Summary
Cirkulär RNAs (circRNAs) är icke-kodande RNAs som kan ha roller i transkriptionell reglering och förmedla interaktioner mellan proteiner. Efter bedömning av olika parametrar för byggandet av circRNA sekvenserings bibliotek, ett protokoll sammanställdes utnyttjar Stranded totalt RNA Library beredning med RNase R pre-behandling och presenteras här.
Abstract
Cirkulär RNAs (circRNAs) är en klass av icke-kodning RNAs inblandade i funktioner inklusive mikro-RNA (miRNA) reglering, medling av protein-protein interaktioner, och reglering av föräldrarnas gentranskription. I klassisk nästa generations RNA-sekvensering (RNA-SEQ) förbises circRNAs vanligtvis som ett resultat av poly-A-val under byggandet av mRNA-bibliotek, eller finns i mycket låg förekomst, och är därför svåra att isolera och upptäcka. Här, en circRNA bibliotek konstruktions protokoll optimerades genom att jämföra bibliotek förberedelse kit, pre-behandling alternativ och olika totala RNA ingångsbelopp. Två kommersiellt tillgängliga hela transkriptome bibliotek förberedelse kit, med och utan RNase R förbehandling, och med hjälp av varierande mängder av totala RNA-ingången (1 till 4 μg), testades. Slutligen, flera vävnadstyper; inklusive lever, lungor, lymfkörtel, och bukspottkörteln; och flera hjärnregioner; inklusive lillhjärnan, sämre parietallob, mellersta tidsmässiga gyrus, occipital cortex, och överlägsen frontal gyrus; jämfört med att utvärdera circRNA-överflöd över vävnadstyper. Analys av den genererade RNA-SEQ data med hjälp av sex olika circRNA detekterings verktyg (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC, och CIRCexplorer) visade att en icke-återvinningsbara totalt RNA bibliotek förberedelse kit med RNase R pre-behandling och 4 μg RNA-ingång är den optimala metod för att identifiera det högsta relativa antalet circRNAs. I överensstämmelse med tidigare fynd observerades den högsta anrikningen av circRNAs i hjärnvävnader jämfört med andra vävnadstyper.
Introduction
Cirkulär rnas (circrnas) är endogena, icke-kodning rnas som har fått uppmärksamhet med tanke på deras genomträngande uttryck i eukaryota transkriptome1,2,3. De bildas när exonerna back-splice till varandra och därmed ansågs inledningsvis vara splitsning artefakter4,5. Nyligen genomförda studier har dock visat att circrnas uppvisar celltyp, vävnad och utvecklingsstadiet specifikt uttryck3,6 och är evolutionärt bevarad2,3. Dessutom är de inblandade i medling av protein-protein interaktioner7, Micro-RNA (Mirna) bindning3,8,9,10, och reglering av föräldra Gene transkription11.
I klassisk RNA-sekvensering (RNA-SEQ) kan circRNAs helt försvinna under biblioteks konstruktionen till följd av poly-A-val för mRNA eller kan vara svårt att isolera med tanke på deras låga förekomst. De senaste circrna karakteriseringsstudierna har dock införlivat ett steg före behandling med RNase R för att berika circrnas2,12,13. RNase R är en exoribonuclease som smälter linjär rnas, lämnar bakom cirkulära RNA strukturer. CircRNA anrikning protokoll optimerades genom att generera och jämföra data från två kommersiellt tillgängliga hela transkriptome bibliotek byggsatser, med och utan en RNase R före behandling steg, och med varierande mängder av totala RNA-ingång (1 till 4 μg). Det optimerade protokollet användes sedan för att utvärdera förekomsten av circRNAs i fem olika hjärnregioner (cerebellum [BC], sämre parietallob [IP], mellersta tidsmässiga gyrus [MG], occipital cortex [OC] och överlägsen frontal gyrus [SF]) och fyra andra vävnadstyper (lever [LV], lung [LU], lymfkörtel [LN] och bukspottkörteln [PA]). RNA-SEQ-biblioteken var Parade end sekvenserade och data analyserades med hjälp av sex olika algoritmer circrna förutsägelse: find_circ3, Ciri14, mapsplice15, kniv16, DCC17, och circexplorer18. Baserat på vår analys upptäcktes det högsta antalet unika circRNAs vid användning av en icke-återvinningsbara total RNA-biblioteksberedning med RNase R pre-Treatment och 4 μg totalt ingångrna. Det optimerade protokollet beskrivs här. Som tidigare rapporterats19,20observerades den högsta anrikningen av circrnas i hjärnan jämfört med andra vävnadstyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna forskning har utförts i enlighet med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för mänsklig välfärd. Hjärnvävnader erhölls från banner Sun Health Research Institute hjärna och kropp donation program i Sun City, AZ. Verksamheten i hjärnan och kroppen donation programmet är godkända av den västerländska institutionella Granskningsnämnden (WIRB Protocol #20120821). Alla försökspersoner eller deras juridiska ombud undertecknade informerat samtycke. Kommersiella (icke-hjärna) biospecimen köptes från Proteogenex.
1. RNase R behandling
Anmärkning: I följande steg justeras reaktions volymen till en total volym på 50 μL. Detta är den minsta provvolym som ska användas i RNA Cleanup & koncentratorsatsen (se tabell över material). Dessutom är det optimerade protokollet som beskrivs här för ett inmatnings belopp på 4 μg totalt RNA. En längre inkubationstid för behandling med RNase rekommenderas för ett ingångsbelopp > 4 μg.
- Späd totalt RNA till 4 μg i 39 μL RNase-fritt vatten i ett microcentrifugerör och blanda väl genom pipettering.
- Späd ut RNase R i ett separat rör till en arbets koncentration på 2 U/μL med 1x RNase R reaktionsbuffert. Gör bara tillräckligt för omedelbar användning.
- Pipettera 39 μL totalt RNA och 5 μL 10X RNase R reaktionsbuffert i ett 1,5 mL reaktionsrör och blanda väl genom pipettering (50 μL kommer att vara den totala reaktions volymen). Tillsätt därefter 6 μL RNase R (2 U/μL).
- Justera pipetten till den fullständiga reaktions volymen (50 μL) och blanda väl genom att Pipettera upp och ner 10 gånger.
- Placera röret i en 37 ° c vattenbad i 10 min. se till att hela reaktions volymen är nedsänkt i vattenbadet.
- Placera röret på isen och omedelbart fortsätta med RNA sanering & koncentration (avsnitt 2).
2. rening av RNA med hjälp av ett RNA Cleanup-och Koncentratorkit
Anmärkning: Vid användning av hög kvalitet RNA (RIN > DV200 > 80%), RNase R behandling kan resultera i förlust av cirka 60% av RNA. Med hjälp av en 4 μg-ingång uppskattas 2 – 2,5 μg av behandlat RNA lämnas efter avsnitt 1.
- Innan du börjar, Förbered RNA-tvättbufferten genom att tillsätta 48 mL 100% etanol till buffertkoncentratet och blanda väl genom pipettering. Placera renings kolonner i uppsamlings rören (se tabell över material) och placera dem i ett rör rack.
Anmärkning: Använd följande centrifugeringsinställningar för alla följande steg: 10000 – 16000 x g. Om behandling med DNase I redan har utförts, hoppa över DNase I behandling I detta skede. - Tillsätt 2 volymer RNA-bindningsbuffert till det Rase-behandlade provet och blanda väl genom pipettering (total volym: 150 μL).
- Tillsätt 1 volym 100% etanol till RNA-Bindningsbufferten och RNase R-behandlade provblandningen och blanda väl genom pipettering (total volym: 300 μL).
- Överför hela volymen till kolonnen och centrifugera kolonnen i 30 s. Kassera flödet genom.
- Tillsätt 400 μL RNA prep-buffert direkt till kolonnen, Centrifugera kolonnen i 30-talet och kassera flödet genom.
- Tillsätt 700 μL RNA-tvättbuffert direkt till kolonnen, Centrifugera kolonnen i 30-talet och kassera flödet genom.
- Tillsätt 400 μL RNA-tvättbuffert direkt till kolonnen, Centrifugera kolonnen i 2 min, och överför kolonnen till en färsk RNase-fri 1,5 mL tub.
- Tillsätt 11 μL av RNase-fritt vatten direkt till kolonnen genom att hålla pipettspetsen precis ovanför kolumnfiltret och se till att vatten endast landar på kolumnfiltret.
- Inkubera kolonnen i 1 min vid rumstemperatur och Centrifugera i 1 min.
- Innan du kastar kolonnen, kontrollera flödet genom i RNase-fria röret. Om elueringen lyckades, förvara provet vid-80 ° c eller Fortsätt omedelbart med biblioteks beredningen. Den slutliga totala elutionsvolymen på cirka 10 μL används för biblioteks uppbyggnad.
Anmärkning: Stopp punkt: lämna RNA vid-80 ° c i upp till 7 dagar innan du fortsätter med biblioteks förberedelse.
3. circRNA bibliotek prep
Anmärkning: Se tabell över material för kit, som innehåller de flesta reagenser som används i detta avsnitt.
- rRNA utarmning och fragmentering
- Överför 10 μL renat RNA från steg 2,10 till en ren brunn i en ny 96-och 0,3 mL PCR-platta. Till brunnen, tillsätt 5 μL rRNA-bindningsbuffert följt av 5 μL rRNA Removal mix. Pipettera försiktigt upp och ner 10 gånger för att blanda.
- Tätnings plattan och inkubera i 5 min vid 68 ° c på ett förprogrammerat, förvärmd termocyklerblock. Efter avslutad 5 min inkubation, placera plattan på bänken och inkubera i rumstemperatur under 1 min.
- Ta bort tätningen från plattan. Tillsätt 35 μL av vortexed rumstemperatur rRNA avlägsnande pärlor att provet. Justera pipetten till 45 μL och Pipettera upp och ned 10 – 20x för att blanda noggrant. Inkubera plattan i 1 min vid rumstemperatur.
- Överför plattan till ett magnetiskt stativ och inkubera på stativet i 1 min eller tills lösningen rensas. Överför alla supernatanten (~ 45 μL) till ny brunn på samma platta, eller ny platta (beroende på hur många prover du arbetar med).
- Vortex RNA rengöring pärlor (se tabell över material) tills väl spridda, och tillsätt 99 μl av pärlor till varje prov. Pipettera upp och ner 10X för att blanda. Inkubera plattan i rumstemperatur i 10 minuter.
- Överför plattan till magnet stativet och inkubera ytterligare 5 min eller tills lösningen rensas. Ta bort och kassera alla supernatanten från brunnen.
- Med plattan fortfarande på det magnetiska stativet, tillsätt 200 μL av nyberedd 80% EtOH till brunnen utan att störa pärlorna. Inkubera i 30-talet och ta sedan bort och kassera etanol. Upprepa för totalt 2 tvättar.
- Tillsätt 11 μL Elueringbuffert i varje brunn och Pipettera upp och ner 10 gånger för att blanda. Inkubera i rumstemperatur i 2 minuter och överför sedan till det magnetiska stativet tills lösningen rensas (1 – 5 min).
- Överför 8,5 μL av supernatanten från brunnen till en ny brunn på samma platta eller till en ny tallrik. Tillsätt 8,5 μL av Elute, primer, fragment hög mix till varje brunn som innehåller provet. Pipettera upp och ner 10 gånger för att blanda ordentligt.
- Tätnings plattan och inkubera i 8 min vid 94 ° c på ett förprogrammerat, förvärmd termocyklerblock. Avlägsna från termocyklern när den når 4 ° c och centrifugera kort.
Anmärkning: Gå genast vidare till synthesize First strand cDNA-protokollet.
- Syntetisera cDNA
- För varje prov som bereds, blanda 9 μL första del syntes blandning med 1 μL omvänt transkriptas (se tabell över material). Tillsätt 8 μL av blandningen i provet. Pipettera upp och ner 6 gånger för att blanda.
- Tätnings plattan och inkubera på ett förprogrammerat, förvärmd termocyklerblock med följande parametrar: 25 ° c i 10 min, 42 ° c i 15 min, 70 ° c i 15 min, 4 ° c stadga. Fortsätt omedelbart till andra Strands syntes.
- Tillsätt 5 μL resuspension-buffert till varje prov, följt av 20 μL andra del av den andra sträng blandningen. Pipettera hela volymen upp och ner 6 gånger.
- Tätnings plattan och inkubera på ett förprogrammerat, förvärmd termocyklerblock inställt på 16 ° c i 1 h. Efter inkubering, ta bort plattan från termocyklern och låt den jäms till rumstemperatur.
- Vortex PCR-rening pärlor (se tabell över material) och tillsätt 90 μl pärlor till varje brunn av prov. Pipettera upp och ner 10 gånger för att blanda ordentligt. Inkubera i rumstemperatur i 10 minuter.
- Överför pärlan/provblandningen till det magnetiska stativet och inkubera i 5 min eller tills vätskan försvinner. Ta bort och Kassera supernatanten.
- Tillsätt 200 μL 80% EtOH till varje prov. Inkubera prover på magnet stativet i rumstemperatur under 30 s. Kassera supernatanten. Upprepa 1x.
- Låt pärlor torka i rumstemperatur i 6 min, och sedan ta bort från magnetiskt stativ.
- Omsuspendera pärlor i 19,5 μL resuspension buffert. Pipettera upp och ner 10 gånger för att blanda ordentligt. Inkubera i rumstemperatur i 2 minuter, överför sedan till det magnetiska stativet och inkubera i ytterligare 1 min eller tills vätskan försvinner.
- Överför 17,5 μL supernatanten till ny brunn/ny plåt.
Anmärkning: Om du inte fortsätter omedelbart kan proverna förvaras vid-20 ° c i upp till 7 dagar.
- För varje prov som bereds, blanda 9 μL första del syntes blandning med 1 μL omvänt transkriptas (se tabell över material). Tillsätt 8 μL av blandningen i provet. Pipettera upp och ner 6 gånger för att blanda.
- Förberedelse av bibliotek
- Tillsätt 12,5 μL av en-tailing blandning till varje brunn som innehåller supernatanten. Pipettera hela volymen upp och ner 10 gånger för att blanda.
- Inkubera reaktionen på ett förprogrammerat, förvärmt thermocyclerblock inställt på 37 ° c med följande parametrar: 37 ° c i 30 min, 70 ° c i 5 min, 4 ° c stadga. När proverna når 4 ° c, Fortsätt omedelbart till adapterligering.
- Tillsätt 2,5 μl Resuspendebuffert i varje prov, 2,5 μL av en unik RNA-adapter och 2,5 μL Ligationsblandning. Pipettera upp och ner 10X för att blanda.
- Inkubera proverna på ett förprogrammerat, förvärmt thermocyclerblock vid 30 ° c i 10 min.
- Tillsätt 5 μL Stoppligationsbuffert i varje prov och Pipettera uppåt och nedåt för att blanda.
- Tillsätt 42 μL blandat PCR-renings pärlor i varje prov och blanda noggrant. Följ stegen 3.2.6 till och med 3.2.10, men ändra resuspendevolymen till 52 μL och slutlig elutionsvolym till 50 μL.
- Upprepa PCR-renings pärlprotokollet igen med 50 μL eluering från steg 3.3.6, men ändra återfjädrande volym till 22 μL och slutlig elutionsvolym till 20 μL.
Anmärkning: Om du inte fortsätter omedelbart kan proverna förvaras vid-20 ° c i upp till 7 dagar. - Tillsätt 5 μL PCR primer cocktail och 25 μL PCR Master Mix till varje prov. Blanda genom att Pipettera upp och ner 10 gånger. Inkubera reaktionen på ett förprogrammerat, förvärmd termocyklern-block med följande parametrar: 98 ° c i 30 s; därefter 8 cyklar av 98 ° c för 10 s, 60 ° c för 30 s och 72 ° c för 30 s; sedan 72 ° c i 5 min, sedan 4 ° c håll.
Anmärkning: Optimering av det totala antalet PCR-cykler kan behövas för att generera tillräckliga mängder bibliotek för sekvensering. - Följ protokollet för rening av PCR-granulum (steg 3.2.4 till 3.2.9), med undantag för Tillsätt 50 μL av väl blandade PCR-renings pärlor och ändra resuspenderad volym till 32,5 μL med en slutlig elutionsvolym på 30 μL.
Anmärkning: Proverna ska förvaras vid-20 ° c.
- Kvantifiering och kvalitetskontroll med hjälp av en nukleinsyrafalysator
- Låt band och reagenser jämvikt i rumstemperatur i 30 min.
- Blanda 2 μL bibliotek med 2 μL HS D1000-buffert och Lägg till en kompatibel brunn-platta.
- Tätar tätt med kompatibel folie tätning, och Vortex för 1 min vid 2 000 RPM.
- Snurra ner och Last plattan på analysatorn efter programvaru uppmaningar.
Anmärkning: Biblioteken bör vara cirka 260 BP i storlek.
4. arbetsflöde för data analys
- Sekvens RNA-SEQ-bibliotek (se tabell över material) för att generera 82 BP Parade-end läsningar. Konvertera rå sekvenserings data i form av basecall-filer (. BCL) till FASTQs med hjälp av verktyget bcl2fastq (v 0.2.19).
- Identifiera circRNAs.
Anmärkning: Baserat på tidigare rapporterade belägg för att en ensemble circrna detekteringsmetod presterar bättre jämfört med att använda ett enda detektionsverktyg21,22, föreslår vi att du använder flera verktyg för circrna-detektering. Här identifierades circRNAs med hjälp av sex befintliga algoritmer för circRNA-förutsägelse: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE och DCC, och tillämpade de rekommenderade parameterinställningarna för varje algoritm.- Hämta och installera varje circRNA-detekteringsalgoritm på ett Linux högpresterande datorkluster med hjälp av de instruktioner som tillhandahålls av utvecklarna.
- Justera RNA-SEQ FASTQs mot referensgenomet (GRCh37), med hjälp av den Aligner som rekommenderas för varje verktyg.
- Efter justering, kör circRNA detekteringsalgoritmer genom att tillämpa deras respektive rekommenderade parameterinställningar.
- Varje verktyg kommer att mata ut en resultatfil med flera kolumner med listan över upptäckta circRNAs, extrahera circRNA-koordinaterna och antalet stödjande läsningar från detta för att kvantifiera antalet kandidater som upptäcks i varje prov/test-villkor.
- Konvertera circRNA koordinater utdata från CIRI, Mapsplice och DCC till 0-baserade koordinater ska överensstämma med de andra tre algoritmer.
- Välj circRNAs med två eller flera stödjande läsningar eller nedströms analyser och jämförelser. Tabell 1 sammanfattar alla parametrar som utvärderats i vår studie tillsammans med det totala antalet sekvenserings läsningar som genererats för varje prov.
- För varje prov/test-villkor räknar du antalet identifierade circRNAs som normaliserats till antalet mappade läsningar som genererats för biblioteket, per miljon. Sammanfatta resultaten i de olika verktygen/exemplen i fält diagram, som beskrivs i representativa resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data som genereras med hjälp av en kommersiellt tillgänglig Universal Control RNA (UC) och med hjälp av två bibliotek berednings satser, som båda inkluderar en ribo-utarmning steg i sina protokoll, bedömdes först. Med hjälp av ett analytiskt arbetsflöde (data analys arbetsflöde, avsnitt 4) upptäcktes ett större antal circRNAs i TruSeq-datauppsättningarna jämfört med kapa Ones (figur 1). Även om de ribosomala RNA (rRNA) procenten låg under 5% i datauppsättningar från båda satserna för lägre ingångs mängder (1,2 UG) hade kapa datamängder högre rRNA-innehåll för 4, 5 och 10 UG-ingångar (tabell 2). Därför, baserat på antalet upptäckta circRNAs och rRNA utarmning effektivitet, ytterligare experiment utfördes med hjälp av TruSeq kit.
Därefter testades betydelsen av RNase R förbehandling genom att jämföra de data som genereras från RNase R förbehandlade och icke-pre-behandlade bibliotek. För detta ändamål, totalt RNA extraherades från MG friska äldre individer och sekvensering data som genereras från bibliotek med (N = 3) och utan (N = 3) förbehandling med RNase R23 jämfördes. Ett större antal circRNAs identifierades genomgående i de förbehandlade biblioteken jämfört med de icke-förbehandlade (figur 2). Detta förväntas eftersom förbehandling avlägsnar linjär RNAs, vilket berikar för circRNA arter.
För det tredje testades den mängd indata-RNA som skulle vara optimala för att upptäcka en högre variation av circRNAs. Biblioteken bereddes med 1, 2 och 4 μg totalt ingångarna RNA som extraherades från MG, OC, och SF hjärnregioner, och liksom UC RNA. Genom att jämföra det överflöd av circRNAs som upptäckts från varje bibliotek observerades den högsta mångfalden av circRNA-arter vid användning av 4 μg ingångrna jämfört med 2 och 1 μg (figur 3), vilket avspeglas i antalet unika circrnas som identifierats. Ett förbehåll att notera är att även om olika inkubationstider under RNase R behandling inte testades, en trend där ett ökande antal circRNAs upptäcktes över totala RNA-ingångar på 1 till 4 μg observerades vid kontroll av alla andra parametrar.
Det här optimerade protokollet tillämpades sedan på flera olika vävnadstyper för att jämföra circRNA-abundans. Fem hjärnregioner, inklusive BC, MG, OC, IP, och SF, från fyra friska äldre individer, testades, tillsammans med fyra andra vävnadstyper, inklusive LV, LU, LN och PA, från sex friska donatorer. Sammantaget observerades en högre förekomst av circrnas i hjärnan jämfört med andra vävnadstyper (figur 4), vilket tidigare har rapporterats19,20.
Figur 1: CircRNA-detektering med hjälp av TruSeq vs. kapa total RNA-satser. Sekvenserings data genererades för UC RNA med hjälp av två separata totala RNA-biblioteksberednings satser, vardera med 1, 2, 4, 5 och 10 μg ingångsrna och ribonukleas r (RNase r) förbehandling. Antalet circRNAs som upptäcktes av verktygen i varje sampling normaliserades till antalet mappade läsningar, per miljon (Y-axeln). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: CircRNA-detektion med och utan RNase R förbehandling. Sekvensering data som genereras med hjälp av TruSeq kit användes för att jämföra effekterna av RNase R förbehandling. RNA extraherades från den mellersta temporala gyrus (MG) av friska äldre kontroller för denna analys. Det normaliserade antalet circRNAs som upptäcktes (Y-axeln) beräknades på samma sätt som i figur 1. RNase R + = förbehandlat med RNase R, RNase R-= ej förbehandlat med RNase R. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CircRNA-detektering med varierande mängd ingångarna RNA. Använda RNA extraheras från MG, occipital Cortex (OC), och överlägsen frontal gyrus (SF), liksom UC RNA, antalet unika circRNAs upptäcks när du använder 1, 2, och 4 μg input RNA, var vars bibliotek konstruerades med TruSeq kit och RNase R pre-behandling, jämfördes. Det normaliserade antalet circRNAs som upptäcktes (Y-axeln) beräknades på samma sätt som i figur 1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: CircRNA-detektion i hjärnan jämfört med andra vävnadstyper. Circrna berikade datauppsättningar med hjälp av RNA som utvinns ur olika hjärnregioner inklusive lillhjärnan (BC), sämre parietallob (IP), mg, oc, och SF, samt fyra andra vävnadstyper inklusive lever (LV), lung (Lu), lymfkörtel (ln), och bukspottkörteln (PA) genererades. CircRNA anrikning utfördes med hjälp av Illumina TruSeq kit med RNase R pre-Treatment och 4 μg totalt ingångarna RNA. Rutdiagram representerar antalet circRNAs som upptäckts av minst tre av de sex verktygen i proverna från varje hjärnregion/vävnadstyp. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Test # | Parameter utvärderad | Provningsförhållanden | Exempel på källa | Ingående belopp/villkor/prov som testats | Totalt antal sekvenserings läsningar |
| 1 | Beredningssats för bibliotek | Illumina TruSeq Stranded total RNA vs. Roche kapa totalt RNA-kit | Uc | TruSeq: 1 μg | 8, 91, 46128 |
| TruSeq: 2 μg | 7, 93, 90202 | ||||
| TruSeq: 4 μg | 6, 66, 12238 | ||||
| TruSeq: 5 μg | 7, 88, 56902 | ||||
| TruSeq: 10 μg | 6, 61, 06874 | ||||
| Kapa: 1 μg | 8, 83, 95496 | ||||
| Kapa: 2 μg | 10, 66, 59272 | ||||
| Kapa: 4 μg | 10, 62, 34954 | ||||
| Kapa: 5 μg | 7, 47, 75914 | ||||
| Kapa: 10 μg | 11, 00, 68504 | ||||
| 2 | Förbehandling | Rase R förbehandlade kontra icke förbehandlade | Mg | Pair1: MG_1 (RNase R +) | 10, 76, 09934 |
| Pair1: MG_5 (RNase R-) | 9, 62, 15516 | ||||
| Pair2: MG_2 (RNase R +) | 9, 68, 40790 | ||||
| Pair2: MG_6 (RNase R-) | 10, 16, 09754 | ||||
| Pair3: MG_3 (RNase R +) | 11, 15, 76344 | ||||
| Pair3: MG_7 (RNase R-) | 11, 13, 14114 | ||||
| 3 | Totalt RNA-ingång | 1 μg jämfört med 2 μg resp. 4 μg | MG, OC, SF, UC | MG: 1 μg | 12, 00, 94758 |
| MG: 2 μg | 11, 64, 75728 | ||||
| MG: 4 μg | 12, 13, 15232 | ||||
| OC: 1 μg | 11, 11, 18120 | ||||
| OC: 2 μg | 11, 53, 25492 | ||||
| OC: 4 μg | 11, 49, 13266 | ||||
| SF: 1 μg | 12, 27, 24142 | ||||
| SF: 2 μg | 9, 39, 33288 | ||||
| SF: 4 μg | 12, 33, 31474 | ||||
| UC: 1 μg | 9, 24, 48120 | ||||
| UC: 2 μg | 12, 58, 15354 | ||||
| UC: 4 μg | 12, 56, 92534 | ||||
| 4 | Vävnadstyper | Hjärnregioner kontra andra vävnadstyper | BC, MG, OC, SF, IP, LU, LV, LN, PA | BC_1 | 10, 72, 08904 |
| BC_2 | 11, 18, 33362 | ||||
| BC_3 | 9, 61, 25856 | ||||
| BC_4 | 9, 62, 77094 | ||||
| IP_1 | 9, 86, 56506 | ||||
| IP_2 | 11, 35, 95746 | ||||
| IP_3 | 12, 87, 81536 | ||||
| IP_4 | 9, 59, 81446 | ||||
| MG_1 | 10, 76, 09934 | ||||
| MG_2 | 9, 68, 40790 | ||||
| MG_3 | 11, 15, 76344 | ||||
| MG_4 | 10, 05, 39028 | ||||
| OC_1 | 8, 85, 47042 | ||||
| OC_2 | 12, 09, 83142 | ||||
| OC_3 | 10, 26, 55452 | ||||
| OC_4 | 10, 84, 49330 | ||||
| SF_1 | 8, 76, 21824 | ||||
| SF_2 | 14, 50, 57894 | ||||
| SF_3 | 11, 01, 52030 | ||||
| SF_4 | 9, 67, 24472 | ||||
| LN_1 | 15, 02, 94816 | ||||
| LN_2 | 8, 33, 30187 | ||||
| LN_3 | 11, 30, 96032 | ||||
| LN_4 | 10, 78, 38278 | ||||
| LU_1 | 16, 05, 27595 | ||||
| LU_2 | 8, 94, 30799 | ||||
| LU_3 | 9, 14, 51858 | ||||
| LV_1 | 9, 72, 18369 | ||||
| LV_2 | 10, 54, 16880 | ||||
| LV_3 | 8, 86, 53148 | ||||
| LV_4 | 8, 61, 02943 | ||||
| LV_5 | 12, 87, 88483 | ||||
| LV_6 | 11, 87, 76622 | ||||
| PA_1 | 8, 79, 20160 | ||||
| PA_2 | 7, 82, 36741 | ||||
| PA_3 | 10, 21, 24209 | ||||
| PA_4 | 11, 53, 22926 |
Tabell 1: Sammanfattning av prov-och Testvillkor. Sammanfattning av alla parametrar och Testvillkor som utvärderas i den här studien, tillsammans med det totala antalet sekvenserings läsningar som genererats för varje prov. UC = universell kontroll, mg = mellersta tidsmässiga gyrus, oc = occipital cortex, BC = cerebellum, IP = sämre parietallob, SF = överlägsen frontal gyrus, Lu = lunga, LV = lever, LN = lymfkörtel, PA = bukspottkörteln, RNase r = ribonukleas r, RNase r + = förbehandlad med RNase r, RNase r-= inte förbehandlade med RNase r.
| Exempel på källa | Ingående belopp/prov som testats | Procent rRNA |
| Uc | TruSeq: 1 μg | 5,53% |
| TruSeq: 2 μg | 4,11% | |
| TruSeq: 4 μg | 4,38% | |
| TruSeq: 5 μg | 3,21% | |
| TruSeq: 10 μg | 3,74% | |
| Kapa: 1 μg | 5,57% | |
| Kapa: 2 μg | 4,56% | |
| Kapa: 4 μg | 9,67% | |
| Kapa: 5 μg | 12,69% | |
| Kapa: 10 μg | 15,59% |
Tabell 2: rRNA procenttal i TruSeq vs. kapa bibliotek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie testades två kommersiellt tillgängliga biblioteks berednings satser, förbehandlings alternativ och indata-RNA-belopp för att optimera ett circRNA anriknings protokoll för byggande av circRNA sekvenserings bibliotek. Baserat på denna studie bedömningar, ett antal viktiga aspekter och kritiska steg för att skapa circRNA sekvensering bibliotek är uppenbara. Vår utvärdering bekräftar nyttan av RNase R pre-behandling, vilket återspeglas av det ökade antalet circRNAs upptäcks. Sammantaget observerades en högre variation av circRNAs vid användning av Illumina TruSeq library kit med RNase R pre-Treatment och 4 μg ingångarna RNA. Dessa resultat överensstämmer med tidigare fynd att RNase R anriknings steget är fördelaktigt för detektion av circRNAs2.
Ytterligare viktiga aspekter av circRNA biblioteks konstruktion inkluderar mängden totalt RNA som är tillgängligt för sekvensering samt vilken typ av vävnad som RNA utvinns ur. Även om en 4 μg tillförsel av totalt RNA befanns ge det högsta antalet upptäckta circRNAs, använder majoriteten av RNAseq studier < = 1 μg totalt RNA så att få högre belopp kan vara utmanande, särskilt för analys av mänskliga prover. Det är fortfarande möjligt att identifiera circRNAs för lägre insatsbelopp, men det är relevant att erkänna att analysiens specificitet kan påverkas. Denna studie belyser ytterligare det högre antalet circrnas som upptäcks i human hjärnan jämfört med andra vävnader, som tidigare rapporterats19,20. Det är därför kritiskt att erkänna circRNAs differential uttryck över olika vävnadstyper. Ytterligare forskning i samband med sjukdomar kommer dessutom att vara viktig för att belysa hur circRNAs kan vara involverat i patogena processer.
Resultatet av de två bedömda RNA Library berednings satserna belyser också att även om olika kommersiellt tillgängliga Kit kan uppvisa betydande likheter, observeras fortfarande skillnader när man analyserar circRNAs. Två viktiga fynd från denna jämförelse inkluderar minskad rRNA-utarmning och ett lägre antal circRNAs som identifierats med ett tillvägagångssätt. Medan en möjlighet är att ett högre överflöd av rRNA i ett prov kan störa skapa sekvens-stånd circRNA bibliotek molekyler, detta konstaterande betonar behovet av att bedöma till synes liknande kit, särskilt när reagenser är patentskyddade.
Även om de uppgifter som presenteras här ger insikter om förekomst och förekomst av circRNAs i olika vävnadstyper, har denna studie några tekniska begränsningar. För det första, medan RNase R behandling minskar populationen av linjära RNAs i ett prov, det är inte väl förstått om detta utarmning steg introducerar några fördomar i circRNA upptäckt och om det kan tömma circRNAs. Tidigare studier har rapporterat att circrnas i vissa fall är känsliga för RNase R2,24,25. För det andra är det oklart om en ökning av den totala RNA-ingången över 4 μg kommer att resultera i en linjär ökning av antalet identifierade circRNAs. Som tidigare nämnts, tillgängliga totala RNA är ofta begränsad i forskningsstudier så lägre ingångsbelopp ansågs här. Observera att circRNAs fortfarande kan upptäckas när man använder lägre ingångar men det är viktigt att erkänna att lägre ingångar är förknippade med detektering av ett lägre antal circRNAs. För det tredje, det optimerade protokollet som presenteras här använder RNAs extraheras från en specifik uppsättning av vävnader. Med tanke på den variabla fördelningen av circRNA-uttryck mellan olika vävnadstyper kan sambandet mellan totala RNA-inmatningsmängder och antalet identifierade circRNAs skilja sig åt mellan vävnader.
Med ökande intresse för att förstå circRNAs biologiska roll utvecklas även nya strategier för att bättre kunna karakterisera och identifiera circRNAs. En ny metod för bioinformatik möjliggör identifiering av circRNAs som kan uttryckas i ringa form genom rekonstruktion av fullängdscircrnas, och möjliggör även kvantifiering av uttryck för specifika circRNA-isoformer26. Den här metoden utnyttjar funktioner som beskrivs som omvänd överlappning (RO) läsningar som kan uppstå på 3 ' eller 5 ' ändarna av circRNA bibliotek molekyler. Utveckling av nya strategier för att identifiera circRNAs, som omfattar både laboratoriemetoder och bioinformatikverktyg, kommer att bidra till fältets förståelse av circRNAs funktion och påverkan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för banner Sun Health Research Institute hjärna och Body donation program (BBDP) i Sun City, Arizona för tillhandahållande av mänskliga hjärnvävnader. BBDP har fått stöd av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke (U24 NS072026 nationella hjärn-och vävnads resurser för Parkinsons sjukdom och relaterade sjukdomar), National Institute on aging (P30AG19610 Arizona Alzheimers sjukdom Core Center), Arizona Department of Health Services (kontrakt 211002, Arizona Alzheimer ' s Research Center), Arizona biomedicinska forsknings kommissionen (kontrakt 4001, 0011, 05-901 och 1001 till Arizona Parkinson ' s disease Consortium) och Michael J. Fox Foundation för Parkinsons forskning27. Denna studie stöddes också av DHS och delstaten Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). Vi tackar också Andrea Schmitt (banner Research) och Cynthia lechuga (TGen) för administrativt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al.
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al.
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
