Summary
Beskrevet er protokoller for den yderst effektive genomredigering af murine hematopoietisk stamceller og progenitorcellerne (HSPC) af CRISPR/Cas9 systemet til hurtigt at udvikle musemodel systemer med hæmatopoietiske systemspecifikke genmodificeringer.
Abstract
Manipulere gener i hæmatopoietiske stamceller ved hjælp af konventionelle transgenese tilgange kan være tidskrævende, dyrt, og udfordrende. Ved at drage fordel af fremskridt inden for genomredigerings teknologi og lentivirus medierede transgenleveringssystemer er en effektiv og økonomisk metode beskrevet her, der etablerer mus, hvor gener manipuleres specifikt i hæmatopoietiske stamceller. Lentivira bruges til at Trans Cas9-udtrykke Lineage-negative knoglemarvsceller med en guide RNA (gRNA) rettet mod specifikke gener og et rødt fluorescens reporter-gen (RFP), så disse celler transplanteres til letalt bestrålede C57BL/6-mus. Mus transplanteret med lentivirus udtrykker ikke-målretning gRNA anvendes som kontrol. Engraftment af transducerede hæmatopoietiske stamceller evalueres ved flow cytometrisk analyse af RFP-positive leukocytter af perifert blod. Ved hjælp af denne metode, ~ 90% transduktion af myeloide celler og ~ 70% af lymfoide celler ved 4 uger efter transplantation kan opnås. Genomisk DNA isoleres fra RFP-positive blodlegemer, og dele af det målrettede site DNA forstærkes af PCR for at validere genomredigeringen. Denne protokol giver en høj gennemløb evaluering af hæmatopoiesis-regulerende gener og kan udvides til en række muse sygdomsmodeller med hæmatopoietisk celle involvering.
Introduction
Mange undersøgelser i hæmatologi og Immunologi er afhængige af tilgængeligheden af genetisk modificerede mus, herunder konventionelle og betingede transgene/knock-out mus, der udnytter hæmatopoietiske system-specifikke CRE drivere såsom Mxcre, VAV-CRE, og andre 1,2,3,4,5. Disse strategier kræver etablering af nye muse stammer, som kan være tidskrævende og økonomisk byrde. Mens revolutionerende fremskridt i genomredigerings teknologien har muliggjort generering af nye muse stammer i så få som 3-4 måneder med den relevante tekniske ekspertise6,7,8,9 , er der brug for meget mere tid til at forstærke muse kolonien, før eksperimenter forfølges. Desuden er disse procedurer dyre. For eksempel, Jackson laboratorium lister den nuværende pris på knock-out mus generation tjenester på $16.845 per stamme (pr. december 2018). Således, metoder, der er mere økonomisk og effektiv end konventionelle murine transgene tilgange er mere fordelagtige.
Grupperet jævnligt hinanden korte palindromiske gentagelser/crispr Associated protein 9 (crispr/Cas9) teknologi har ført til udvikling af nye værktøjer til hurtig og effektiv RNA-baseret, sekvens-specifik genomredigering. Det blev oprindeligt opdaget som en bakteriel adaptiv immun mekanisme til at ødelægge invaderende patogen DNA, CRISPR/Cas9-systemet er blevet brugt som et redskab til at øge effektiviteten af genomredigering i eukaryotiske celler og dyremodeller. En række tilgange har været anvendt til at overføre CRISPR/Cas9 maskiner til hæmatopoietiske stamceller (dvs., elektro poration, nukleofection, lipofection, viral levering, og andre).
Her er et lentivirus system ansat til at transduce celler på grund af dets evne til effektivt at inficere Cas9-udtrykker murine hæmatopoietiske stamceller og pakke sammen guide RNA udtryk konstruere, initiativtagere, lovgivningsmæssige sekvenser, og gener, der indkode fluorescerende reporter proteiner (dvs. GFP, RFP). Ved hjælp af denne metode, ex vivo gen redigering af mus hæmatopoietiske stamceller er blevet opnået, efterfulgt af vellykket rekonstitution af knoglemarv i letbestrålede mus10. Den lentivirus vektor, som er ansat i denne undersøgelse, udtrykker Cas9-og GFP reporter-generne fra Common Core EF1a-promotoren med et internt ribosomale indgangssted opstrøms fra reporter-genet. Guide-RNA-sekvensen udtrykkes fra en separat U6-promotor. Dette system bruges derefter til at skabe indsættelse og sletning mutationer i kandidat klonal hematopoiese driver gener Tet2 og Dnmt3a10. Imidlertid er transduktiviteten ved denne metode forholdsvis lav (~ 5%-10%) på grund af den store størrelse af vektor indsatsen (13 KBP), der begrænser transduktiviteten og reducerer virus titer under produktionen.
I andre undersøgelser, det har vist sig, at større viral RNA størrelse negativt påvirker både virus produktion og transduktivitet effektivitet. For eksempel, en 1 kb stigning i Indsæt størrelse er rapporteret at reducere virus produktion af ~ 50%, og transduktivitet effektivitet vil falde til mere end 50% i mus hæmatopoietiske stamceller11. Således er det fordelagtigt at reducere størrelsen af den virale indsats så meget som muligt for at forbedre effektiviteten af systemet.
Denne mangel kan overvindes ved at ansætte Cas9 Transgene mus, hvor det Cas9 protein udtrykkes i enten en konstitutiv eller inducerbar måde12. De konstitutive crispr/Cas9 Knock-in-mus udtrykker Cas9 endonuklease og egfp fra CAG-promotoren på Rosa26 locus på en allestedsnærværende måde. Således kan en konstruktion med sgrna under kontrol af U6 promoter og RFP reporter-genet under kontrol af Core EF1a Promoter leveres ved hjælp af lentivirus-vektoren for at opnå genom-redigering. Med dette system, generne af hæmatopoietiske stamceller er blevet redigeret med succes, viser en ~ 90% transduktionseffektivitet. Således, denne protokol giver en hurtig og effektiv metode til at oprette mus, hvor målrettede genmutationer indføres i det hæmatopoietiske system. Mens vores laboratorium overvejende bruger denne type teknologi til at studere rollen som klonal hematopoiese i hjerte-kar-sygdomme processer13,14,15, det gælder også for undersøgelser af hæmatologiske malignitet16. Desuden kan denne protokol udvides til at omfatte en analyse af, hvordan DNA-mutationer i HSPC påvirker andre sygdoms-eller udviklingsmæssige processer i det hæmatopoietiske system.
At etablere en robust lentivirus vektorsystem, høj titer virale bestande og optimerede betingelser for transduktion og transplantation af hæmatopoietiske celler er påkrævet. I protokollen gives der instruktioner om fremstilling af en høj titer viral bestand i afsnit 1, optimering af dyrkningsbetingelserne for murine hæmatopoietiske stamceller i afsnit 2, metoder til knoglemarvstransplantation i afsnit 3, og vurdering af i afsnit 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyreforsøg, er blevet godkendt af Udvalget for institutions dyreomsorg og-anvendelse (IACUC) ved University of Virginia.
1. produktion og rensning af lentivirus partikler
Bemærk: lentivirus partikler, der indeholder den optimerede guide RNA kan produceres af de detaljerede protokoller, der leveres af Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. Optimerede metoder til højtiter lentivirus forberedelse og opbevaring diskuteres andetsteds17,18. Kort fortalt produceres lentivira ved co-transfection af en lentivirus vektor plasmid, psPAX2, og pMD2. G i HEK 293T celler. Kultur supernatanten er indsamlet ved 48 h post-transfection og koncentreret ved ultracentrifugering. Lentiviral titer bestemmes af en kommercielt tilgængelig qPCR-baseret analyse. Denne procedure skal udføres i et kabinet af biosikkerheds klasse II.
- Forbered en 1:200 opløsning af kollagen (0,0005%) i 1x PBS.
- Frakke en 6 brønd plade med kollagen opløsning og inkubere ved 37 °C, 5% CO2 for ~ 30 min.
- Frø 293T celler ved en densitet på 1 x 106 celler pr brønd og inkubere ved 37 °c, 5% Co2 for ~ 2 h.
- For at forberede blandingen af tre transfektering plasmider for en brønd, kombinere 0,9 μg lentivirus vektor, 0,6 μg af psPAX2, og 0,3 μg pMD2. G, derefter opnå en samlet volumen på 10 μl ved tilsætning af deioniseret vand. Juster beløbene i overensstemmelse hermed afhængigt af antallet af brønde. Mængden og forholdet af hver plasmid kan være nødvendigt at blive yderligere optimeret til at passe til forskerne behov.
- Tilsæt forsigtigt 50 μL 1x PBS og 5 μL af den fortyndede PEI MAX (1,0 mg/mL) til plasmid-blandingen, og Inkuber i 15 min ved stuetemperatur (RT) (tabel 1).
- Tilsæt 1 mL DMEM til blandingen.
- Aspirér medier fra 6 brønd pladen, tilsæt 1 mL plasmid-blanding, og Inkuber ved 37 °C, 5% CO2 for ~ 3 timer.
- Udskift mediet med 2 mL frisk DMEM og Inkuber ved 37 °C, 5% CO2 i 24 timer.
- Der tilsættes 1 mL frisk DMEM og Inkubér ved 37 °C, 5% CO2 i yderligere 24 timer (samlet inkubattid er 48 h).
- Overfør kultur supernatanten til et 50 mL rør og centrifugeres ved 3.000 x g i 15 minutter for at fjerne alle frie svævende celler.
- Supernatanten filtreres gennem et 0,45 μm filter.
- Filtratet overføres til centrifugeglas af polypropylen.
- Ultracentrifuge ved 4 °C og 72.100 x g ved rMaks i 3 timer.
- Forsigtigt aspirere supernatanten, efterlader den hvide pellet.
- Resuspension pellet med 100 μL serum-fri hæmatopoietisk celle ekspansion medium uden beluftning.
- Der skal være 10 μL alikvot til måling af viral titer, og alle resterende aliquoter opbevares ved-80 °C, indtil det er nødvendigt.
- Virusset skal titreres med en qPCR-baseret analyse i henhold til fabrikantens anvisninger ved hjælp af den virale alikvot på 10 μL.
2. isolering og transduktion af Lineage-negative celler fra mus knoglemarv (figur 1a)
Bemærk: typisk, at isolere nok celler, par af tibias, femurs, og doser høstes fra hver mus. Bækken og rygmarvs knogler kan også høstes som en kilde til Lineage-negative celler.
- Isolering af knoglemarvsceller
- Euthanize 8-10 uge gamle mandlige crispr/Cas9 Knock-in mus med 5% isofluran efterfulgt af livmoderhals dislokation, derefter desinficere deres hud med 70% ethanol.
- Brug dissekere saks, lave en tværgående indsnit i huden lige under ribburet og skræl huden fikseres i begge retninger for at udsætte benene og armene.
- Adskil forsigtigt de nedre lemmer fra hofte knoglen ved at afplacere hofteleddet. Skær langs femur hovedet for at fjerne femur helt fra hoften. Affind knæet og skær ved leddet for at adskille femur og skinneben, samtidig med at knogle epiphysen bevares intakt. Affind ankelleddet og skræl foden og ekstra musklen væk.
- Brug dissekere saks, skåret over skulderen for at løsne de øvre lemmer. Affind skulderen, og skær derefter på albuen leddet for at høste humerus knoglen.
- Brug cellulose-fiber klude til forsigtigt at fjerne muskler fra femurs, tibias, og humeri. Tag ekstra forholdsregler for at sikre, at knoglerne ikke bryder i løbet af denne proces.
- Placer de isolerede knogler i et 50 mL konisk rør, der indeholder RPMI, og Placer på is.
Bemærk: følgende trin skal udføres i et kabinet af biosikkerheds klasse II. - Overføre knoglerne til en steril, 100 mm kultur skål.
- Tag fat i knoglen med stumpe pincet, og brug dissekere saks, omhyggeligt skære begge epiphyses.
Bemærk: en utilstrækkelig skæring vil føre til en ufuldstændig flush af knoglemarven, mens overdreven aggressiv skæring vil resultere i celletab. - Fyld en 10 mL sprøjte med iskold RPMI, og brug en 22 G nål til at skylle knoglemarven fra akslen til en ny 100 mm kulturfad.
Bemærk: knoglerne bliver hvide og gennemsigtige, hvis knogle akslen er velskyllet. Hvis ikke, re-cut knoglen ender og skyl igen. - Efter alle knoglemarven er blevet indsamlet, lav en enkelt cellesuspension ved at passere knoglemarven flere gange gennem en 10 mL sprøjte med en 18 G nål. Gentag 10x for at sikre en enkelt cellesuspension.
- Filter cellesuspension gennem en 70 μm celle sien i et 50 mL konisk rør.
- Centrifugeres ved 310 x g i 10 minutter ved 4 °c.
- Aspirér supernatanten og resuspender celle pillerne i et passende volumen af optimeret separations buffer til følgende celle separationsproces.
- Isolering og lentivirus transduktion af Lineage-negative celler
Bemærk: mus Lineage-negative celler er isoleret fra knoglemarven af Cas9 Transgene mus3, eller andre stammer af mus, ved hjælp af en Lineage udtømning kit i henhold til producentens anvisninger. Typisk, Lineage-negative celler tegner sig for 2%-5% af hele knoglemarvs nukleerede celler, og renheden er normalt større end 90% efter isolation. De isolerede Lineage-negative celler dyrkes i serum-fri hæmatopoietisk celle ekspansions medium suppleret med 20 ng/mL rekombinant murine TPO og 50 ng/mL rekombinant murine SCF, derefter transduceret med lentivirus vektor for 16 h på en multiplicitet af infektion (MOI) = 100.- For at isolere Lineage-negative celler, skal du bruge Lineage Cell depletationssæt i henhold til producentens anvisninger.
- Efter isolation resuspension Lineage-negative celler i 1 mL serum-fri hæmatopoietisk celle ekspansion medium.
- Frø cellerne i en 6 brønd plade ved en tæthed på 1,5 x 106 celler/ml (5 x 105 Lineage-negative celler/mus.)
- Tilsæt rekombinant murine TPO og SCF til brønde i endelige koncentrationer på henholdsvis 20 ng/mL og 50 ng/mL.
- Præ-incubate celler ved 37 °C i 5% CO2 for ~ 2 h.
- Tilsæt lentivirus på MOI = 100, 4 μg/mL polybrene, og penicillin/streptomycin til brøndene og inkubatet ved 37 °C, 5% CO2 for 16-20 h (figur 1b).
- På den følgende dag opsamles lentivirus transducerede celler i et 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 300 g i 10 min.
- Aspirér forsigtigt supernatanten, og resuspender pellet i 200 μL RPMI pr. mus. Opbevar cellerne ved RT indtil transplantation til mus (afsnit 3).
3. transplantation af transducerede celler til dødeligt bestrålede mus
- På dagen for knoglemarvstransplantation, placere modtager mus i en otte-skive pie bur og udsætte dem for to doser af hele kroppen bestråling (550 rad/dosis, total dosis = 1100 rad), med ca 4 h mellem hver bestråling session.
- Efter den anden bestrålings session indsprøjtes transducerede Lineage-negative celler til hver bedøvet modtager mus via retroorbital vene plexus (200 μL i alt) ved hjælp af en insulin sprøjte (figur 1c).
- Efter bestråling bør mus være anbragt i steriliserede bure og forsynet med en blød diæt og drikkevand suppleret med antibiotika til 14 d.
- Ved 3-4 uger efter knoglemarvstransplantation analyseres perifert blod for at kontrollere for engraftment af transducerede donorceller (punkt 4).
4. evaluering af chimerismen af perifert blod
- Anæstetize mus med 5% isofluran og få en blodprøve fra en retroorbital vene ved hjælp af kapillar rør, og Saml den i K2EDTA-rør (volumenet i et kapillar rør er tilstrækkeligt til følgende analyse).
- 20 μL blod fra K2EDTA rørene overføres til de 5 mL runde bund polystyren reagensglas og sættes på is.
- Tilsæt 1,5 mL RBC lysis-buffer til at lyserøde blodlegemer. Inkuber i 5 min på is.
- For at neutralisere lysis-bufferen skal prøverne vaskes med FACS-buffer (1,5 mL/prøve).
- Centrifuge ved 609 x g ved rMax i 5 min ved 4 °c. Kassér supernatanten.
- Cellerne inkubates med en cocktail af monoklonale antistoffer (fortyndet i 100 μL FACS buffer/prøve) ved RT i 20 minutter i mørke. En komplet liste over antistoffer findes i afsnittet materialer ovenfor.
- Cellerne vaskes én gang med FACS-buffer (2 mL/prøve). Centrifugeres ved 609 x g ved rMax (1.800 rpm) i 5 minutter ved 4 °c. Kassér supernatanten helt.
- Cellerne fikseret med PARAFORMALDEHYD indeholdende fikserings buffer (100 μL/tube) i 10 minutter ved 4 °C.
- Vask cellerne én gang med FACS buffer (3 mL/prøve). Centrifugeres ved 609 x g ved rMax (1.800 rpm) i 5 minutter ved 4 °c. Kassér supernatanten helt.
- Stop pellet i 400 μL FACS buffer.
- Prøverne opbevares ved 4 °C indtil analyse ved strømnings cytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol er der opnået ca. 0,8-1,0 x 108 knoglemarvsceller pr. mus. Antallet af Lineage-negative celler, vi opnår, er ca. 3 x 106 celler pr. mus. Typisk er udbyttet af knoglemarv Lineage-negative celler 4%-5% af den samlede knoglemarv nukleare celler.
Chimerisme af transducerede celler (RFP-positive) evalueres ved strømnings cytometri af det perifere blod (figur 2a,B). Blodet isoleres fra retroorbital vene, og passende markører anvendes til at bestemme identiteten af hver hæmatopoietisk cellepopulation (dvs. neutrofiler, monocytter, T-celler osv.) (Figur 3a,B). Genomisk DNA kan isoleres fra RFP-positive blodlegemer, og sektioner af den målrettede site DNA kan forstærkes af PCR og subklonet i TA kloning vektorer for Sekvensanalyse. Disse plasmider er transduceret ind i E. coli og målstedet sekvenser bestemmes af sanger sekvensering (figur 4). Alternativt kan målwebsteds sekvenser bestemmes ved andre metoder, såsom sanger sekvensering af det poolede genom efterfulgt af sporing af indels ved nedbrydning (TIDE) analyse10. For kontroltilstanden, er mus typisk transplanteret med celler, der er transduceret med en lentivirus udtrykker ikke-målretning guide RNA.
Figur 1: skematisk illustration af denne protokol. a) isolering af Lineage-negative knoglemarvsceller fra Cas9-udtrykte mus (punkt 2,1). B) lentivirus-transduktion af Lineage-negative celler (afsnit 2,2). C) retroorbital injektion af transducerede celler til dødeligt bestrålede vildtype-mus (afsnit 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: effektiv lentiviral transduktion af muse knoglemarvs Lineage-negative celler in vitro. A) flowcytometri-analysen afslører en vellykket transduktion af Lineage-negative celler. Analyse blev udført efter 7 dages in vitro-kultur. B) i gennemsnit blev 75,7% af cellerne transduceret i denne analyse (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:rekonstitution af letalt bestrålet mus knoglemarv ved transducerede Lineage-negative celler. (A) flow cytometri analyse af mus perifert blod efter rekonstitution ved hæmatopoietiske stamceller, der var (bund) eller ikke var (top) transduceret med lentivirus udtrykker RFP. Neutrofiler er defineret som Ly6G+ og Ly6CHi monocytter som Ly6G-og Ly6C+, og B- celler som CD45R+. B) i disse undersøgelser er et gennemsnit på 94,8%, 93,5% og 82,7% af cellerne RFP + i henholdsvis neutrofile, Ly6CHi monocyte og B- cellepopulationer (n = 8). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:evaluering af genredigering i transducerede blodlegemer. (A) eksempel på Genredigering, der viser sekvensering resultater af muteret Dnmt3a locus i RPF-positive blodlegemer. Sletninger vises som røde streger, og indsættelser er angivet med røde bogstaver. B) sammenfatning af de fundne mutationer. (C) 69% (11/16 kloner) viste ud-af-frame/for tidlig stop mutationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Plasmid | Størrelse (BP) | Mængde pr. brønd (μg) | Forhold |
| pLKO 5.0 | 7700 | 0,9 | 2 |
| psPAX2 | 10668 | 0,6 | 1 |
| pMD2. G | 5822 | 0,3 | 1 |
| PEI-Max (bestand: 100 mg/mL) | 5 μL/brønd | ||
Tabel 1: mængder af plasmid og PEI-Max, der anvendes til transfection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordelen ved denne protokol er skabelsen af dyremodeller, der harkedeligt specifikke mutationer i hæmatopoietiske celler på en hurtig og meget omkostningseffektivmåde i forhold til konventionelle mus transgene tilgange. Det blev konstateret, at denne metode muliggør generering af mus med hæmatopoietiske celle genmanipulationer inden for 1 måned. Der er flere kritiske trin i denne protokol, der kræver yderligere overvejelse.
Screening af gRNA sekvens
Det anbefales at teste gRNAs in vitro for at vurdere redigerings effektivitet før udførelse in vivo eksperimenter. Effektiviteten af gRNAs testes ved hjælp af en celle-fri in vitro transskription og screening system. Den transkriberede gRNA valideres ved at måle dens effektivitet ved at cleare Template DNA i nærværelse af rekombinant Cas9 protein, ved hjælp af agrose gel elektroforese. Kommercielt tilgængelige kits er til rådighed til dette formål.
Her er Indel mutationer karakteriseret ved TA kloning af PCR produkter forstærkes fra redigeret region, omdanne bakterieceller med disse plasmider, og picking up individuelle kolonier for sanger sekvensering. Men denne metode er omstændelig og tidskrævende. Alternativt kan næste generations sekvensering (NGS) eller samlet DNA-sekvensering efterfulgt af TIDEVANDS analyse udføres19. TIDEVANDS algoritmen blev oprettet for at analysere sanger sekvens spor genereret fra komplekse prøver. Det har vist sig, at Indel-estimater med TIDE vand typisk er i overensstemmelse med de ikke-målrettede NGS20. Den analytiske software er tilgængelig online på < http://tide.NKI.nl >.
Generation af High-titer lentivirus partikler
Den virale vesikulære stomatitis virus G-protein, som er afgørende for celle infektion, er meget pH-følsom. Det er derfor vigtigt at holde kulturmediet inden for et acceptabelt pH-interval, og det bør ikke udvikle et gulligt udseende. Kollagen-belagte retter til virus generation er ansat, fordi det accelererer fastgørelse af HEK293T celler og tillader udførelsen af transfektering inden for et par timer, snarere end at vente natten. Men afhængigt af den eksperimentelle tidsplan, kan natten inkubation også overvejes.
Rensning af lentivirus partikler
For at opnå effektiv transduktion af hæmatopoietiske stamceller, er det nødvendigt at generere High-titer lentivirus. Optimering af centrifugeringshastigheden er en vigtig funktion. Mens koncentrationen af lentivirus normalt udføres på 90.000 x g, flere rapporter har vist, at virus opsving stiger, hvis materialet centrifugeres ved den lavere hastighed på 20.000 x g18. Produktionen af High-titer lentivirus forberedelse uden ultracentrifugering er også blevet foreslået17. Det skal bemærkes, at det er vigtigt at suspendere virus Centrifugerings pellet og samtidig undgå kraftig pipettering for at minimere beluftning og vedligeholde virus integritet. High-titer lentivirus partikler er nødvendige for effektiv transduktion af hæmatopoietiske stamceller11. Pilot forsøg afslørede, at en MOI på 100 er optimal med hensyn til transduktionseffektivitet og cellelevedygtighed. Det anbefales at evaluere lentivirus bestande på grundlag af cellernes levedygtighed og transduktiviteten.
Opbevaring af lentivirus partikler
Lentivirus titer er meget følsom over for temperatur, og titeren kan reduceres drastisk ved uhensigtsmæssige opbevaringsforhold og gentagne fryse-tø cyklusser. Det er blevet konstateret, at transduktiviteten af lentivirus aftager hurtigt, når den opbevares ved 4 °C [t (1/2) = 1,3 dage] eller udsættes for flere fryse-tø cyklusser [t (1/2) = 1,1 runder]. Det anbefales, at virus præparaterne fastfryses i flydende nitrogen eller knuses tøris kort tid efter, at virus pellet er suspenderet. De virale bestande bør opretholdes ved-80 °C og optøes på is for at RT lige før ækvibrering og brug11.
Flere potentielle begrænsninger bør noteres. For det første, indførelsen af off-Target Indel mutationer af CRISPR/Cas9 har længe været værdsat. Det er også blevet påvist, at CRISPR/Cas9 kan inducere off-Target mutationer i vivo21. I praksis, off-Target Indel mutationer kan undgås ved hjælp af grna sekvenser, der er tæt afstemt til at målrette genom sites og har mere end fire mismatch til forudsete sekundære sites. Et sådant design kan gøres med eksisterende i silico-værktøjer22. Andre beregningsværktøjer til at forudsige gRNA med minimerede off-Target-handlinger er tilgængelige (< http://Portals.broadinstitute.org/Gpp/Public/Analysis-Tools/sgrna-design > eller < http://www.Benchling.com >). Det kan også være gavnligt at analysere en animalsk model ved hjælp af to eller flere forskellige gRNAs at bekræfte fænotype og minimere muligheden for, at den observerede fænotype er medieret af en off-Target effekt af en specifik gRNA.
Ud over konventionelle Indel-mutationer skabt af CRISPR/Cas9 er større sletninger, der strækker sig ud over kilobaser, blevet rapporteret. Dette kan bekræfte undersøgelser; Men, disse større sletninger er rapporteret at være meget lavere frekvens sammenlignet med indels23. Et andet potentielt problem er genetisk kompensation. Det er blevet rapporteret, at mutant RNA med en tidlig afslutning codon (PTC) kan resultere i docetaxels opregulering af beslægtede gener med sekvens lighed ved kompas kompleks-medieret aktivering af transkriptionen24,25. Denne begivenhed er blevet foreslået at være en mekanisme, der kan føre til fænotypiske forskelle mellem knock-out og Knockdown tilgange af gen ablation. Fordi CRISPR/Cas9-mediated genomredigering er stærkt afhængig af stokastisk indførelse af frame-Shift-mutationer, der fører til generering af PTC, kan genetisk kompensation ændre Fænotypen. For at undgå genetisk kompensation, kan eksperimenter overvejes, hvor et gene's lovgivningsmæssige sekvenser er målrettet af CRISPR/Cas9 eller ved indførelsen af epigenetiske modifikatorer ved hjælp af Cas9 som en RNA-guidet DNA-anerkendelse platform.
Endelig bør det erkendes, at hæmatopoiese fra celler indpodet i letalt bestrålede mus kan afvige fra de indfødte betingelser for hæmatopoiese. Desuden kan bestråling have systemiske virkninger på organismen, som kan undersøge fortolkningen af eksperimenter, der undersøger konsekvenserne af genmutationer i hæmatopoietiske celler.
Forskere har udnyttet katalytisk inaktive Cas9 (dCas9) proteiner som en "RNA-guidet DNA-anerkendelses platform" og brugt dCas9 fusions proteiner til at lokalisere Effector domæner til specifikke DNA-sekvenser til enten at undertrykke (CRISPRi) eller aktivere (CRISPRa) transskription off-Target gener26,27. Mens denne protokol bruger katalytisk aktive Cas9 Transgene mus til at indføre dsDNA spaltning i genomisk DNA sekvens, epigenetiske modifikation at undertrykke eller aktivere specifikke gener er gældende ved at fusing dCas9 med kromatin modifikator domæner såsom dCas9-KRAB eller dCas9-VP64. Alternativt kan dCas9 bruges som en transkriptional repressor som sin egen, ved at blokere transkriptionelle maskiner til adgang til genstedet27. For nylig, Zhou et al. etablerede dCas9-SunTag-P65-HSF1 (SPH) Transgene mus, der udtrykker en modificeret version af en epigenetisk aktivator smeltet sammen med dCas9 og viste, at dette CRISPRa system er funktionel in vivo28.
Vores laboratorium overvejende bruger denne teknologi til at studere rollen som klonal hæmatopoiese i hjerte-kar-sygdomme processer. I prolifererende væv, somatiske mutationer i kræft driver gener kan give en cellulær vækst fordel og føre til afvigende klonal ekspansion. I det hæmatopoietiske system, denne proces er kendt som "klonal hematopoiesis", og det resulterer i situationer, hvor en betydelig brøkdel af en persons leukocytter erstattes af mutant kloner. Der er en stigende påskønnelse af, at afvigende klonale ekspansioner accelererer hjerte-kar-sygdomme, såsom åreforkalkning og hjertesvigt, og bidrager til sygelighed og al-årsag dødelighed15,29.
For nylig er en årsagssammenhæng mellem flere af disse somatiske mutationer og hjerte-kar-sygdomme blevet dokumenteret, og aspekter af de underliggende mekanismer er blevet belyst10,13,14. Men, disse somatiske mutationer formentlig repræsenterer "toppen af isbjerget", som epidemiologiske undersøgelser har vist, at mange ekstra kandidat gener er forbundet med klonal hæmatopoiese og, potentielt, øget Kardiovaskulær sygdom dødelighed. Således, en systematisk, højere gennemløb evaluering af klonal hematopoiese driver gener er påkrævet. Aktuelle undersøgelser af årsagssammenhæng af klonal hæmatopoiese og Kardiovaskulær sygdom er baseret på analyse af mus med hæmatopoietisk systemspecifik betinget transgene (Mxcre, VAV-CRE osv.) eller mus efter knoglemarvstransplantation. Disse strategier er imidlertid nødt til at etablere nye muse kolonier og kan blive en økonomisk og fysisk byrde for forskerne. Således er en billigere og hurtigere metode end den konventionelle murine transgene/knock-out tilgang, der anvendes i fortiden, berettiget. Lentiviral vektorer at transduce HSPC og CRISPR teknologier til ingeniør mutationer, som beskrevet i dette manuskript, lette studiet af klonal hæmatopoiese og hjerte-kar-sygdom.
Ud over at generere konventionelle knock-out locus, denne metode er gældende for produktionen af trunkerede muterede proteiner. For eksempel har forskerne med succes genereret en hæmatopoietisk-Ppm1d trunkering, som ofte ses hos patienter med klonal hematopoiese, ved at introducere frameshift mutationer med en gRNA rettet mod exon 6 af Ppm1d gen30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
S. S. blev støttet af en amerikansk hjerte forening postdoc Fellowship 17POST33670076. K. W. blev støttet af NIH Grants R01 HL138014, R01 HL141256 og R01 HL139819.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim injection | TEVA | 0703-9526-01 | |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216-- | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
