att beräkna den kombinerade normaliserade γH2AX-nivån i hela cellpopulationen, Använd formeln IA = iG1 * G1 + is * s + iG2 * G2 + im * m, där jagA, jagG1, jagS, jagG2, jagM är normaliserade median γH2AX intensiteter av alla, G1, S, G2, M celler respektive och G1, S, G2, M korrigeras frekvensen av celler i respektive cell cykel fasen.
- För de normaliserade γH2AX-nivåerna och frekvensen av subG1-och caspase-3-positiva celler subtrahera du medelvärdet av de obehandlade kontrollerna från varje prov.
- Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för varje parameter från alla replikprover och rita upp resultaten i diagram.
- Korrigera cellernas frekvenser i de olika cell cykel faserna så att deras summa uppgår till 100% genom att använda formeln X ' = X * 100/Σ (alla cell cykel faser), med X ': korrigerat värde, X: RAW-värde, till varje cell cykels fas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mänskliga U87 eller LN229 glioblastoma celler bestrålades med 4 Gy av fotonen eller kol Jon strålning. Cell cykelns specifika Γh2axnivåer och apoptos mättes vid olika tidpunkter upp till 48 h efter bestrålning med hjälp av den flödescytometriska metod som presenteras här (figur 3). I båda cellinjer inducerade kol joner högre γH2AX-toppnivåer som sjönk långsammare och förblev signifikant förhöjda vid 24 till 48 h jämfört med fotonstrålning vid samma fysiska dos (figur 4A). Detta indikerade att kol joner inducerade högre topp nivåer av DNA dubbel-strand raster (DSBs) än fotoner som reparerades mindre effektivt. För båda strålnings typerna var Γh2axnivåerna högst i G1-celler, förmodligen eftersom DSB-reparation är begränsad till vägen för icke-homolog sammanfogning i detta skede av cellcykeln.
I linje med högre DSB induktions hastighet och långsammare reparation kinetik, kol joner inducerade en starkare och mer långvarig cellcykelarrest i G2 fas (figur 3B) och en högre frekvens av apoptos än fotoner (figur 4C). Kol Jon strålning kan därför bidra till att övervinna radioresistens mekanismer observerats i glioblastoma på klassisk strålbehandling med fotoner (se Lopez Perez, et al.1 för detaljerad diskussion).
Resultaten som visas i figur 4 är exempel på ett optimalt resultat av denna metod, som visar tydliga skillnader mellan obehandlade och bestrålade celler och statistiskt signifikanta differential effekter mellan olika behandlingar. I fall där induktion av DSBs och apoptos är mindre tydlig, är det viktigt att inkludera positiva kontroller. Som visas här, celler fast 1 h efter fotons bestrålning är bra positiva kontroller för γH2AX induktion. Fotonstrålning är också känt för att effektivt inducera apoptos i lymfocyter, vilket gör dem användbara som positiva kontroller för apoptos 2-4 dagar efter bestrålning. En annan möjlighet är att använda läkemedel för apoptos induktion, såsom proteasom hämmare MG132 eller en död receptor ligand (figur 5).
En annan viktig aspekt för ett optimalt resultat av analysen är kvaliteten på cell cykel profilerna. I figur 4B var G1 och G2-topparna smala och tydligt separerade, vilket gör det enkelt att tillämpa cell cykel modellering och att definiera portarna för cell-cykelspecifik mätning av γh2ax. Beroende på celltyp och styrkan i behandlingseffekten (figur 6A, B) kan upplösningen av de olika cell cykel faserna vara betydligt sämre. I vissa fall har DAPI-koncentrationen en stor inverkan på cellens cykel profils kvalitet och behöver justeras (figur 6C). I de fall där ingen klar G1-topp är detekterbar på grund av behandlingen kan modellerings verktyget för cellcykeln inte appliceras korrekt. Det är lämpligt att sedan endast använda manuell gating i DAPI-A kontra DAPI-W tomt baserat på kontroller med en väldefinierad cell cykelprofil, som beskrivs i protokollet.
Analysen av en cell cykelprofil utan en tydlig G1-topp kan kompliceras ytterligare om behandlingen leder till låga cell tal som leder till stora förändringar i den totala DAPI-signalstyrkan. I denna situation kan det vara svårt att bedöma, om en topp är G1 eller G2 Peak. För att undvika detta problem kan cellerna räknas med en Neubauer-kammare eller på annat sätt efter det sista tvättsteget (steg 3,3) och cellnumren kan justeras. Topp positionerna i de behandlade cellerna kommer då att matcha med kontrollerna.
Figur 1 : Kalkylblads inställningar för exempel anskaffning. Tomter och grindar för signal visning i kalkylbladsfönstret i flödescytometern (se tabell över material). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Gating strategi för datautvärdering. Befolknings träd och diagram som visar hur grindarna är inställda på att definiera de olika delpopulationerna i flödescytometriska analysprogram varan. Djf hänvisar till cell Cycle modellering verktyg med hjälp av Dean-Jett-Fox metod25,26. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Export tabell för rådata. Inställning av "Table Editor" för RAW-dataexport i flödet kors analysprogramvara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : DNA-skadesvar av mänskliga U87 och LN229 glioblastoma celler efter bestrålning med 4 Gy av fotonen kontra kol Jon strålning. A) DSB-induktion och-reparation mätt med Γh2axnivåer. Median fluorescensintensiteten normaliserades till relativ DNA-halt i varje cell cykels fas (G1 = 1,0, S = 1,5, G2 = 2,0) och kontrollnivåerna subtrafördes. Symboler indikerar medelvärden och felstaplar indikerar SD-värden. Heldragna linjer motsvarar passningar enligt funktion I (t) = (P1 * t ² + P2 * t)/(t ² + Q1 * t + Q2) | t ≥ 0, P1 < 0, P1, Q1, Q2 > 0. B) cell cykels fördelning (medelvärde och SD) och representativa HISTOGRAM av DNA-innehållsmarkörens DAPI vid 24 timmar efter fotons-eller kol Jon bestrålning. C) apoptos induktion, mätt med kaspas-3 och subG1 positiva celler (medelvärde och SD). * P < 0,05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001 (tvåsidig students t-test). Denna siffra har modifierats från Lopez, et al.1 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Läkemedelsmedierad apoptos-induktion i U87 glioblastoma celler. U87 celler behandlades med 5 ng/mL av en modifierad TNF-relaterad apoptos-inducerande ligand (se tabell över material) plus 2,5 μm MG132 för 20 h före fixering för att validera apoptos mätning genom aktiv caspase-3 och subG1 analys. (A) histogram över den kaspas-3 signalen av behandlade kontra obehandlade celler. BDAPI-histogram över behandlade celler med en subG1 population som indikerar DNA-nedbrytning. Histogrammet av Caspas-3-positiva händelser överlagras i rött, visar att de flesta av de apoptotiska cellerna ännu inte hade degraderat deras DNA vid denna tidpunkt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Faktorer som påverkar kvaliteten på cell cykel profilerna. För hårda behandlingar komplierar cell cykel analys. (A) ingen G1 Peak är detekterbar 48 h efter behandling av LLC-celler (Lewis lungcancer) med 20 Gy av fotonstrålning eller (B) 96 h efter behandling av HS68 fibroblaster med 100 MJ av UV-strålning. C) DAPI-koncentration i olika cellinjer: i HS68 fibroblaster (övre panelen) var G2/M-toppen (se pilar) lika Välseparerad från G1-toppen för DAPI-koncentrationer mellan 0,01 och 1,0 μg/ml. Däremot resulterade DAPI-koncentrationer under 0,75 μg/mL i dålig separation och form definition av G2/M-toppen (se pilar) i MRC-5 fibroblaster (nedre panelen). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: typisk flödes flödescytometerns-konfiguration. λ = våglängden för magnetiseringslasern, U = detektorns spänning, log = logaritmisk skala (annars linjär),-A = signal område,-H = maximal signal höjd,-W = signal bredd (varaktighet), FSC = front Scatter, SSC = sido scatter. Optiska filterspecifikationer ges som central våglängd/bandbredd i nanometer. Inställningarna kan variera för olika flödescytometrar och detektor spänningar måste justeras för olika cellinjer.
Kompletterande figur 1: mikroskopiska bilder av γH2AX Foci. U87 celler bestrålades med olika doser av fotonstrålning, fast och färgas efter 30 min enligt det presenterade protokollet och förberett för mikroskopi som beskrivs i diskussionen. Vid 2 Gy, kan enskilda Foci lätt särskiljas, medan vid 8 Gy Foci räkna var partisk på grund av betydande överlappning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den skisserat metod är lätt till använda och erbjudande en fort, exakt och reproducerbar mättning om DNA skada svaren inklusive dubbel-strand bryta (DSB) induktion och reparera, cell cykel verkningen och apoptotiska cell död. Kombinationen av dessa slutpunkter ger en mer fullständig bild av deras inbördes relationer än enskilda analyser. Metoden kan tillämpas i stor utsträckning som en omfattande genotoxicitetstest inom områdena strålningsbiologi, terapi och skydd, och mer allmänt i onkologi (t. ex. för bedömning av miljö riskfaktorn, läkemedels screening och utvärdering av genetiska instabilitet i tumörceller).
Det mest kritiska steget i detta protokoll är fixering av cellerna. För att få ett rent prov med en klart definierad cellpopulation och optimal upplösning av olika cell cykel faser, är det viktigt att ge anhängare celler tillräckligt med tid för att lossa från odlings kärlet och bilda en helt rund form. Cellerna ska överföras till fixeringslösningen som en enda cellsuspension utan cell klumpar. För att separera dem måste cellerna pipetteras upp och ner eller passera genom en fin nål flera gånger i svåra fall. Fixeringstid bör hållas konstant mellan alla prover och bör inte överstiga 20 min inklusive tiden för centrifugering före resuspension av cellerna i 70% etanol. Långvarig fixering kommer att leda till förlust av tillgängliga epitoper för antikroppsbindning och kommer att minska signalstyrkan och känsligheten hos metoden.
Den viktigaste begränsningen av tekniken är att den inte ger information om kvaliteten på γH2AX Foci annat än intensiteten i hela kärnan. Särskilt stora γh2ax-Foci samt förekomsten av en pannukleär γh2axfärgning har kopplats till klustrade DSBs1,27,28,29, som är mycket komplexa lesioner som är mycket svåra att reparera30. Sådana klustrade lesioner verkar vara karakteristiska för partikel strålning såsom kliniskt tillämpad kol Jon strålning och kan vara orsaken till den överlägsna biologiska effektiviteten av tung Jon strålning jämfört med fotoner31,32 ,33. Analys av γH2AX Foci storlek kan därför vara av intresse som en indikator på skadan komplexitet. Även om det är möjligt att använda det nuvarande protokollet med en bildström flödescytometerns för att visualisera γH2AX Foci, kan den uppnåeliga upplösningen inte konkurrera med en klassisk mikroskopisk metod. Vi har dock framgångsrikt förberett mikroskopiska bilder från de återstående proverna efter flödescytometrisk mätning (kompletterande figur 1) och utvärderade flera funktioner inklusive γH2AX Foci Count, storlek och Pan-nukleär intensitet med hjälp av en semi-automatiserad avbildning och analyssystem. För att förbereda proverna för mikroskopi spreds 30-50 μL av de färgade cellerna över ytan på ett 24 mm x 24 mm täckglas, lufttorkad över natten vid rumstemperatur i mörker och bäddas sedan in med monteringsmedel på en glas rutschbana.
I jämförelse med mikroskopisk utvärdering av DSB nivåer av γh2ax Foci räkna, flödet kors mätningen är överlägsen i genomströmning, samplingsfrekvens, dynamiskt omfång och noggrannhet. Det dynamiska omfånget av mikroskopisk Foci räkna begränsas av den optiska upplösningen, vilket leder till oförmåga att skilja överlappande Foci29,34. I praktiken har vi observerat ett linjärt samband mellan stråldos och γH2AX Foci nummer under 2 Gy, och en stark mättnadseffekt över 2 Gy i U87 glioblastoma celler1. Intensiteten i γH2AX-signalen mätt med flödescytometri ökade däremot linjärt med dosen för hela det testade dosintervallet (0-8 Gy).
Noggrannheten av mikroskopiska Foci räkna begränsas av oförmåga att skilja mellan olika cellcykeln faser utan ytterligare Infärgningar35. Antalet DSBs induceras i en cell är inte bara beroende av strålningsdosen, men också på DNA-halten, och därmed cellcykeln skede. G2-celler har till exempel dubbelt så mycket DNA som G1-celler och det genomsnittliga antalet DSBs som induceras vid en viss strålningsdos är dubbelt så högt för G2-celler jämfört med G1. Detta återspeglas tydligt i γH2AX-signalintensiteten i G2 kontra G1-celler vid tidiga tidpunkter efter strålning mätt med flödescytometri. Därför är det viktigt att utvärdera DSB nivåer i en cell cykel-specifika sätt att få korrekta resultat. En poolad analys av celler i olika cellcykeln faser, som vanligt i mikroskopiska metoder, kan vara partiska av förskjutningar i cellcykeln distributionen särskilt på grund av strålning-inducerad G2 gripande. För att kunna redogöra för denna effekt och jämföra DSB-reparationsegenskaper mellan olika cell cykel stadier kan γH2AX-nivåerna enkelt normaliseras till DNA-halten i flödescytometrimetoden som anges i protokollet.
Förlängningar av detta protokoll är möjliga med relativt lite extra ansträngning. Ytterligare antikroppar med kompatibla fluorophores-etiketter kan inkluderas i steg 3,4 utan behov av några extra steg under prov preparationen. Om en mer detaljerad analys av apoptos önskas, caspase-7,-9 och-8 antikroppar kan inkluderas. Som en annan förlängning, har vi nyligen inkluderat en levande och död cell färgämne, en Troponin T antikropp och räkna pärlor i protokollet att specifikt analysera kardiomyocyter Co-odlade med fibroblaster efter bestrålning. Tillägget av levande/döda cell fläcken och räkna pärlor utökar förmågan hos metoden att inkludera fibroblast proliferation och icke-apoptotisk celldöd av kardiomyocyter som ytterligare endpoints som ger användbar ytterligare information om cellen öde efter genotoxisk stress. Det utökade protokollet finns tillgängligt på begäran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Flow Cytometry Facility team på tyska cancer Research Center (DKFZ) för deras stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1,000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| Folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
