Summary

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

Published: October 03, 2019
doi:

Summary

CRISPR/Cas9システムによるマウス造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の高効率ゲノム編集のためのプロトコルは、造血系特異的遺伝子改変を用いたマウスモデルシステムを迅速に開発する。

Abstract

従来のトランスジェネシスアプローチを使用して造血幹細胞の遺伝子を操作することは、時間がかかり、コストがかかり、困難な場合があります。ゲノム編集技術とレンチウイルス媒介トランスジーン送達システムの進歩の恩恵を受け、造血幹細胞で遺伝子が特異的に操作されるマウスを確立する効率的かつ経済的な方法がここに記載されています。レンチウイルスは、特定の遺伝子と赤色蛍光レポーター遺伝子(RFP)を標的とするガイドRNA(gRNA)を用いてCas9発現系統陰性骨髄細胞をトランスデュースするために使用され、次いでこれらの細胞を致死照照照射C57BL/6マウスに移植する。非標的gRNAを発現するレンチウイルスで移植されたマウスは、対照として使用される。トランスプリエド造血幹細胞の移植は、末梢血のRFP陽性白血病のフローサイトメトリック解析により評価される。この方法を用いて、移植後4週間でミエロイド細胞の約90%、リンパ球細胞の約70%のトランスダクションを達成することができる。ゲノムDNAはRFP陽性血液細胞から単離され、標的部位DNAの一部をPCRによって増幅してゲノム編集を検証します。このプロトコルは、血化調節遺伝子のハイスループット評価を提供し、血化細胞関与を有する様々なマウス疾患モデルに拡張することができる。

Introduction

血液学と免疫学の多くの研究は、Mx1-Cre、Vav-Creなどの血液系特異的なCreドライバを利用する従来および条件付きトランスジェニック/ノックアウトマウスを含む遺伝子組み換えマウスの利用可能性に依存しています。1,2,3,4,5.これらの戦略は、時間がかかり、財政的負担になる可能性があり、新しいマウス株の確立を必要とします。ゲノム編集技術の革命的な進歩は、適切な技術的専門知識6、7、8、9とわずか3〜4ヶ月で新しいマウス株の生成を可能にしました、実験を追求する前にマウスのコロニーを増幅するためにはるかに多くの時間が必要です。さらに、これらの手順はコストがかかります。例えば、ジャクソン研究所は、ノックアウトマウス生成サービスの現在の価格を1株当たり16,845ドル(2018年12月現在)でリストしています。したがって、従来のマウストランスジェニックアプローチよりも経済的かつ効率的な方法がより有利である。

クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート/CRISPR関連タンパク質9(CRISPR/Cas9)技術は、迅速かつ効率的なRNAベースの配列特異的ゲノム編集のための新しいツールの開発につながっています。もともと侵入病原体DNAを破壊する細菌適応免疫機構として発見されたCRISPR/Cas9システムは、真核細胞および動物モデルにおけるゲノム編集の有効性を高めるためのツールとして使用されてきた。CRISPR/Cas9機械を造血幹細胞(例えば、エレクトロポレーション、核産生、脂肪減少、ウイルス送達など)に送達するアプローチが数多く採用されています。

ここでは、Cas9発現マウス造血幹細胞に効果的に感染し、ガイドRNA発現構造、プロモーター、調節配列、およびコードする遺伝子を一緒にパッケージ化する能力のために細胞をトランスデュースするためにレンチウイルスシステムが採用されています。蛍光レポータータンパク質(すなわち、GFP、RFP)。この方法を用いて、マウス造血幹細胞のex vivo遺伝子編集が達成され、続いて致死的に照射されたマウス10における骨髄の再構成に成功した。本研究に用いられるレンチウイルスベクターは、レポーター遺伝子から上流に上流の内部リボソーム入口部位を持つ共通コアEF1aプロモーターからのCas9およびGFPレポーター遺伝子を発現する。ガイドRNA配列は、別個のU6プロモーターから発現される。このシステムは、次いで、候補クローン無毛症ドライバ遺伝子Tet2およびDnmt3a10における挿入および欠失変異を作成するために使用される。しかし、この方法による経流効率は比較的低い(~5%-10%)。伝達効率を制限し、生産中にウイルス力を減少させるベクター挿入物(13 Kbp)の大きさのために。

他の研究では、より大きなウイルスRNAサイズがウイルス産生とトランスダクション効率の両方に悪影響を及ぼすことが示されている。例えば、挿入サイズの1kbの増加は、ウイルス産生を〜50%減少させることが報告され、および経転移効率はマウス造血幹細胞11において50%以上に減少する。したがって、システムの効率を向上させるためにウイルスインサートのサイズを可能な限り小さくすることが有利である。

この欠点は、Cas9トランスジェニックマウスを採用することによって克服することができ、Cas9タンパク質は構成的または誘導可能な方法12のいずれかで発現される。構成的なCRISPR/Cas9ノックインマウスは、ローザ26遺伝子座のCAGプロモーターからCas9エンドヌクレアーゼおよびEGFPをユビキタスな方法で発現する。これにより、コアEF1aプロモーターの制御下にあるU6プロモーターおよびRFPレポーター遺伝子の制御下でsgRNAを用いて構築し、レンチウイルスベクターを用いてゲノム編集を達成することができる。このシステムにより、造血幹細胞の遺伝子の編集に成功し、約90%の経流効率を示しました。したがって、このプロトコルは、標的遺伝子変異が人工系に導入されるマウスを迅速かつ効果的に作成する方法を提供する。私たちの研究室は、主に心血管疾患プロセス13、14、15におけるクローンヘマチオピスの役割を研究するために、このタイプの技術を使用していますが、それはまた、血液学の研究に適用可能です悪性腫瘍16.さらに、このプロトコルは、HSPCにおけるDNA突然変異が、人工システムにおける他の疾患または発達過程にどのように影響するかの分析に拡張することができる。

堅牢なレンチウイルスベクターシステムを確立するためには、高価気力ウイルスストックと血行細胞の移植および移植のための最適化された条件が必要とされる。プロトコルでは、セクション1の高チテーターウイルスストックの調製に関する指示が提供され、セクション2におけるマウス造血幹細胞の培養条件を最適化し、セクション3における骨髄移植の方法、および評価を行う。セクション4の移植。

Protocol

動物の被験者を含むすべての手順は、バージニア大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。 1. レンチウイルス粒子の生成と精製 注:最適化されたガイドRNAを含むレンチウイルス粒子は、Addgeneによって提供される詳細なプロトコルによって生成することができます: <https://media.addgene.org/cms/ファイル/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_prot…

Representative Results

上記のプロトコルを用いて、マウス当たり約0.8〜1.0 x 108個の骨髄細胞が得られた。我々が得る系統陰性細胞の数は、マウスあたり約3 x 106細胞である。典型的には、骨髄系統陰性細胞の収率は、全骨髄核細胞の4%〜5%である。 トランスメ因細胞のキメラ(RFP陽性)は、末梢血の流れサイトメトリーによって評価…

Discussion

このプロトコルの利点は、従来のマウストランスジェニックアプローチと比較して、迅速かつ非常に費用対効果の高い方法で血化細胞の特定の変異を収容する動物モデルの作成です。この方法論により、造血細胞遺伝子操作を1ヶ月以内にマウスの生成が可能となることがわかった。このプロトコルには、さらに検討が必要な重要な手順がいくつかあります。

gRNA配?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.S.は、アメリカ心臓協会のポスドク・フェローシップ17POST33670076によって支援されました。K. W. は、NIH 助成金 R01 HL138014、R01 HL141256、および R01 HL139819 によってサポートされました。

Materials

1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
293T cells ATCC CRL-3216– Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) BD Biosciences 560599 Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) BD Biosciences 552094 Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml BD 309604 general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added BD Bioscience 365974 general supply
BD Precisionglide needle, 18 G BD 305195 general supply
BD Precisionglide needle, 22 G  BD 305155 general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) Biolegend 100752 Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) Biolegend 100349 Antibodies
Collagen from calf skin Sigma-Aldrich 9007-34-5 general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well  Millipore Sigma CLS3471 general supply
CRISPR/Cas9 knock-in mice The Jackson Laboratory 028555 mouse
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose Sigma Aldrich D6429 Medium
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer Thermo fisher Scientific 00-4333-57 Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube Life Sciences 352054 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate  Life Science 353046 general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubes Thermo Fisher Scientific 22-362566 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) Invitrogen 11-0042-85 Antibodies
Fixation Buffer BD Bioscience 554655 Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening Systems Clontech 632636 Kit
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit  Takara 631235 Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm Millipore Sigma SLHV004SL general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) eBioscience 25-1152-82 Antibodies
PEI MAX Polysciences 24765-1 Solution
Penicillin-Streptomycin Mixture Lonza 17-602F Solution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Biosciences 560602 Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP  Addgene 57823 Plasmid
pMG2D Addgene 12259 Plasmid
Polybrene Infection/Transfection Reagent Sigma Aldrich TR-1003-G Solution
Polypropylene Centrifuge Tubes BECKMAN COULTER 326823 general supply
psPAX2  Addgene 12260 Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
Recombinant Murine SCF Peprotech 250-03 Solution
Recombinant Murine TPO  Peprotech  315-14 Solution
StemSpan SFEM STEMCELL Technologies 09600 Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli Thermo fisher Scientific K457501 Kit
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend 423102 Solution 

References

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Sano, S., Wang, Y., Evans, M. A., Yura, Y., Sano, M., Ogawa, H., Horitani, K., Doviak, H., Walsh, K. Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models. J. Vis. Exp. (152), e59977, doi:10.3791/59977 (2019).

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