Summary
Rodent कुशल तक पहुँचने आमतौर पर कुशल कौशल का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन महत्वपूर्ण समय और कार्य को लागू करने और व्यवहार का विश्लेषण करने के प्रयास की आवश्यकता है. हम गति ट्रैकिंग और पहुँच tractories के तीन आयामी पुनर्निर्माण के साथ कुशल तक पहुँचने के एक स्वचालित संस्करण का वर्णन.
Abstract
Rodent कुशल तक पहुँचने आमतौर पर कुशल कौशल का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन महत्वपूर्ण समय और कार्य को लागू करने और व्यवहार का विश्लेषण करने के प्रयास की आवश्यकता है. कुशल पहुंच के कई स्वचालित संस्करण हाल ही में विकसित किए गए हैं। यहाँ, हम एक संस्करण है कि स्वचालित रूप से चूहों को छर्रों प्रस्तुत करता है, जबकि उच्च फ्रेम दरों (300 एफपीएस) पर कई कोणों से उच्च परिभाषा वीडियो रिकॉर्डिंग का वर्णन. पंजा और व्यक्तिगत अंक DeepLabCut, मार्कर रहित मुद्रा आकलन के लिए एक मशीन सीखने एल्गोरिथ्म के साथ ट्रैक कर रहे हैं। इस प्रणाली को भी शारीरिक रिकॉर्डिंग के साथ सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है, या शारीरिक हस्तक्षेप (उदाहरण के लिए, बिजली या ऑप्टिकल उत्तेजना) को गति प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
मनुष्य निपुण कौशल पर भारी निर्भर करते हैं, जिसे उन आंदोलनों के रूप में परिभाषित किया जाता है जिन्हें ठीक समन्वित बहु-संयुक्त और अंक आंदोलनों की आवश्यकता होती है। ये कौशल संरचनात्मक घावों (जैसे, स्ट्रोक, ट्यूमर, demyelinating घावों), neurodegenerative रोग (जैसे, पार्किंसंस रोग), और मोटर के कार्यात्मक असामान्यताओं सहित आम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों की एक श्रृंखला से प्रभावित हैं सर्किट (उदा., डिस्टोनिया)। समझ कैसे कुशल कौशल सीखा है और केंद्रीय मोटर सर्किट द्वारा लागू कर रहे हैं इसलिए एक बड़ी आबादी के लिए जीवन की गुणवत्ता में सुधार करने की क्षमता है. इसके अलावा, इस तरह की समझ प्रशिक्षण और पुनर्वास रणनीतियों के अनुकूलन के द्वारा स्वस्थ लोगों में मोटर प्रदर्शन में सुधार की संभावना है.
मानव में कुशल कौशल अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट विच्छेदन तकनीकी और नैतिक विचारों द्वारा सीमित है, पशु मॉडल के उपयोग की आवश्यकता. गैर-मानव प्राइमेट्स का उपयोग आमतौर पर उनकी मोटर प्रणालियों की समानता और मनुष्यों के व्यवहार प्रदर्शनों को देखते हुए कुशल अंग आंदोलनों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है1. हालांकि, गैर मानव primates लंबी पीढ़ी के समय के साथ महंगे हैं, अध्ययन विषयों और आनुवंशिक हस्तक्षेप की संख्या सीमित. इसके अलावा, जबकि neuroवैज्ञानिक toolbox nonhuman primates के लिए लागू मनुष्य के लिए की तुलना में बड़ा है, कई हाल ही में तकनीकी प्रगति या तो अनुपलब्ध हैं या काफी primates में सीमित.
Rodent कुशल तक पहुँचने कुशल मोटर नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है. चूहे और चूहे मानव पहुँचने पैटर्न2के लिए homologous आंदोलनों की एक स्टीरियोटाइप अनुक्रम में एक चीनी गोली तक पहुँचने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है, समझ, और पुनः प्राप्त . उनके अपेक्षाकृत कम पीढ़ी के समय और कम आवास लागत के कारण, साथ ही साथ सप्ताह के लिए दिन में कुशल पहुँचने के लिए अपनी क्षमता के कारण, यह दोनों सीखने और कौशल समेकन चरणों के दौरान विषयों की बड़ी संख्या का अध्ययन करने के लिए संभव है. कृन्तकों, विशेष रूप से चूहों का उपयोग, भी कुशल कौशल का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली आधुनिक neuroवैज्ञानिक उपकरण (उदा., optogenetics, कैल्शियम इमेजिंग, रोग के आनुवंशिक मॉडल) के उपयोग की सुविधा.
सामान्य मोटर नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए दशकों से कुशल पहुंच का उपयोग किया गया है और यह स्ट्रोक और पार्किंसंस रोग3जैसे विशिष्ट रोगों से कैसे प्रभावित होता है। हालांकि, इस कार्य के अधिकांश संस्करणों श्रम और समय गहन हैं, कृन्तकों का अध्ययन करने के लाभों को कम करने. विशिष्ट implementations एक संकीर्ण स्लॉट जिसके माध्यम से कृन्तक तक पहुँचने चाहिए के सामने एक शेल्फ के साथ एक पहुंच कक्ष में कृन्तकों रखने शामिल है. एक शोधकर्ता मैन्युअल रूप से शेल्फ पर चीनी छर्रों देता है, पशु तक पहुँचने के लिए इंतजार कर रहा है, और फिर एक दूसरे को देता है. पहुँच वास्तविक समय में या वीडियो की समीक्षा4द्वारा या तो सफलता या विफलताओं के रूप में रन बनाए हैं. हालांकि, बस सफलता या विफलताओं के रूप में पहुँच स्कोरिंग अमीर शुद्ध गतिसेक डेटा है कि कैसे में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं पर ध्यान नहीं देता है (के रूप में बस के विरोध में कि क्या) तक पहुँचने बिगड़ा है. इस समस्या की पहचान करने के लिए वीडियो तक पहुँचने की विस्तृतसमीक्षा को लागू करने और अर्द्ध मात्रात्मक स्कोर उप-आंदोलन5 तक पहुँचने के द्वारा संबोधित किया गया था। हालांकि यह पहुँच शुद्ध गतिविज्ञान के बारे में कुछ डेटा जोड़ा, यह भी काफी प्रयोगकर्ता समय और प्रयास में वृद्धि हुई. इसके अलावा, प्रयोगकर्ता भागीदारी के उच्च स्तर पद्धति और डेटा विश्लेषण में विसंगतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यहां तक कि एक ही प्रयोगशाला के भीतर.
हाल ही में, कुशल पहुंच के कई स्वचालित संस्करण विकसित किए गए हैं। कुछ घर पिंजरे6,7,जानवरों के हस्तांतरण की जरूरत को नष्ट करने के लिए देते हैं। यह दोनों जानवरों पर तनाव कम कर देता है और उन्हें एक विशेष तक पहुँचने कक्ष के लिए acclimate की जरूरत समाप्त. अन्य संस्करण पंजा ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं ताकि विशिष्ट हस्तक्षेपों के अंतर्गत शुद्ध परिवर्तनों का अध्ययनकियाजा सके8 ,9,10, या स्वचालित रूप से यह निर्धारित करने के लिए तंत्र हो कि छल्लों को शेल्फ11से गिरा दिया गया था या नहीं . स्वचालित कुशल पहुंच कार्य विशेष रूप से उच्च तीव्रता वाले प्रशिक्षण के लिए उपयोगी होते हैं , जो चोटकेबाद पुनर्वास के लिए आवश्यक हो सकते हैं 12 . स्वचालित प्रणाली जानवरों गहन शोधकर्ता भागीदारी की आवश्यकता के बिना समय की लंबी अवधि में पहुँच की बड़ी संख्या में प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, सिस्टम जो पंजा ट्रैकिंग और स्वचालित परिणाम स्कोरिंग कम शोधकर्ता समय प्रदर्शन डेटा विश्लेषण खर्च की अनुमति देते हैं.
हम कई विशेष सुविधाओं के साथ एक स्वचालित चूहे कुशल पहुंच प्रणाली विकसित की है. सबसे पहले, नीचे से "पहुँच स्थिति" में गोली लाने के लिए एक चल कुरसी का उपयोग करके, हम forelimb के एक लगभग unobstructed दृश्य प्राप्त करते हैं. दूसरा, दर्पण की एक प्रणाली एक ही कैमरे के साथ पहुँच के कई एक साथ विचारों की अनुमति देता है, तीन आयामी (3-डी) एक उच्च संकल्प, उच्च गति (300 एफपीएस) कैमरे का उपयोग कर पहुँच tractories के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है. मार्कररहित गति पर नज़र रखने के लिए मजबूत मशीन सीखने एल्गोरिदम के हाल के विकास के साथ13,अब हम विस्तृत पहुंच और समझ शुद्ध गति विज्ञान निकालने के लिए न केवल पंजा लेकिन व्यक्तिगत पोर ट्रैक। तीसरा, एक फ्रेम-गब्बर जो सरल वीडियो प्रोसेसिंग करता है, विशिष्ट पहुँचने वाले चरणों की वास्तविक समय पहचान की अनुमति देता है। यह जानकारी वीडियो अधिग्रहण को ट्रिगर करने के लिए प्रयोग किया जाता है (निरंतर वीडियो अधिग्रहण फ़ाइल आकार के कारण व्यावहारिक नहीं है), और यह भी सटीक क्षणों में हस्तक्षेप (उदा., optogenetics) को ट्रिगर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, व्यक्तिगत वीडियो फ्रेम ट्रांजिस्टर-ट्रांसिस्टर तर्क (TTL) दालों द्वारा ट्रिगर कर रहे हैं, वीडियो ठीक तंत्रिका रिकॉर्डिंग (उदा., electrophysiology या photometry) के साथ सिंक्रनाइज़ किया जा करने के लिए अनुमति देता है। यहाँ, हम वर्णन कैसे इस प्रणाली का निर्माण करने के लिए, चूहों को प्रशिक्षित करने के लिए कार्य करने के लिए, बाहरी प्रणालियों के साथ उपकरण सिंक्रनाइज़, और 3-डी तक पहुँचने tractories पुनर्निर्माण.
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Protocol
यहाँ वर्णित पशु उपयोग से जुड़े सभी तरीकों मिशिगन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1. पहुंच कक्ष की स्थापना
नोट: उपकरण के विवरण और चित्र के लिए एलेन्स एट अल14 देखें। भाग संख्याएँ चित्र 1का संदर्भ.
- एक्रिलिक सीमेंट के साथ बॉन्ड स्पष्ट पॉली कार्बोनेट पैनलतक पहुंच कक्ष (15 सेमी चौड़ा 40 सेमी लंबा द्वारा 40 सेमी लंबा) (भाग #1)। एक तरफ पैनल (भाग #2) एक ताला के साथ एक टिका दरवाजा (18 सेमी चौड़ा द्वारा 15 सेमी लंबा) है। यदि चूहे को केबल से बांध दिया जाएगा, तो इसे समायोजित करने के लिए कक्ष की छत (भाग #12) में एक भट्ठा (5 सेमी चौड़ा 36 सेमी लंबा) काट दें। फर्श पैनल 18 छेद (1.75 सेमी व्यास) (भाग #13) में कटौती की है और कक्ष के बाकी के लिए बंधुआ नहीं है.
- माउंट और संरेखित अवरक्त सेंसर (भाग #3) पक्ष पैनलों में 4.5 सेमी कक्ष के पीछे से और 3.8 सेमी फर्श से. व्यवहार सॉफ्टवेयर एक सूचक है ('IR वापस') कि हरे रंग की है जब अवरक्त बीम अटूट और लाल है जब बीम टूट गया है. एक बार सॉफ्टवेयर की स्थापना की है, यह सेंसर संरेखण की जाँच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक दर्पण माउंट (15 सेमी x 5 सेमी, भाग #4) 10 सेमी पहुँच स्लॉट के ऊपर (भाग #14). दर्पण कोण तो गोली वितरण रॉड कैमरे के लिए दिखाई देता है.
- एक sanitizable समर्थन बॉक्स पर कक्ष प्लेस (59 सेमी चौड़ा द्वारा 67.3 सेमी लंबा 30.5 सेमी लंबा, भाग #5). कक्ष समर्थन बॉक्स में एक छेद के ऊपर टिकी हुई है (12 सेमी चौड़ा द्वारा 25 सेमी लंबा) कि कूड़े फर्श छेद के माध्यम से गिर करने के लिए अनुमति देता है (भाग #13) और पहुंच कक्ष से बाहर. एक दूसरे छेद कट (7 सेमी चौड़ा द्वारा 6 सेमी लंबा, भाग #15) तक पहुँचने स्लॉट के सामने समर्थन बॉक्स में, जो एक गोली वितरण रॉड तक पहुँचने स्लॉट के लिए छर्रों लाने के लिए अनुमति देता है.
- दो दर्पण माउंट (8.5 सेमी चौड़ा x 18.5 सेमी लंबा, भाग #6) कक्ष के दोनों ओर मैग्नेट के साथ फर्श पर इतना है कि दर्पण के लंबे किनारे तक पहुँचने बॉक्स के सामने से पक्ष पैनल 3 सेमी छू रहा है. दर्पण कोण इतना है कि कैमरा बॉक्स में देख सकते हैं और पहुंच स्लॉट के सामने क्षेत्र जहां गोली वितरित किया जाएगा.
- उच्च परिभाषा कैमरा माउंट (भाग #7) तक पहुँचने स्लॉट से 17 सेमी, बॉक्स का सामना करना पड़.
- माउंट काले कागज (भाग #18) कैमरे के दोनों ओर तो पक्ष दर्पण में पृष्ठभूमि अंधेरा है. यह वास्तविक समय और ऑफ लाइन पंजा का पता लगाने में सुधार करने के लिए इसके विपरीत बढ़ाता है।
- एक sanitizable फ्रेम पर रैखिक actuator (भाग #16) माउंट (25 सेमी चौड़ा द्वारा 55 सेमी लंबा द्वारा 24 सेमी लंबा, भाग #8) शिकंजा के साथ. actuator अपनी स्थिति संवेदन पुरन करने के लिए अंदर जमा से गोली धूल को रोकने के लिए उल्टा घुड़सवार है.
- विधानसभा में जमा होने से धूल को रोकने के लिए गोली जलाशय (#9 भाग) के गले में एक फोम ओ-अंगूठी डालें। फ्रेम शीर्ष के नीचे में drilled तीन शिकंजा ऊपर कीप के किनारों फिसल द्वारा फ्रेम के शीर्ष में एक छेद ($6 सेमी व्यास, भाग #17) के नीचे कीप माउंट। कीप की गर्दन में गाइड ट्यूब (भाग #10) डालें।
- actuator के स्टील रॉड के अंत करने के लिए प्लास्टिक टी संबंधक संलग्न करें। गोली वितरण रॉड के पतला अंत कनेक्टर के शीर्ष में डालें और गोली जलाशय में गाइड ट्यूब के माध्यम से cupped अंत.
- गोली वितरण रॉड तक पहुँचने स्लॉट के सामने छेद (भाग #15) के माध्यम से विस्तार कर सकते हैं ताकि कुशल पहुंच कक्ष के तहत रैखिक actuator विधानसभा प्लेस.
- एक पहिएदार कैबिनेट (121 सेमी x 119 सेमी x 50 सेमी) में पूरे पहुंच उपकरण रखें कंप्यूटर प्रशंसकों के साथ हवादार (आंतरिक गर्म हो जाता है जब अच्छी तरह से जलाया) और ध्वनिक फोम के साथ लाइन में खड़ा.
- 25.4 सेमी समर्थन पैनलों द्वारा 20.3 सेमी पर एलईडी प्रकाश स्ट्रिप्स का उपयोग करके पांच प्रकाश पैनलों (भाग #11) का निर्माण करें। प्रकाश स्ट्रिप्स पर माउंट विसारक फिल्म. गोली वितरण रॉड क्षेत्र पर छत पर एक प्रकाश पैनल माउंट. पहुँच कक्ष के साथ अलमारियाँ के पक्षों पर अन्य चार माउंट.
नोट: यह वास्तविक समय पंजा पहचान के लिए पहुंच स्लॉट और गोली वितरण रॉड के आसपास के क्षेत्र रोशन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
2. कंप्यूटर और हार्डवेयर की स्थापना
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार FPGA फ्रेम धरनेवाला और डिजिटल एक्सटेंशन कार्ड स्थापित करें (सामग्री की तालिकादेखें).।
नोट: हम अनुशंसा करते हैं कम से कम 16 GB RAM और एक आंतरिक ठोस राज्य हार्ड ड्राइव डेटा भंडारण के लिए, के रूप में उच्च गति वीडियो स्ट्रीमिंग महत्वपूर्ण बफरिंग क्षमता की आवश्यकता है. - उच्च परिभाषा कैमरे के लिए ड्राइवरों को स्थापित करें और FPGA framegrabber से कनेक्ट करें. व्यवहार सॉफ्टवेयर चल रहा है और कैमरे के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए कैमरे के साथ interfacing होना चाहिए.
नोट: शामिल कोड (पूरक फ़ाइलें देखें) कैमरे में प्रोग्राम रजिस्टर तक पहुँचता है और अन्य ब्रांडों के साथ संगत नहीं हो सकता है. हम प्रति सेकंड कम से कम 300 फ्रेम रिकॉर्डिंग की सिफारिश (fps); 150 एफपीएस में हमने पाया कि पंजा मुद्रा में महत्वपूर्ण परिवर्तन अक्सर याद किया गया. - कंप्यूटर के लिए "SR Automation[dig]ext[card]64bit" में शामिल कोड (प्रोजेक्ट) की प्रतिलिपि बनाएँ।
3. व्यवहार प्रशिक्षण
- प्रशिक्षण से पहले चूहों को तैयार करें।
- हाउस लांग-एवन्स चूहों (पुरुष या महिला, उम्र 10-20 सप्ताह) एक रिवर्स प्रकाश पर पिंजरे प्रति 2-3 के समूहों में / प्रशिक्षण से तीन दिन पहले, शरीर के वजन को बनाए रखने के लिए खाद्य प्रतिबंध पर चूहों जगह 10-20% आधार रेखा से नीचे.
- कम से कम 5 दिनों के लिए प्रति दिन कई मिनट के लिए चूहों संभाल. हैंडलिंग के बाद, प्रत्येक घर पिंजरे में चूहे प्रति 4-5 चीनी छर्रों जगह उपन्यास भोजन परिचय.
- चूहे को पहुँचकक्ष में रखना (1-3 दिन)
- एलईडी रोशनी चालू करें और कक्ष के सामने और पीछे 3 चीनी छर्रों जगह है.
- कक्ष में चूहे प्लेस और चूहे 15 मिनट के लिए पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं मॉनिटर अगर यह छर्रों खाती है. इस चरण को दोहराएँ जब तक चूहा फर्श के बंद छर्रों के सभी खाती है.
- चूहों के बीच इथेनॉल के साथ कक्ष साफ.
नोट: अंधेरे चरण के दौरान प्रशिक्षण और परीक्षण प्रदर्शन करते हैं। एक ही समय में दैनिक चूहों ट्रेन.
- पहुँचने और पंजा वरीयता (1-3 दिन) का पालन करने के लिए चूहे को प्रशिक्षित।
- रोशनी चालू करें और कुशल पहुंच कक्ष में चूहे जगह है.
- संदंश का प्रयोग करके बॉक्स के सामने पहुँच स्लॉट के माध्यम से एक गोली पकड़ें (चित्र 1, चित्र 2)। चूहे को संदंश से 3 छर्रों खाने की अनुमति दें।
- अगली बार चूहा संदंश से गोली खाने की कोशिश करता है, गोली वापस खींच. अंततः, चूहे अपने पंजा के साथ गोली के लिए पहुँचने का प्रयास करेंगे.
- इसे 11 बार दोहराएं। पंजा है कि चूहा 11 प्रयासों में से सबसे बाहर का उपयोग करता है चूहे की "पाउ वरीयता" है.
नोट: एक प्रयास तक पहुँचने स्लॉट पिछले बाहर तक पहुँचने पंजा के रूप में परिभाषित किया गया है. चूहे को सफलतापूर्वक प्राप्त करने और गोली खाने की जरूरत नहीं है.
- गोली वितरण छड़ी तक पहुँचने के लिए चूहे को प्रशिक्षित करें (1-3 दिन)
- चूहे की पसंदीदा पंजा करने के लिए पहुंच स्लॉट contralateral के पक्ष के साथ गोली वितरण रॉड संरेखित करें (पहुँच कक्ष के सामने से लगातार स्थान 1.5 सेमी सुनिश्चित करने के लिए एक गाइड का उपयोग करें).। सुपुर्दगी छड़ के शीर्ष को पहुँच स्लॉट के निचले भाग के साथ संरेखित करना चाहिए (चित्र 2ख) प्रसव छड़ पर एक गोली रखें.
नोट: चूहे के पसंदीदा पंजा के विपरीत डिलीवरी रॉड पोजिशनिंग चूहे के लिए अपने गैर पसंदीदा पंजा के साथ गोली प्राप्त करने के लिए मुश्किल बनाता है। हम उनके गैर पसंदीदा पंजा का उपयोग कर चूहों के साथ मुद्दों नहीं पड़ा है. हालांकि, कुछ मॉडलों में (उदा., स्ट्रोक) यह अभी भी हो सकता है और गैर-अधिमानित पहुंच अंग पर एक संयम जोड़ा जा सकता है। - एक गोली के साथ चूहे को बैड संदंश का उपयोग करते हुए पकड़ लिया, लेकिन प्रसव की छड़ी की ओर चूहे को निर्देशित इतना है कि उसके पंजा छड़ी पर गोली हिट. यदि चूहा रॉड से गोली गिराता है, तो उसे बदल दें। कुछ चूहे शुरू में काफी दूर तक नहीं पहुंच सकते हैं। इस मामले में, गोली वितरण रॉड तक पहुँचने स्लॉट के करीब ले जाएँ और फिर धीरे धीरे इसे आगे आगे ले जाने के रूप में चूहे में सुधार.
- के बारे में 5-15 baited तक पहुँच के बाद चूहे को प्रसव की छड़ी पर गोली के लिए सहज रूप से पहुँचने के लिए शुरू हो जाएगा. एक बार चूहा बिना प्रलोभन के डिलीवरी रॉड तक पहुंचने का प्रयास करता है, तो यह अगले चरण में जा सकता है।
- चूहे की पसंदीदा पंजा करने के लिए पहुंच स्लॉट contralateral के पक्ष के साथ गोली वितरण रॉड संरेखित करें (पहुँच कक्ष के सामने से लगातार स्थान 1.5 सेमी सुनिश्चित करने के लिए एक गाइड का उपयोग करें).। सुपुर्दगी छड़ के शीर्ष को पहुँच स्लॉट के निचले भाग के साथ संरेखित करना चाहिए (चित्र 2ख) प्रसव छड़ पर एक गोली रखें.
- चूहे को एक गोली (2-8 दिन) का अनुरोध करने के लिए प्रशिक्षित करें।
नोट: हालांकि हम पड़ा है 100% सफलता प्रशिक्षण चूहों छर्रों के लिए पहुँचने के लिए, चूहों के बारे में 10% कक्ष के पीछे ले जाकर एक गोली का अनुरोध करने के लिए सीखने के लिए असफल.- चूहे के पंजा वरीयता के आधार पर गोली वितरण छड़ को स्थिति दें और इसे 2 स्थिति में रख दें (चित्र 2क)। actuator रिमोट का उपयोग कर गोली वितरण रॉड की ऊंचाई पदों सेट करें। होल्डिंग बटन 1 और 2 एक साथ डिलीवरी रॉड ऊपर ले जाता है, जबकि बटन 3 पकड़े और 2 वितरण रॉड नीचे ले जाता है। जब डिलीवरी रॉड सही ऊंचाई पर हो, तो इच्छित संख्या को तब तक दबाए रखें जब तक कि हल्का लाल रंग को सेट न कर दे।
- कक्ष में चूहे प्लेस और एक गोली के साथ वापस करने के लिए चूहे चारा. जब चूहा कक्ष के पीछे तक काफी दूर ले जाता है कि यह अवरक्त बीम टूट जाएगा अगर स्वचालित संस्करण चल रहा था, गोली वितरण रॉड 3 स्थिति को ले जाएँ (चित्र 2B).
- चूहे को गोली तक पहुँचने के लिए प्रतीक्षा करें और फिर गोली वितरण छड़ को 2 स्थिति में वापस ले जाएं (चित्र 2क) । डिलीवरी रॉड पर एक नया गोली रखें अगर यह बंद खटखटाया गया था.
- इन चरणों को दोहराएँ, धीरे-धीरे चूहे कम और कम baiting, जब तक चूहा शुरू होता है: (i) वापस करने के लिए चारा जा रहा बिना एक गोली का अनुरोध करने के लिए कदम, और (ii) तुरंत पीठ में एक गोली का अनुरोध करने के बाद सामने के लिए कदम. एक बार चूहा यह 10 बार किया है, यह स्वचालित कार्य पर प्रशिक्षण के लिए तैयार है.
4. प्रशिक्षण चूहों स्वचालित प्रणाली का उपयोग कर
- स्वचालित सिस्टम सेट करें.
- कक्ष में रोशनी चालू करें और यदि आवश्यक हो तो गोली जलाशय फिर से भरना।
- चूहे के पंजा वरीयता के अनुसार गोली वितरण रॉड स्थिति. जाँच करें कि प्रचालक की स्थिति सही ढंग से सेट की गई है (जैसा कि चित्र 2Aमें ) है.
- कंप्यूटर को चालू करें और कुशल पहुँच प्रोग्राम खोलें (SR[dig]extension[card]64bit](HOST)]3.vi)। विषय के तहत चूहा आईडी नंबर दर्ज करें और हाथ ड्रॉप-डाउन मेनू से पंजा वरीयता का चयन करें। वीडियो के लिए पथ सहेजें निर्दिष्ट करें.
- सत्र समय और अधिकतम वीडियो सेट करें (वीडियो की संख्या जिस पर सत्र समाप्त करने के लिए). कार्यक्रम जो भी सीमा पहले पहुँच जाता है पर चल रहा बंद हो जाएगा.
- सेट गोली लिफ्ट अवधि (समय की अवधि है कि प्रसव रॉड स्थिति में रहता है "3" चूहे के बाद एक गोली अनुरोध). सक्षम या अर्ली रीच पेनल्टी को अक्षम करें (डिलीवरी रॉड स्थिति के लिए रीसेट करता है "1" और फिर वापस करने के लिए "2" अगर चूहे एक गोली का अनुरोध करने से पहले पहुँचता है).
- अंशांकन छवियों ले लो. 3-डी प्रक्षेप पथ पुनर्निर्माण उपयुक्त रूपांतरण matrices, जो प्रत्येक दृश्य में मिलान अंक की पहचान की आवश्यकता है निर्धारित करने के लिए एक कंप्यूटर दृष्टि उपकरण बॉक्स का उपयोग करता है. ऐसा करने के लिए, प्रत्येक तरफ चेकरबोर्ड पैटर्न के साथ एक छोटे घन का उपयोग करें (चित्र 3)।
- तक पहुँचने कक्ष के अंदर मदद हाथ प्लेस और तक पहुँचने स्लॉट के माध्यम से मगरमच्छ क्लिप प्रहार. मगरमच्छ क्लिप के साथ पहुंच स्लॉट के सामने घन पकड़ो.
- घन स्थिति इतना है कि लाल पक्ष शीर्ष दर्पण में प्रकट होता है, बाएँ दर्पण में हरे रंग की ओर, और सही दर्पण में नीले पक्ष. तीनों पक्षों का पूरा चेहरा दर्पणों में दिखाई देना चाहिए (चित्र 3)।
- व्यवहार कार्यक्रम में, सुनिश्चित करें कि ROI थ्रेशहोल्ड एक बहुत बड़े मान पर सेट है (उदा., 60000). रन बटन (सफेद तीर) क्लिक करें. कैमरा शुरू बटन हरे रंग बदल जाता है एक बार, शुरूदबाएँ. ध्यान दें कि वीडियो प्राप्त किया जा रहा है.
- कैल मोडपर क्लिक करें. फिर, Cal छवि लेंक्लिक करके एक छवि लें. छवि निर्देशिका पथ अब "GridCalibration]YYYYMMDD[img].png"के रूप में स्वरूपित .png filename के साथ ".png पथ" के अंतर्गत दिखाई देगा।
- क्यूब को थोड़ा सा ले जाएँ, और कोई अन्य छवि लें. 3 छवियों की कुल के लिए फिर से दोहराएँ.
- रोकें और फिर रोकें साइन बटन क्लिक करके प्रोग्राम बंद करें. बॉक्स से मदद हाथ और घन निकालें.
- अंशांकन छवियों उस दिन लिया गया है के बाद व्यवहार कक्ष में कुछ भी टक्कर नहीं करने के लिए सावधान रहें। कुछ भी चलता है, तो नए अंशांकन छवियों लिया जाना चाहिए.
- स्वचालित सिस्टम चलाएँ।
नोट: वास्तविक डेटा प्राप्ति के लिए चूहे चलाने से पहले प्रत्येक प्रतिबिंब के लिए "ROI थ्रेशहोल्ड" सेटिंग्स (नीचे वर्णित) निर्धारित करें। एक बार इन सेटिंग्स निर्धारित किया गया है, कार्यक्रम शुरू करने से पहले उन्हें पूर्व निर्धारित और यदि आवश्यक हो तो अधिग्रहण के दौरान समायोजित करें.- चूहे को कुशल पहुंच कक्ष में रखें। प्रोग्राम को चलाने के लिए सफेद तीर पर क्लिक करें.
- प्रारंभक्लिक करने से पहले, x-Offset (ROI आयत के ऊपरी-बाएँ कोने के x-निर्देशांक), y-Offset (Y-निर्देशांक ROI के ऊपरी-बाएँ कोने के), ROI चौड़ाई और समायोजित करके पंजा डिटेक्शन के लिए ROI की स्थिति सेट करें और ROI ऊँचाई|
- साइड मिरर में ROI को स्थिति दें जो पंजा का पृष्ठ दर्शाता है, सीधे पहुँच स्लॉट के सामने (चित्र 2C)। सुनिश्चित करें कि गोली वितरण रॉड ROI में प्रवेश नहीं करता है और यह कि ROI गोली या चूहे के फर को ट्रिगर करने से रोकने के लिए बॉक्स में विस्तार नहीं करता है जब चूहा नहीं पहुंच रहा है।
- प्रोग्राम प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ करें क्लिक करें.
- "Live ROI ट्रिगर मान" "0" और "1" (जब चूहा नहीं पहुँच रहा है) के बीच दोलन कर रहा है जब तक "कम ROI थ्रेशहोल्ड" मान समायोजित करें। यह मान थ्रेशोल्ड श्रेणी में तीव्रता मानों के साथ ROI में पिक्सेल की संख्या है.
- ROI थ्रेशहोल्डसेट करें. लाइव रॉय ट्रिगर मूल्य का निरीक्षण करें जब चूहा रॉय में अपनी नाक pokes और जब चूहे गोली के लिए पहुंचता है. नाक pokes के दौरान "लाइव ROI ट्रिगर मान" से काफी अधिक होने के लिए ROI सीमा सेट करें और चूहे के पहुंचने पर "लाइव ROI ट्रिगर मान" से कम है. समायोजित करें जब तक वीडियो लगातार ट्रिगर कर रहे हैं जब चूहे तक पहुँचता है, लेकिन नहीं जब यह स्लॉट के माध्यम से अपनी नाक pokes
नोट: यह पंजा नाक की तुलना में हल्का रंग का है मानता है; समायोजन उलट जाएगा अगर पंजा नाक से गहरा है. - सब कुछ सही ढंग से काम कर रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए पहले कुछ परीक्षणों की निगरानी करें। जब एक चूहा एक गोली का अनुरोध करने से पहले पहुँचता है (स्थिति में डिलीवरी रॉड "2"), "अर्ली पहुँचता है" संख्या बढ़ जाती है. जब एक चूहा एक गोली का अनुरोध करने के बाद पहुँचता है (स्थिति में डिलीवरी रॉड "3"), "वीडियो" संख्या बढ़ जाती है और एक वीडियो नाम के साथ एक .bin फ़ाइल के रूप में सहेजा जाता है "RXXXX[YYYYMMDD]HH$MM[S]trial].
नोट: डिफ़ॉल्ट वीडियो के लिए है 300 फ्रेम शामिल करने के लिए (यानी, 1 s) से पहले और 1000 फ्रेम ट्रिगर घटना के बाद (यह सॉफ्टवेयर में विन्यास है), जो काफी लंबे समय से पंजा वापसी सहित पूरी पहुंच-टू-स्grasp आंदोलन को शामिल करने के लिए है. - सत्र समय या अधिकतम वीडियो तक पहुँच गया है एक बार, कार्यक्रम बंद हो जाता है. रोक चिह्न बटन दबाएँ.
- इथेनॉल के साथ कक्ष साफ और एक और चूहे के साथ दोहराने, या अगर दिन के लिए किया वीडियो परिवर्तित करने के लिए आगे बढ़ना.
- .bin फ़ाइलों को .avi फ़ाइलों में कनवर्ट करें.
नोट: प्राप्ति के दौरान वीडियो संपीड़ित कारण छोड़ दिया फ़्रेम, इसलिए बायनेरी फ़ाइलें प्राप्त करने के दौरान डिस्क पर स्ट्रीम हैं (उच्च डेटा स्थानांतरण दरों के कारण एक ठोस स्थिति ड्राइव का उपयोग करें)। ये बायनेरी फ़ाइलें ऑफ़-लाइन संपीड़ित होना चाहिए या संग्रह आवश्यकताएँ प्रतिषेधात्मक रूप से बड़ी हैं।- "bin2avi-color]1473R$noEncode.vi" प्रोग्राम खोलें।
- "फ़ाइल पथ नियंत्रण" के अंतर्गत उस सत्र (उदा., R0235]20180119a) को कनवर्ट करने के लिए इच्छित फ़ोल्डर बटन क्लिक करें. प्रत्येक सत्र के लिए दोहराएँ (छह तक).
- सफेद तीर (चलाएँ) और उसके बाद प्रारंभ करने के लिए "प्रारंभ" क्लिक करें। आप "कुल प्रगति (%)" में वीडियो संपीड़न की निगरानी कर सकते हैं छड़. कार्यक्रम रात भर चलाने दें.
- इससे पहले कि आप अगले दिन जानवरों को प्रशिक्षण देना शुरू करें, जांचें कि वीडियो परिवर्तित कर दिए गए हैं और .bin फ़ाइलों को हटा दें ताकि नए वीडियो प्राप्त करने के लिए पर्याप्त स्थान हो.
5. DeepLabCut के साथ वीडियो का विश्लेषण
नोट: विभिन्न नेटवर्क प्रत्येक पंजा वरीयता (दाएं पंजा और बाएँ पंजा) के लिए और प्रत्येक दृश्य (प्रत्यक्ष दृश्य और बाएं पंजा चूहों, प्रत्यक्ष दृश्य और बाएं पंजा चूहों के लिए सही दर्पण दृश्य) के लिए प्रशिक्षित किया जाता है। शीर्ष दर्पण दृश्य 3 डी पुनर्निर्माण के लिए प्रयोग नहीं किया जाता है-बस का पता लगाने के लिए जब नाक स्लॉट में प्रवेश करती है, जो हस्तक्षेप को ट्रिगर करने के लिए उपयोगी हो सकता है (जैसे, optogenetics). प्रत्येक नेटवर्क तो इसी पंजा और देखने के लिए फसली वीडियो का एक सेट का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
- DeepLabCut नेटवर्क ट्रेन (विस्तृत निर्देश https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut पर DeepLabCut प्रलेखन में प्रदान की जाती हैं).
- बनाएँ और DeepLabCut में एक नई परियोजना, मार्कर रहित मुद्रा अनुमान13के लिए एक मशीन सीखने एल्गोरिथ्म विन्यस्त.
- कार्यक्रम इंटरफ़ेस में (प्रत्यक्ष या दर्पण दृश्य) को शामिल करने के लिए दृश्य के लिए कुशल पहुँच वीडियो और फसल छवियों से फ्रेम निकालने के लिए कार्यक्रम का उपयोग करें। फसल फ्रेम काफी बड़ी इतनी है कि चूहे और दोनों सामने पंजे दिखाई दे रहे हैं.
नोट: नेटवर्क आम तौर पर 100-150 प्रशिक्षण फ़्रेम की आवश्यकता होती है। अधिक प्रशिक्षण फ्रेम की जरूरत है जब पंजा अंदर है के रूप में प्रकाश की वजह से कक्ष के बाहर की तुलना में. तंग फसल प्रसंस्करण समय कम कर देता है, लेकिन फसली क्षेत्रों प्रत्येक चूहे के लिए पंजा पूर्ण प्रक्षेप वक्र का पता लगाने के लिए पर्याप्त बड़े हैं कि सावधान रहना। यह चूहे के पूरे शरीर के लिए काफी व्यापक होना चाहिए फ्रेम में फिट करने के लिए (प्रत्यक्ष दृश्य), और जहाँ तक संभव के रूप में कक्ष में वापस देखने के लिए और प्रसव रॉड के सामने (चमत्कार देखें). - शरीर के अंगों को लेबल करने के लिए प्रोग्राम GUI का उपयोग करें. प्रत्येक फ्रेम में लेबल 16 अंक: 4 मेटाकार्पोफैलेंजियल (एमसीपी) जोड़ों, 4 समीपस्थ अंतराफलांजल (पीआईपी) जोड़ों, 4 अंकों की युक्तियाँ, पहुंच पंजा का डोर्सम, नाक, गैर-प्रगामी पंजा का डोर्सम, और गोली (चित्र 4)।
- प्रशिक्षण डेटासेट बनाने, नेटवर्क को प्रशिक्षित करने, और प्रशिक्षित नेटवर्क का मूल्यांकन करने के लिए DeepLabCut (डीएलसी के रूप में अब से संक्षिप्त) निर्देशों का पालन करें।
- वीडियो का विश्लेषण करें और नेटवर्क को परिशोधित करें.
- नए प्रशिक्षित नेटवर्क के साथ सभी वीडियो का विश्लेषण करने से पहले, नेटवर्क के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए 10 वीडियो का विश्लेषण करें. यदि कुछ बन गया में लगातार त्रुटियाँ हैं, उन बन गया युक्त अतिरिक्त प्रशिक्षण फ्रेम निकालने और नेटवर्क retrain.
- वीडियो का विश्लेषण करते समय , .csv फ़ाइलों को आउटपुट करना सुनिश्चित करें, जिसे 3D प्रक्षेप पथ पुनर्निर्माण के लिए कोड में खिलाया जाएगा.
6. बॉक्स अंशांकन
नोट: ये निर्देश direct और mirror दृश्यों में पहचाने गए बिंदुओं को 3-डी निर्देशांकों में कनवर्ट करने के लिए रूपांतरण matrices निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। सबसे ऊपर की तारीख संस्करण और कैसे boxCalibration पैकेज का उपयोग करने के बारे में अधिक विवरण के लिए, Leventhal लैब GitHub देखें: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration, जो उनके उपयोग के लिए कदम दर कदम निर्देश भी शामिल है.
- एक ही फ़ोल्डर में सभी अंशांकन छवियों लीजिए.
- ImageJ/Fifi का उपयोग करके, मैन्युअल रूप से प्रत्येक अंशांकन छवि के लिए चेकरबोर्ड बिंदु चिह्नित करें। इस छवि को "GridCalibration[YYYYMMDD].tif" के रूप में सहेजें जहाँ 'YYYYMMDD' वह दिनांक है जिससे अंशांकन छवि संगत होती है और उस दिनांक के लिए छवि संख्या है.
- ImageJ में माप फ़ंक्शन का उपयोग करें (उपकरण पट्टी में, विश्लेषण का चयन करें | उपाय)। यह एक तालिका प्रदर्शित करेगा जिसमें चिह्नित सभी बिंदुओं के लिए निर्देशांक होंगे. इस फ़ाइल को उस नाम से सहेजें "GridCalibration[YYYYMMDD].csv", जहाँ दिनांक और छवि संख्या संबंधित .tif फ़ाइल के समान होती है.
- बॉक्सकैलिटर पैकेज से, 'setParams.m' फ़ाइल खोलें. इस फ़ाइल में सभी आवश्यक चर और उनके विवरण हैं। परियोजना के विनिर्देशों को फ़िट करने के लिए आवश्यक चरों को संपादित करें.
- calibrateBoxes फ़ंक्शन चलाएँ। आदेश विंडो में कई संकेत दिखाई देंगे. पहला संकेत पूछता है कि क्या फ़ोल्डर में सभी छवियों का विश्लेषण करने के लिए. टंकण Y संकेतों खत्म हो जाएगा, और सभी तारीखों के लिए सभी छवियों का विश्लेषण किया जाएगा. टंकण N उपयोगकर्ता को विश्लेषण करने के लिए दिनांक दर्ज करने का संकेत देगा.
नोट: दो नए निर्देशिका अंशांकन छवि फ़ोल्डर में बनाया जाएगा: 'markedImages' अंशांकन छवि पर उपयोगकर्ता परिभाषित चेकरबोर्ड चिह्नों के साथ .png फ़ाइलें शामिल हैं। 'boxCalibration' फ़ोल्डर में बॉक्स अंशांकन पैरामीटर के साथ .mat फ़ाइलें हैं. - चेकबॉक्सकैलिक्शन फ़ंक्शन चलाएँ। यह 'बॉक्स कैलिब्रेटेशन' फ़ोल्डर में एक नया फ़ोल्डर, 'चेक कैलिब्रेटेशन' बनाएगा। प्रत्येक दिनांक में एक सबफ़ोल्डर होगा जिसमें छवियां और कई .fig फ़ाइलें होंगी, जिनका उपयोग यह सत्यापित करने के लिए किया जाता है कि बॉक्स अंशांकन सही रूप से पूर्ण हो गया था.
7. 3 डी त्रासदियों का पुनर्निर्माण
- reconstruct3Dtraectories स्क्रिप्ट में वर्णित निर्देशिका संरचना में सीखने के कार्यक्रम के आउटपुट युक्त .csv फ़ाइलों को इकट्ठा.
- रन पुन: निर्माण3Dtradicories| यह स्क्रिप्ट निर्देशिका संरचना खोज और leaning कार्यक्रम में उनके नाम के आधार पर प्रत्यक्ष /
- CalculateKinematicsचलाएँ | यह स्क्रिप्ट 3-डी प्रक्षेप पथ पुनर्निर्माण से सरल शुद्ध गतिक विशेषताओं को निकालता है, जिसे विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुरूप बनाया जा सकता है।
नोट: सॉफ्टवेयर अपने पड़ोसियों और पूरक दृश्य में उनके स्थान के आधार पर occluded शरीर के अंगों की स्थिति का अनुमान है (उदा., प्रत्यक्ष कैमरा दृश्य में एक शरीर के हिस्से के स्थान दर्पण दृश्य में अपने संभावित स्थानों constrains). कई बार जब पंजा दर्पण दृश्य में occluded है के रूप में यह स्लॉट के माध्यम से गुजरता है, पंजा निर्देशांक पड़ोसी फ्रेम के आधार पर interpolated हैं.
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Representative Results
चूहे कुशल पहुँच कार्य को जल्दी से प्राप्त करते हैं, एक बार उपकरण के लिए अनुकूल हो जाते हैं, प्रदर्शन के साथ पहुँच की दोनों संख्याओं और सटीकता के संदर्भ में 1-2 सप्ताह (चित्र 5) से अधिक है। चित्र 6 DeepLabCut द्वारा पहचान की संरचनाओं को इंगित नमूना वीडियो फ्रेम से पता चलता है, और चित्र 7 एक ही सत्र से आरोपित व्यक्तिगत पहुँच tractories से पता चलता है. अंत में, चित्र 8में, हम वर्णन करते हैं कि पंजा का पता लगाने का ट्रिगर (चरण 4-3-4-3-6) सही रूप से सेट नहीं है, तो क्या होता है। फ्रेम में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता है जिस पर पंजा पहुंच स्लॉट का उल्लंघन करता है। यह पहुँच शुद्ध विज्ञान का विश्लेषण करने के मामले में एक बड़ी समस्या नहीं है। हालांकि, यह में परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जब हस्तक्षेप (उदा., optogenetics) आंदोलनों तक पहुँचने के दौरान शुरू कर रहे हैं.
चित्र 1: कुशल पहुंच कक्ष.
ऊपर से दक्षिणावर्त एक पक्ष दृश्य, सामने और ऊपर से एक दृश्य, फ्रेम जिसमें actuator घुड़सवार है (चरण 1.8 देखें), और पक्ष और इसके बाद के संस्करण से एक दृश्य हैं. कुशल पहुंच कक्ष (1) एक दरवाजा है (2) चूहों में रखा और कक्ष से बाहर ले जाने के लिए अनुमति देने के लिए एक पक्ष में कटौती. एक भट्ठा छत पैनल में कटौती की है (12) पशु tethered होने की अनुमति देने के लिए और छेद फर्श पैनल में कटौती कर रहे हैं (13) कूड़े के माध्यम से गिर करने के लिए अनुमति देते हैं. दो अवरक्त सेंसर (3) कक्ष के पीछे के दोनों ओर गठबंधन कर रहे हैं. एक दर्पण (4) पहुँच कक्ष के सामने (14) तक पहुँचने स्लॉट के ऊपर घुड़सवार है और दो अन्य दर्पण (6) तक पहुँचने कक्ष के दोनों ओर बढ़ रहे हैं. कुशल पहुँच कक्ष एक समर्थन बॉक्स (5) के ऊपर बैठता है. थे हाई-डेफिनिशन कैमरा (7) इस माउंटेड ओन थे सपोर्ट बॉक्स इन फ्रंट ऑफ़ थे पहुँच स्लॉट. काले कागज के दो टुकड़े (18) कैमरे के दोनों ओर (7) पक्ष दर्पण (6) में पंजा के विपरीत बढ़ाने के लिए मुहिम शुरू कर रहे हैं. समर्थन बॉक्स के नीचे एक फ्रेम है (8) कि रैखिक actuator का समर्थन करता है (16) और गोली जलाशय (9). एक गाइड ट्यूब गोली वितरण रॉड encasing (10) गोली जलाशय में फिट है और रैखिक actuator द्वारा नियंत्रित. छेद actuator फ्रेम में कटौती कर रहे हैं (17) और समर्थन बॉक्स (15) गोली जलाशय के ऊपर गोली वितरण रॉड ऊपर और नीचे स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देने के लिए. बॉक्स प्रकाश पैनलों (11) कैबिनेट की दीवारों और छत के लिए घुड़सवार के साथ प्रकाशित किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: एकल परीक्षण संरचना|
(ए) एक परीक्षण गोली वितरण रॉड के साथ शुरू होता है (एक रैखिक actuator द्वारा नियंत्रित) "तैयार" स्थिति पर तैनात (स्थिति 2 - मंजिल और स्लॉट तक पहुँचने के नीचे के बीच के बीच). (बी) चूहा अवरक्त (आईआर) बीम को तोड़ने के लिए कक्ष के पीछे जाता है, जिसके कारण गोली वितरण छड़ 3 स्थिति में वृद्धि होती है (स्थान तक पहुंचने के नीचे के साथ संरेखित)। (ग) चूहा गोली को समझने के लिए पहुँचता है। पहुँच सीधे स्लॉट के सामने पक्ष दर्पण दृश्य में ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र के भीतर पिक्सेल तीव्रता परिवर्तन का पता लगाता है कि एक FPGA framegrabber का उपयोग कर वास्तविक समय में पाए जाते हैं. जब पर्याप्त पिक्सेल उपयोगकर्ता परिभाषित "पाउ तीव्रता" से मेल खाते हैं, वीडियो अधिग्रहण ट्रिगर किया गया है। (डी) दो सेकंड बाद गोली को 1 स्थान पर उतारा जाता है, जो 2 स्थिति को रीसेट करने से पहले गोली जलाशय से एक नई गोली उठाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: नमूना अंशांकन छवि.
एक मदद हाथ कुशल पहुंच कक्ष के अंदर रखा गया है. एक मगरमच्छ क्लिप तक पहुँचने कक्ष के बाहर जगह में अंशांकन घन पकड़ करने के लिए पहुंच स्लॉट के माध्यम से pokes. तीन चेकरबोर्ड पैटर्न पूरी तरह से प्रत्यक्ष दृश्य और इसी दर्पण दृश्यों में दिखाई दे रहे हैं (हरा: बाएँ; लाल: ऊपर; और नीला: दाएँ). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: लर्निंग एल्गोरिथम मार्कर स्थितियाँ.
बायाँ स्तंभ: प्रत्यक्ष दृश्य; दाएँ स्तंभ: दर्पण दृश्य. मार्कर 1-4: MCP जोड़ों; 5-8: रंज जोड़ों; 9-12: अंकयुक्तियाँ; 13: पंजा तक पहुँचने के दोरसम; 14: नाक; 15: गैर-पहुँचने पंजा के डोर्सम. मार्कर 16 (गोली) दिखाई नहीं देता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: चूहे तेजी से स्वचालित कुशल पहुँचने के कार्य प्राप्त करते हैं।
औसत पहले पहुँच सफलता दर (हरा, बाएँ अक्ष) और औसत कुल परीक्षण (नीले, दाएँ अक्ष) स्वचालित कुशल पहुँच कार्य में पहले 20 प्रशिक्षण सत्रों पर (n ] 19). प्रत्येक प्रशिक्षण सत्र 30 मिनट तक चला त्रुटि सलाखों मतलब के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: नमूना वीडियो फ्रेम सीखने कार्यक्रम द्वारा चिह्नित.
बायाँ स्तंभ: दर्पण दृश्य; दाएँ स्तंभ: प्रत्यक्ष दृश्य. सियान, लाल, पीले, और हरे रंग के डॉट्स अंक 1-4, क्रमशः चिह्नित करते हैं। सफेद डॉट नाक के निशान, काले डॉट गोली के निशान. भरे हुए हलकों DeepLabCut द्वारा पहचान की गई. खुली वृत्तें उन ऑब्जेक्ट स्थितियों को चिह्नित करती हैं, जिनका अनुमान लगाया जाता है, जहाँ वह ऑब्जेक्ट विपरीत दृश्य में दिखाई दिया. एक्स के अंक फिर से अपने 3-डी स्थानों के अनुमान से वीडियो फ्रेम पर पेश कर रहे हैं. इस वीडियो फ्रेम 300 पर ट्रिगर किया गया था, के रूप में पंजा स्लॉट के माध्यम से पारित कर दिया. शीर्ष छवियों को पहले फ्रेम से कर रहे हैं जब तक पहुँचने पंजा का पता चला था. नीचे छवियों फ्रेम जिस पर दूसरे अंक अधिकतम बढ़ाया गया था से कर रहे हैं. इन फ्रेम छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर द्वारा पहचाने गए थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 7: एक ही परीक्षण सत्र से नमूना 3-डी tradictories.
दोनों अक्ष एक ही डेटा दिखाते हैं, लेकिन प्रस्तुति में आसानी के लिए घुमाया जाता है. काली रेखाएँ माध्य त्रासदियों को इंगित करती हैं। सियान, लाल, पीले, और हरे रंग अंक 1-4, क्रमशः के सुझावों के व्यक्तिगत tracectories हैं. नीली रेखाएँ पंजा दोरसम की प्रक्षेप पथ को इंगित करती हैं। बड़े काले डॉट चीनी गोली (0,0,0) पर स्थित इंगित करता है. यह प्रस्तुति में आसानी के लिए केवल प्रारंभिक पंजा उन्नति का प्रतिनिधित्व करता है (वापसी और कई पहुँचों सहित आंकड़ा लगभग uninterpretable बनाता है). तथापि, विश्लेषण के लिए सभी शुद्धगतिक आंकड़े उपलब्ध हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 8: फ्रेम संख्या के हिस्टोग्राम जिसमें 2 अलग-अलग सत्रों के लिए विशिष्ट पहुंच चरणों की पहचान की गई थी।
एक सत्र (अंधेरे ठोस लाइनों) में, ROI ट्रिगर मूल्यों को ध्यान से सेट किया गया था, और पंजा प्रत्येक परीक्षण में एक ही कुछ फ्रेम के भीतर स्लॉट उल्लंघन की पहचान की थी. दूसरे सत्र में (प्रकाश तेज लाइनों), नाक अक्सर तक पहुँचने पंजा के रूप में गलत पहचान की थी, वीडियो अधिग्रहण समय से पहले ट्रिगर. ध्यान दें कि यह ऑफ लाइन शुद्ध विश्लेषण पर थोड़ा प्रभाव होगा जब तक कि पूरी पहुंच पर कब्जा नहीं किया गया था. हालांकि, संभावित हस्तक्षेप तक पहुँचने पंजा द्वारा ट्रिगर खराब समय हो जाएगा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
Rodent कुशल तक पहुँचने मोटर प्रणाली शरीर क्रिया विज्ञान और pathophysiology का अध्ययन करने के लिए एक मानक उपकरण बन गया है. हम कैसे एक स्वचालित चूहे कुशल तक पहुँचने के कार्य है कि अनुमति देता है लागू करने के लिए वर्णित है: प्रशिक्षण और न्यूनतम पर्यवेक्षण के साथ परीक्षण, 3-डी पंजा और अंक प्रक्षेप पथ पुनर्निर्माण (तक पहुँचने के दौरान, लोभी, और पंजा वापसी), वास्तविक समय की पहचान पहुँचने के दौरान पंजा, और बाहरी इलेक्ट्रॉनिक्स के साथ तुल्यकालन. यह शरीर क्रिया विज्ञान के साथ forelimb शुद्ध गति से सहसंबंधित करने के लिए या आंदोलनों तक पहुँचने के दौरान ठीक समय पर हस्तक्षेप करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
जब से हम शुरू में इस डिजाइन14की सूचना दी, हमारे प्रशिक्षण दक्षता में सुधार हुआ है ताकि चूहों के लगभग 100% कार्य प्राप्त. हम कई महत्वपूर्ण कारकों है कि लगातार सफल प्रशिक्षण के लिए नेतृत्व की पहचान की है. भूख से प्रेरित कई कार्यों के साथ के रूप में, चूहों ध्यान से गरमी प्रतिबंध के दौरान निगरानी की जानी चाहिए उनके प्रत्याशित शरीर के वजन के 80-90% बनाए रखने के लिए. दैनिक चूहों हैंडलिंग, यहां तक कि प्रशिक्षण से पहले, गंभीर रूप से उन्हें मनुष्यों के लिए acclimate करने के लिए महत्वपूर्ण है. चूहे छर्रों अनुरोध करने के लिए कक्ष के पीछे लौटने के लिए सीखने से पहले तक पहुँचने के लिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए-यह बहुत प्रशिक्षण समय कम कर देता है और संभावना है कि चूहों कार्य प्राप्त में सुधार. अंत में, जब प्रतीत होता है समान कक्षों के बीच स्थानांतरित, चूहों अक्सर कम पहुँच प्रदर्शन. यह विशेष रूप से सच था जब कक्षों पहली बार के लिए इस्तेमाल किया गया था. हम सोचते हैं कि यह कक्षों के बीच खुशबू में अंतर के कारण है. जो भी कारण है, यह संभव के रूप में स्थिर एक प्रशिक्षण वातावरण के रूप में बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, या सभी बक्से में परीक्षण हो सकता है करने के लिए चूहों acclimate.
यहाँ वर्णित उपकरण विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए आसानी से अनुकूलनीय है। हम कार्य के एक चूहे संस्करण का वर्णन किया है, लेकिन यह भी एक माउस संस्करण लागू किया है (हालांकि यह चूहों में DeepLabCut के साथ अलग-अलग अंकों की पहचान करने के लिए मुश्किल है). अलग-अलग वीडियो फ्रेम TTL दालों के साथ चिह्नित कर रहे हैं, क्योंकि वीडियो डिजिटल या एनालॉग आदानों (उदा., electrophysiology एम्पलीफायरों या photometry) स्वीकार करता है कि किसी भी रिकॉर्डिंग प्रणाली के साथ सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है। अंत में, सिर तय चूहों आसानी से कुशल 9 तक पहुँचने प्रदर्शन, और इस कार्य के एक सिर तय संस्करण 2-photon इमेजिंग या जक्सटाकोशिक रिकॉर्डिंग के लिए लागू किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात, हम केवल लंबे-Evans चूहों, जिनकी नाक और पंजा फर (काले और सफेद, क्रमशः) रंग में काफी अलग है कि नाक pokes पहुँच के लिए गलत नहीं हैं के साथ इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है (उचित रॉय सेटिंग्स के साथ, चित्रा 8). यह उनके पंजे और नाक (जैसे, albino चूहों) पर इसी तरह के रंग के साथ चूहों के लिए एक समस्या हो सकती है, लेकिन स्याही, नेल पॉलिश, या टैटू के साथ पंजा रंग से हल किया जा सकता है।
कुशल पहुँचने के प्रस्तुत संस्करण विशिष्ट आवेदन के आधार पर फायदेमंद हो सकता है, जो कई अलग सुविधाओं, है. अपेक्षाकृत जटिल हार्डवेयर और वास्तविक समय वीडियो प्रसंस्करण के लिए की जरूरत है यह खराब घर पिंजरे प्रशिक्षण6,7के लिए अनुकूल बनाते हैं। दूसरी ओर, घर पिंजरे प्रशिक्षण यह मुश्किल कई कोणों से उच्च गति उच्च संकल्प वीडियो प्राप्त करने के लिए बनाता है, या शारीरिक रिकॉर्डिंग के लिए जानवरों तार / डेटा अधिग्रहण कार्ड और कक्ष प्रति एक कंप्यूटर के लिए आवश्यकता प्रत्येक कक्ष अपेक्षाकृत महंगा बनाता है, और वीडियो महत्वपूर्ण डिजिटल भंडारण स्थान की आवश्यकता होती है ($ 200 एमबी प्रति 4 s वीडियो). यह वास्तविक समय प्रतिक्रिया या बाहरी उपकरणों के साथ सिंक्रनाइज़ करने की क्षमता का अभाव है, हालांकि हम, चैंबर प्रति $ 300 के बारे में लागत एक सरल microcontroller आधारित संस्करण लागू किया है. इन बक्से अनिवार्य रूप से यहाँ वर्णित उन लोगों के समान हैं, लेकिन एक वाणिज्यिक camcorder का उपयोग करें और microcontroller कार्यक्रम को छोड़कर एक कंप्यूटर की आवश्यकता नहीं है (इस सेट अप और संबद्ध सॉफ्टवेयर के विवरण अनुरोध पर उपलब्ध हैं). FPGA फ्रेम-गब्बर पर वास्तविक समय वीडियो प्रसंस्करण विशेष रूप से उपयोगी है; हम पाते हैं कि यह और अधिक मजबूती से अवरक्त बीम या निकटता सेंसर की तुलना में वास्तविक समय में पहुँच तात्परित करता है (जो तक पहुँचने पंजा के लिए चूहे के snout गलती हो सकती है). इसके अलावा, कई ट्रिगर्स का उपयोग विभिन्न पहुंच चरणों में पंजा की पहचान करने के लिए किया जा सकता है (उदा., स्लॉट के लिए दृष्टिकोण, पंजा लिफ्ट, स्लॉट के माध्यम से विस्तार)। यह न केवल reproduible की अनुमति देता है, ठीक समय न्यूरॉन क्षोभ, लेकिन कम उच्च गति वीडियो के भंडारण को गति प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
जबकि कुशल तक पहुँचने के हमारे स्वचालित संस्करण विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए कई फायदे हैं, यह भी कुछ सीमाएं हैं. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, उच्च गति, उच्च संकल्प कैमरा मामूली महंगा है, लेकिन एक ही छवि में दर्पण और प्रत्यक्ष विचारों को शामिल करने और बहुत जल्दी पहुंच आंदोलन पर कब्जा करने के लिए आवश्यक है. एक कैमरा का उपयोग सिंक्रनाइज़ और एक साथ कई वीडियो धाराओं रिकॉर्ड, या कई कैमरों और फ्रेम grabbers खरीद करने की आवश्यकता समाप्त. परिलक्षित दृश्य में पंजा प्रभावी रूप से दो बार के बारे में के रूप में कैमरे से दूर है (रे-ट्रैकिंग द्वारा) के रूप में प्रत्यक्ष दृश्य में. इसका अर्थ यह है कि एक दृश्य हमेशा ध्यान से बाहर रहता है, यद्यपि DLC अभी भी दोनों दृश्यों में अलग-अलग अंकों की मजबूती से पहचान करता है (चित्र 4, चित्र 6) . अंत में, हम एक रंग कैमरा इस्तेमाल किया क्योंकि, DLC की उपलब्धता से पहले, हम रंग टैटू के साथ अंक कोडिंग की कोशिश की. हालांकि यह संभव है कि इस सीखने आधारित कार्यक्रम काले और सफेद (या कम संकल्प) वीडियो पर समान रूप से प्रभावी होगा, हम केवल हार्डवेयर की प्रभावशीलता यहाँ वर्णित सत्यापित कर सकते हैं. अंत में, हमारे विश्लेषण कोड (DLC के अलावा अन्य) एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर पैकेज में मुख्य रूप से लिखा है (सामग्री की तालिकादेखें) लेकिन सरल स्रोत प्रोग्रामिंग भाषाओं को खोलने के लिए अनुकूल होना चाहिए (जैसे, अजगर) के रूप में की जरूरत है.
हम इस प्रणाली में सुधार करने के लिए कई तरीके अपना रहे हैं। वर्तमान में, दर्पण दृश्य आंशिक रूप से सामने पैनल द्वारा occluded है. इसलिए हम बाधाओं को कम करते हुए पंजा के कई एक साथ विचारों को प्राप्त करने के तरीके तलाश रहे हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण विकास स्वचालित रूप से पहुँच स्कोर करने के लिए किया जाएगा (प्रणाली शुद्ध गति विज्ञान ट्रैक कर सकते हैं, लेकिन एक मानव अभी भी सफल बनाम असफल पहुँच स्कोर चाहिए). यह निर्धारित करने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं कि क्या छर्रों को शेल्फ/पेडस को गिरा दिया गया था, लेकिन यह निर्धारित नहीं कर सकते कि गोली को पकड़ लिया गया था या पूरी तरह से11चूक गया था। DLC के साथ गोली पर नज़र रखने से, हम परीक्षण प्रति पहुँच की संख्या निर्धारित करने के लिए एल्गोरिदम की खोज कर रहे हैं, साथ ही गोली समझ लिया गया था कि क्या, आसन बंद खटखटाया, या पूरी तरह से याद किया. उन पंक्तियों के साथ, हम वीडियो रूपांतरण, DLC प्रसंस्करण, और स्वत: स्कोरिंग के माध्यम से डेटा संग्रह से वर्कफ़्लो को पूरी तरह से स्वचालित करने के लिए भी काम कर रहे हैं। अंत में, हम एक प्रणाली है जिसमें कई प्रयोगों को एक दिन पर चलाया जा सकता है कल्पना, और अगली सुबह तक पूर्ण forelimb शुद्ध गति विज्ञान और प्रत्येक प्रयोग के लिए स्कोर तक पहुँचने निर्धारित किया गया है.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखक कुशल पहुंच कार्य के बारे में सलाह के लिए करुणेश गांगुली और उनकी प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहते हैं, और अलेक्जेंडर और मैकेंज़ी मैथिस DeepLabCut अनुकूलन में उनकी मदद के लिए. यह काम राष्ट्रीय न्यूरोलॉजिकल रोग और स्ट्रोक संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था (संख्या K08-NS072183 अनुदान) और मिशिगन विश्वविद्यालय.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| clear polycarbonate panels | TAP Plastics | cut to order (see box design) | |
| infrared source/detector | Med Associates | ENV-253SD | 30" range |
| camera | Basler | acA2000-340kc | 2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link |
| camera lens | Megapixel (computar) | M0814-MP2 | 2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus |
| camera cables | Basler | #2000031083 | Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables |
| mirrors | Amazon | ||
| linear actuator | Concentrics | LACT6P | Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer |
| pellet reservoir/funnel | Amico (Amazon) | a12073000ux0890 | 6" funnel |
| guide tube | ePlastics | ACREXT.500X.250 | 1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long |
| pellet delivery rod | ePlastics | ACRCAR.250 | 0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length) |
| plastic T connector | United States Plastic Corp | #62065 | 3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee |
| LED lights | Lighting EVER | 4100066-DW-F | 12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool |
| Light backing | ePlastics | ACTLNAT0.125X12X36 | 0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet |
| Light diffuser films | inventables | 23114-01 | .007x8.5x11", matte two sides |
| cabinet and custom frame materials | various (Home Depot, etc.) | 3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure) | |
| acoustic foam | Acoustic First | FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick) | |
| ventilation fans | Cooler Master (Amazon) | B002R9RBO0 | Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers |
| cabinet door hinges | Everbilt (Home Depot | #14609 | continuous steel hinge (1.4" x 48") |
| cabinet wheels | Everbilt (Home Depot | #49509 | Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake |
| cabinet door handle | Everbilt (Home Depot | #15094 | White light duty door pull (4.5") |
| computer | Hewlett Packard | Z620 | HP Z620 Desktop Workstation |
| Camera Link Frame Grabber | National Instruments | #781585-01 | PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full |
| Multifunction RIO Board | National Instruments | #781100-01 | PCIe-17841R |
| Analog RIO Board Cable | National Instruments | SCH68M-68F-RMIO | Multifunction Cable |
| Digital RIO Board Cable | National Instruments | #191667-01 | SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series |
| Analog Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| Digital Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| 24 position relay rack | Measurement Computing Corp. | SSR-RACK24 | Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel |
| DC switch | Measurement Computing Corp. | SSR-ODC-05 | Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A |
| DC Sense | Measurement Computing Corp. | SSR-IDC-05 | solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC |
| DC Power Supply | BK Precision | 1671A | Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply |
| sugar pellets | Bio Serv | F0023 | Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored) |
| LabVIEW | National Instruments | LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions | 64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW |
| MATLAB | Mathworks | Matlab R2019a | box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox |
References
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