Summary
Cirkulære RNAs (circRNAs) er ikke-kodning RNAs, der kan have roller i transkriptional regulering og medierende interaktioner mellem proteiner. Efter vurdering af forskellige parametre for opførelse af circRNA sekvensering biblioteker, en protokol blev udarbejdet ved hjælp af strandede samlede RNA bibliotek forberedelse med RNase R præ-behandling og præsenteres her.
Abstract
Cirkulære RNAs (circRNAs) er en klasse af ikke-kodning RNAs involveret i funktioner, herunder mikro-RNA (miRNA) regulering, mægling af protein-protein interaktioner, og regulering af forældrenes gen transkriptionen. I klassisk næste generation af RNA-sekvensering (RNA-SEQ), er circRNAs typisk overset som et resultat af poly-A udvælgelse under opførelsen af mRNA biblioteker, eller findes på meget lav overflod, og er derfor vanskeligt at isolere og opdage. Her blev en circRNA Library Construction Protocol optimeret ved at sammenligne Biblioteks forberedelses kits, forbehandlings muligheder og forskellige samlede RNA-input beløb. To kommercielt tilgængelige hele transcriptome Library Preparation kits, med og uden RNase R forbehandling, og ved hjælp af variable mængder af samlede RNA-input (1 til 4 μg), blev testet. Endelig, flere vævstyper; herunder lever, lunge, lymfeknude, og bugspytkirtel; samt flere hjerneområder; herunder cerebellum, ringere parietal lap, Middle Temporal gyrus, occipital cortex, og overlegne frontal gyrus; blev sammenlignet med at evaluere circRNA overflod på tværs af vævstyper. Analyse af de genererede RNA-SEQ-data ved hjælp af seks forskellige circRNA-detektionsværktøjer (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC og CIRCexplorer) afslørede, at et strandede total RNA-Biblioteks forberedelses kit med RNase R-forbehandling og 4 μg RNA-input er den optimale metode til identifikation af det højeste relative antal circRNAs. I overensstemmelse med tidligere fund blev den højeste berigelse af circRNAs observeret i hjernevæv sammenlignet med andre vævstyper.
Introduction
Cirkulære RNAs (circrnas) er endogene, ikke-kodning RNAs, der har fået opmærksomhed i betragtning af deres omsiggribende udtryk i eukaryote transkriptomet1,2,3. De er dannet, når exons back-Splice til hinanden og dermed oprindeligt blev anset for at være splejsning artefakter4,5. Men, nylige undersøgelser har vist, at circrnas udviser celletype, væv, og udviklingsmæssige fase specifikke udtryk3,6 og er evolutionært bevaret2,3. Desuden er de involveret i mægling af protein-protein interaktioner7, mikro-RNA (Mirna) bindende3,8,9,10, og regulering af forældrenes gen transkriptionen11.
I klassisk RNA-sekvensering (RNA-SEQ), kan circRNAs være helt tabt under biblioteks konstruktionen som et resultat af poly-et valg for mRNAs eller kan være vanskeligt at isolere i betragtning af deres lave overflod. Men, nylige circrna karakterisering undersøgelser har indarbejdet en præ-behandling trin ved hjælp af RNase Rasmussen for at berige for circrnas2,12,13. RNase Rasmussen er en exoribonuclease, der fordøjer lineære RNAs, efterlader cirkulære RNA strukturer. CircRNA-berigelses protokoller blev optimeret ved at generere og sammenligne data fra to kommercielt tilgængelige hele transkriptome Library byggesæt, med og uden et RNase R forbehandlings trin, og ved hjælp af varierende mængder af samlet RNA-input (1 til 4 μg). Den optimerede protokol blev derefter brugt til at evaluere den overflod af circRNAs på tværs af fem forskellige hjerneområder (cerebellum [BC], ringere parietal lap [IP], Middle Temporal gyrus [MG], occipital cortex [OC] og overlegne frontal gyrus [SF]) og fire andre vævstyper (leveren [LV], lunge [LU], lymfeknude [LN] og bugspytkirtel [PA]). RNA-SEQ-bibliotekerne blev parret sekvenserede, og data blev analyseret ved hjælp af seks forskellige circRNA-forudsigelses algoritmer: find_circ3, Ciri14, mapsplice15, Knife16, DCC17og circexplorer18. Baseret på vores analyse, det højeste antal af unikke circRNAs blev detekteret, når du bruger en strandede samlede RNA bibliotek forberedelse kit med RNase R forbehandling og 4 μg samlede input RNA. Den optimerede protokol er beskrevet her. Som tidligere rapporteret19,20, den højeste berigelse af circrnas blev observeret i hjernen sammenlignet med andre vævstyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskning er blevet udført i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskers velfærd. Hjernevæv blev opnået fra banneret Sun Health Research Institute Brain og Body donation program i Sun City, AZ. Operationerne i hjernen og organ donation program er godkendt af den vestlige institutionelle Review Board (WIRB Protocol #20120821). Alle eller deres juridiske repræsentanter underskrev det informerede samtykke. Kommercielle (ikke-hjerne) bioprøver blev købt hos Proteogenex.
1. behandling med RNase R
Bemærk: I de følgende trin justeres reaktions volumenet til et samlet volumen på 50 μL. Dette er den mindste prøvevolumen, der skal bruges i RNA Cleanup & koncentrator Kit (Se tabel over materialer). Derudover er den optimerede protokol, der er beskrevet her, for et input beløb på 4 μg total RNA. En længere inkubationstid for behandling med RNase R anbefales for et input beløb > 4 μg.
- Det totale RNA fortyndes til 4 μg i 39 μL RNase frit vand i et mikrocentrifuge glas og blandes godt ved pipettering.
- I et separat rør fortyndes RNase R til en arbejds koncentration på 2 U/μL med 1x RNase R reaktions buffer. Gør kun nok til umiddelbar brug.
- Der afpipetteres 39 μL total RNA og 5 μL 10x RNase R reaktions buffer i et 1,5 mL reaktions slange og blandes godt ved pipettering (50 μL vil være den totale reaktions volumen). Tilsæt derefter 6 μL RNase R (2 e/μL).
- Juster pipetten til den fulde reaktions volumen (50 μL), og bland godt ved pipettering op og ned 10 gange.
- Placer røret i et 37 °C vandbad i 10 min. Sørg for, at den fulde reaktions volumen er nedsænket i vandbad.
- Anbring røret på is, og Fortsæt straks med RNA-oprydning & koncentration (afsnit 2).
2. rensning af RNA ved hjælp af et RNA-oprydnings-og Koncentratorsæt
Bemærk: Ved anvendelse af høj kvalitet RNA (RIN > DV200 > 80%), kan RNase R behandling resultere i tab af ca 60% af RNA. Ved hjælp af en indgang på 4 μg skønnes det, at 2 – 2,5 μg behandlet RNA er tilbage efter afsnit 1.
- Før du starter, skal du tilberede RNA-Vaskebufferen ved at tilsætte 48 mL 100% ethanol til buffer koncentratet og blande godt ved pipettering. Placer oprensnings kolonnerne i opsamlings rørene (Se tabel over materialer),og Placer dem i et rørstativ.
Bemærk: Brug følgende Centrifugerings indstillinger til alle følgende trin: 10000 – 16000 x g. Hvis der allerede er udført DNase I-behandling, skal du springe DNase I-behandling over på dette stadie. - Tilsæt 2 bind af RNA-bindings buffer til den RNase R-behandlede prøve, og bland godt ved pipettering (total volumen: 150 μL).
- Tilsæt 1 volumen 100% ethanol til RNA-bindings bufferen og den behandlede prøveblanding med RNase R, og bland godt ved pipettering (total volumen: 300 μL).
- Overfør hele lydstyrken til kolonnen, og centrifuger kolonnen i 30 s. kassér strømmen igennem.
- Tilsæt 400 μL RNA-prep-buffer direkte til kolonnen, centrifuge kolonnen i 30 s, og kassér strømmen igennem.
- Tilsæt 700 μL RNA-vaske buffer direkte til kolonnen, centrifuger kolonnen i 30 s, og kassér strømmen.
- Tilsæt 400 μL RNA-vaske buffer direkte til søjlen, centrifuger kolonnen i 2 minutter, og Overfør kolonnen til et frisk RNase-frit 1,5 mL rør.
- Tilsæt 11 μL RNase frit vand direkte til søjlen ved at holde pipettespidsen lige over kolonnefilteret og sikre, at vandet kun lander på kolonnefilteret.
- Søjlen inkubates i 1 min ved stuetemperatur og centrifugeres i 1 min.
- Før du kassere kolonnen, check for flow gennem i RNase-fri tube. Hvis eluering lykkedes, skal du opbevare prøven ved-80 °C eller straks fortsætte med Biblioteks klargøring. Den endelige totale elueringsvolumen på ca. 10 μL anvendes til Biblioteks byggeri.
Bemærk: Stoppunkt: efterlade RNA ved-80 °C i op til 7 dage, før du fortsætter med Biblioteks forberedelse.
3. circRNA bibliotek prep
Bemærk: Se tabel over materialer til kit, som indeholder de fleste reagenser, der anvendes i dette afsnit.
- rRNA-nedbrydning og fragmentering
- Overfør 10 μL renset RNA fra trin 2,10 til en ren brønd i en ny 96-brønd 0,3 mL PCR-plade. Til brønden tilsættes 5 μL rRNA-bindings buffer efterfulgt af 5 μL rRNA-fjernelses blanding. Pipetten forsigtigt op og ned 10 gange for at blande.
- Forseglings pladen og Inkuber i 5 min ved 68 °C på en forprogrammeret, forvarmet termo cycler blok. Efter afslutning af 5 min inkubation, Placer pladen på bænken og Inkuber ved stuetemperatur i 1 min.
- Fjern forseglingen fra pladen. Tilsæt 35 μl vortexes stuetemperatur rRNA fjernelse perler at prøve. Juster pipetten til 45 μL og pipette op og ned 10 – 20x for at blande grundigt. Inkuber pladen i 1 min. ved stuetemperatur.
- Overføre pladen til en magnetisk stander og inkubere på stativet i 1 min eller indtil opløsningen ryddes. Overfør alle supernatanten (~ 45 μL) til ny brønd på samme plade eller ny plade (afhængigt af hvor mange prøver du arbejder med).
- Vortex RNA oprydning perler (Se tabel over materialer) indtil godt dispergeret, og tilsæt 99 μl perler til hver prøve. Pipette op og ned 10x for at blande. Pladen inkubates ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Pladen overføres til den magnetiske stander og Inkuber yderligere 5 min. eller indtil opløsningen ryddes. Fjern og Kassér alle supernatanten fra brønden.
- Med pladen stadig på den magnetiske stativ tilsættes 200 μL frisklavet 80% EtOH til brønden uden at forstyrre perlerne. Inkuber i 30 s, Fjern og kassér ethanol. Gentag for i alt 2 skyller.
- Tilsæt 11 μL Elueringsbuffer til hver brønd, og pipér op og ned 10 gange for at blande. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min., og overfør derefter til den magnetiske stander, indtil opløsningen ryddes (1-5 min.).
- Overfør 8,5 μL af supernatanten fra brønden til en ny brønd på samme plade eller til en ny plade. Tilsæt 8,5 μL af Elutten, primer, fragment High mix til hver brønd indeholdende prøve. Pipetten op og ned 10 gange for at blande grundigt.
- Forseglings pladen og Inkuber i 8 min ved 94 °C på en forprogrammeret, forvarmet termo cycler blok. Fjern fra termocycleren, når den når 4 °C, og centrifugeres kortvarigt.
Bemærk: Fortsæt straks til den syntetisere første streng cDNA-protokol.
- Syntetisere cDNA
- For hver prøve, der tilberedes, blandes 9 μL første streng syntese blanding med 1 μL revers transkriptase (Se tabel over materialer). Tilsæt 8 μL af blandingen til prøven. Pipetten op og ned 6 gange for at blande.
- Forseglings pladen og Inkuber på en forprogrammeret, forvarmet termo cycler blok ved hjælp af følgende parametre: 25 °C i 10 min, 42 °C i 15 min, 70 °C i 15 min, 4 °C hold. Fortsæt straks til anden streng syntese.
- Tilsæt 5 μL resuspension buffer til hver prøve efterfulgt af 20 μL anden streng mærkning Master mix. Afpipettere hele lydstyrken op og ned 6 gange.
- Forsegl pladen og Inkuber på en forprogrammeret, forvarmet termo cycler blok, der er indstillet til 16 °C i 1 time. Efter inkubation fjernes pladen fra termocycleren, og den skal være i ligevægt til stuetemperatur.
- Vortex PCR rensning perler (Se tabel over materialer) og tilsæt 90 μl perler til hver brønd af prøven. Pipetten op og ned 10 gange for at blande grundigt. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Perlen/prøveblandingen overføres til den magnetiske stander og Inkuber i 5 min. eller indtil væsken ryddes. Fjern og kassér supernatanten.
- Tilsæt 200 μL 80% EtOH til hver prøve. Incubate prøver på den magnetiske stander ved stuetemperatur i 30 s. kassér supernatanten. Gentag 1x.
- Lad perler tørre ved stuetemperatur i 6 min, og fjern derefter fra magnetisk stativ.
- Resuspendér perler i 19,5 μL resuspension buffer. Pipetten op og ned 10 gange for at blande grundigt. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min, derefter overføres til den magnetiske stativ og inkubere i yderligere 1 min eller indtil væsken rydder.
- Overfør 17,5 μL supernatanten til ny brønd/ny plade.
Bemærk: Hvis der ikke indledes med det samme, kan prøverne opbevares ved-20 °C i op til 7 dage.
- For hver prøve, der tilberedes, blandes 9 μL første streng syntese blanding med 1 μL revers transkriptase (Se tabel over materialer). Tilsæt 8 μL af blandingen til prøven. Pipetten op og ned 6 gange for at blande.
- Forberedelse af bibliotek
- Tilsæt 12,5 μL A-detail mix til hver brønd, der indeholder supernatant. Afpipettere hele lydstyrken op og ned 10 gange for at blande.
- Reaktionen skal inkubere på en forprogrammeret, forvarmet termo cycler blok indstillet til 37 °C ved hjælp af følgende parametre: 37 °C i 30 min, 70 °C i 5 min, 4 °C hold. Når prøverne når 4 °C, fortsættes straks med adapter ligation.
- Til hver prøve tilsættes 2,5 μL resuspension buffer, 2,5 μL af en unik RNA-adapter og 2,5 μL Ligationmix. Pipette op og ned 10x for at blande.
- Der inkubates prøver på en forprogrammeret, forvarmet termo cycler blok ved 30 °C i 10 min.
- Tilsæt 5 μL stop Ligations buffer til hver prøve, og pipette op og ned for at blande.
- Tilsæt 42 μL blandede PCR rensning perler til hver prøve og bland grundigt. Følg trin 3.2.6 til og med 3.2.10, men Skift ophængs volumen til 52 μL og endelig elueringsvolumen til 50 μL.
- Gentag PCR-rensnings perle-protokollen igen med 50 μL eluering fra trin 3.3.6, men Skift ophængs volumen til 22 μL og endelig elueringsvolumen til 20 μL.
Bemærk: Hvis der ikke indledes med det samme, kan prøverne opbevares ved-20 °C i op til 7 dage. - Tilsæt 5 μL PCR primer cocktail og 25 μL PCR Master Mix til hver prøve. Bland ved pipettering op og ned 10 gange. Reaktionen på en forprogrammeret, forvarmet termo cycler blok inkubates ved hjælp af følgende parametre: 98 °C i 30 s; derefter 8 cyklusser af 98 °C for 10 s, 60 °C for 30 s, og 72 °C for 30 s; derefter 72 °C i 5 min, derefter 4 °C hold.
Bemærk: Optimering af det samlede antal PCR-cyklusser kan være nødvendig for at generere tilstrækkelige mængder bibliotek til sekvensering. - Følg protokollen for PCR Bead oprensning (trin 3.2.4 til 3.2.9), bortset fra Tilsæt 50 μL velblandede PCR oprensnings perler og Skift ophængs volumen til 32,5 μL med en endelig elueringsvolumen på 30 μL.
Bemærk: Prøverne opbevares ved-20 °C.
- Kvantificering og kvalitetskontrol ved hjælp af en nukleinsyre analysator
- Lad båndene og reagenserne ækvibrere ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Bland 2 μL bibliotek med 2 μL HS D1000 buffer, og Tilføj til en kompatibel brønd plade.
- Forsegl tæt med kompatibel folie forsegling, og vortex i 1 min ved 2.000 rpm.
- Spin ned og belastning plade på analysator efter software prompter.
Bemærk: Biblioteker skal være ca. 260 BP i størrelse.
4. workflow for data analyse
- Sekvens RNA-SEQ biblioteker (Se tabel over materialer) til at generere 82 BP parret-end læser. Konverter RAW-sekvensering af data i form af basecall-filer (. BCL) til FASTQs ved hjælp af værktøjet bcl2fastq (v 0.2.19).
- Detektér circRNAs.
Bemærk: Baseret på tidligere rapporterede beviser for, at en ensemble circrna Detection tilgang klarer sig bedre i forhold til at bruge et enkelt detekterings værktøj21,22, foreslår vi at bruge flere værktøjer til circrna detektion. Her blev circRNAs identificeret ved hjælp af seks eksisterende circRNA forudsigelses algoritmer: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE og DCC, der anvender de anbefalede parameterindstillinger for hver algoritme.- Download og installer hver circRNA Detection algoritme på en Linux højtydende computing klynge ved hjælp af instruktionerne fra udviklerne.
- Juster RNA-SEQ FASTQs i forhold til reference genomet (GRCh37) ved hjælp af den anbefalede aligner for hvert værktøj.
- Efter justering, eksekvere circRNA Detection algoritmer ved at anvende deres respektive anbefalede parameterindstillinger.
- Hvert værktøj vil output en multi-kolonne resultatfil med listen over detekterede circRNAs, udtrække circRNA koordinaterne og antallet af understøttende læser fra dette for at kvantificere antallet af ansøgere, der påvises i hver prøve/test betingelse.
- Konverter circRNA koordinater output ved CIRI, Mapsplice, og DCC til 0-baserede koordinater for at være i overensstemmelse med de tre andre algoritmer.
- Vælg circRNAs med to eller flere understøttende læsninger eller downstream-analyser og sammenligninger. Tabel 1 opsummerer alle de parametre, der er evalueret i vores undersøgelse, sammen med det samlede antal sekvens læsninger, der genereres for hver prøve.
- For hver prøve/test betingelse skal du tælle antallet af fundne circRNAs normaliseret til det antal kortlagte læsninger, der genereres for det pågældende bibliotek, pr. million. Sammenfat resultaterne på tværs af de forskellige værktøjer/prøver i rubrik parceller, som beskrevet i de repræsentative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data genereret ved hjælp af en kommercielt tilgængelig Universal Control RNA (UC) og ved hjælp af to bibliotek forberedelse kits, som begge omfatter en Ribo-udtynding trin i deres protokoller, blev først vurderet. Ved hjælp af en analytisk arbejdsproces (workflow for data analyse, afsnit 4) blev der samlet set fundet et højere antal circRNAs i data sætternes TruSeq-datasæt sammenlignet med kapa-dem (figur 1). Selv om ribosomale RNA (rRNA)-procenterne var under 5% i datasæt fra begge kits til lavere input mængder (1,2 ug), havde kapa-datasæt et højere rRNA-indhold til 4, 5 og 10 ug-indgange (tabel 2). Derfor, baseret på antallet af detekterede circRNAs og rRNA nedbrydelse effektivitet, yderligere eksperimenter blev udført ved hjælp af TruSeq kit.
Dernæst blev betydningen af RNase R forbehandling afprøvet ved at sammenligne data genereret fra RNase R præ-behandlede og ikke-præ-behandlede biblioteker. Til dette formål blev total RNA ekstraheret fra MG af raske ældre individer, og sekvensering af data genereret fra biblioteker med (N = 3) og uden (N = 3) forbehandling med RNase R23 blev sammenlignet. Et højere antal circRNAs blev konsekvent identificeret i de præ-behandlede biblioteker sammenlignet med de ikke-præ-behandlede dem (figur 2). Dette forventes, da forbehandling fjerner lineære RNAs, hvilket berigende for circRNA arter.
For det tredje, mængden af input RNA, der ville være optimal til påvisning af en højere mangfoldighed af circRNAs blev testet. Biblioteker blev forberedt ved hjælp af 1, 2, og 4 μg af samlede input RNA, som blev udvundet fra MG, OC, og SF hjernen regioner, og samt UC RNA. Sammenligning af den overflod af circRNAs detekteret fra hvert bibliotek, den højeste mangfoldighed af circRNA arter blev observeret, når du bruger 4 μg input RNA sammenlignet med 2 og 1 μg (figur 3), som afspejlet i antallet af unikke circRNAs identificeret. En advarsel er, at selv om forskellige inkubationstider under RNase R-behandling ikke blev afprøvet, blev der observeret en tendens, hvor et stigende antal circRNAs blev detekteret på tværs af totale RNA-indgange på 1 til 4 μg ved kontrol af alle andre parametre.
Denne optimerede protokol blev derefter anvendt på tværs af flere vævstyper for at sammenligne circRNA-mængder. Fem hjerneregioner, herunder BC, MG, OC, IP, og SF, fra fire raske ældre individer, blev testet sammen med fire andre vævstyper, herunder LV, LU, LN og PA, fra seks raske donorer. Samlet set blev der observeret en højere overflod af circrnas i hjernen sammenlignet med andre vævstyper (figur 4), som tidligere er indberettet19,20.
Figur 1: CircRNA detektion ved hjælp af TruSeq vs. kapa total RNA kits. Sekvensering af data blev genereret for UC RNA ved hjælp af to separate samlede RNA-Biblioteks forberedelses kits, hver med 1, 2, 4, 5 og 10 μg input-RNA og ribonuklease r (RNase r) forbehandling. Antallet af circRNAs detekteret af værktøjerne i hver prøve blev normaliseret til antallet af kortlagte læsninger, per million (Y-aksen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: CircRNA detektion med og uden RNase R forbehandling. Sequencing data genereret ved hjælp af TruSeq kit blev anvendt til at sammenligne virkningen af RNase R forbehandling. RNA blev udvundet fra den midterste temporale gyrus (MG) af raske ældre kontroller til denne analyse. Det normaliserede antal circRNAs, der blev registreret (Y-aksen), blev beregnet på samme måde som figur 1. RNase R + = forbehandlet med RNase r, RNase R-= ikke forbehandlet med RNase R. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: CircRNA detektion ved hjælp af varierende mængde input-RNA. Ved hjælp af RNA ekstraheret fra MG, occipital cortex (OC), og overlegne frontal gyrus (SF), samt UC RNA, antallet af unikke circRNAs detekteret ved brug af 1, 2, og 4 μg input RNA, hver hvis bibliotek blev konstrueret ved hjælp af TruSeq kit og RNase R præ-behandling, blev sammenlignet. Det normaliserede antal circRNAs, der blev registreret (Y-aksen), blev beregnet på samme måde som figur 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: CircRNA detektion i hjernen vs andre vævstyper. CircRNA beriget datasæt ved hjælp af RNA udvundet fra forskellige hjerneområder, herunder cerebellum (BC), ringere parietal lobe (IP), MG, OC, og SF, samt fire andre vævstyper, herunder leveren (LV), lunge (LU), lymfeknude (LN), og bugspytkirtlen (PA) blev genereret. CircRNA-berigelse blev udført ved hjælp af Illumina-TruSeq-sættet med RNase R-forbehandling og 4 μg total inputrna. Box plots repræsenterer antallet af circRNAs detekteret af mindst tre af de seks værktøjer på tværs af prøverne fra hver hjerneregion/vævstype. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Test # | Parameter evalueret | Prøvningsbetingelser | Eksempelkilde | Input beløb/betingelser/prøver testet | Samlet antal sekvensering af læsninger |
| 1 | Bibliotek forberedelse kit | Illumina TruSeq strandede total RNA vs. Roche kapa total RNA kits | Uc | TruSeq: 1 μg | 8, 91, 46128 |
| TruSeq: 2 μg | 7, 93, 90202 | ||||
| TruSeq: 4 μg | 6, 66, 12238 | ||||
| TruSeq: 5 μg | 7, 88, 56902 | ||||
| TruSeq: 10 μg | 6, 61, 06874 | ||||
| Kapa: 1 μg | 8, 83, 95496 | ||||
| Kapa: 2 μg | 10, 66, 59272 | ||||
| Kapa: 4 μg | 10, 62, 34954 | ||||
| Kapa: 5 μg | 7, 47, 75914 | ||||
| Kapa: 10 μg | 11, 00, 68504 | ||||
| 2 | Forbehandling | RNase R forbehandlet vs. ikke forbehandlet | Mg | Pair1: MG_1 (RNase R +) | 10, 76, 09934 |
| Pair1: MG_5 (RNase R-) | 9, 62, 15516 | ||||
| Pair2: MG_2 (RNase R +) | 9, 68, 40790 | ||||
| Pair2: MG_6 (RNase R-) | 10, 16, 09754 | ||||
| Pair3: MG_3 (RNase R +) | 11, 15, 76344 | ||||
| Pair3: MG_7 (RNase R-) | 11, 13, 14114 | ||||
| 3 | Samlet RNA-indgang | 1 μg vs. 2 μg vs. 4 μg | MG, OC, SF, UC | MG: 1 μg | 12, 00, 94758 |
| MG: 2 μg | 11, 64, 75728 | ||||
| MG: 4 μg | 12, 13, 15232 | ||||
| OC: 1 μg | 11, 11, 18120 | ||||
| OC: 2 μg | 11, 53, 25492 | ||||
| OC: 4 μg | 11, 49, 13266 | ||||
| SF: 1 μg | 12, 27, 24142 | ||||
| SF: 2 μg | 9, 39, 33288 | ||||
| SF: 4 μg | 12, 33, 31474 | ||||
| UC: 1 μg | 9, 24, 48120 | ||||
| UC: 2 μg | 12, 58, 15354 | ||||
| UC: 4 μg | 12, 56, 92534 | ||||
| 4 | Vævstyper | Hjerneregioner vs. andre vævstyper | BC, MG, OC, SF, IP, LU, LV, LN, PA | BC_1 | 10, 72, 08904 |
| BC_2 | 11, 18, 33362 | ||||
| BC_3 | 9, 61, 25856 | ||||
| BC_4 | 9, 62, 77094 | ||||
| IP_1 | 9, 86, 56506 | ||||
| IP_2 | 11, 35, 95746 | ||||
| IP_3 | 12, 87, 81536 | ||||
| IP_4 | 9, 59, 81446 | ||||
| MG_1 | 10, 76, 09934 | ||||
| MG_2 | 9, 68, 40790 | ||||
| MG_3 | 11, 15, 76344 | ||||
| MG_4 | 10, 05, 39028 | ||||
| OC_1 | 8, 85, 47042 | ||||
| OC_2 | 12, 09, 83142 | ||||
| OC_3 | 10, 26, 55452 | ||||
| OC_4 | 10, 84, 49330 | ||||
| SF_1 | 8, 76, 21824 | ||||
| SF_2 | 14, 50, 57894 | ||||
| SF_3 | 11, 01, 52030 | ||||
| SF_4 | 9, 67, 24472 | ||||
| LN_1 | 15, 02, 94816 | ||||
| LN_2 | 8, 33, 30187 | ||||
| LN_3 | 11, 30, 96032 | ||||
| LN_4 | 10, 78, 38278 | ||||
| LU_1 | 16, 05, 27595 | ||||
| LU_2 | 8, 94, 30799 | ||||
| LU_3 | 9, 14, 51858 | ||||
| LV_1 | 9, 72, 18369 | ||||
| LV_2 | 10, 54, 16880 | ||||
| LV_3 | 8, 86, 53148 | ||||
| LV_4 | 8, 61, 02943 | ||||
| LV_5 | 12, 87, 88483 | ||||
| LV_6 | 11, 87, 76622 | ||||
| PA_1 | 8, 79, 20160 | ||||
| PA_2 | 7, 82, 36741 | ||||
| PA_3 | 10, 21, 24209 | ||||
| PA_4 | 11, 53, 22926 |
Tabel 1: Resumé af prøve-og prøvningsbetingelser. Resumé af alle parametre og Testbetingelser evalueret i denne undersøgelse, sammen med det samlede antal sekvensering læsninger genereret for hver prøve. UC = Universal kontrol, mg = mellemtemporale gyrus, OC = occipital cortex, BC = cerebellum, IP = ringere parietal lap, SF = overlegne frontal gyrus, Lu = lunge, LV = lever, LN = lymfeknude, PA = bugspytkirtel, RNase Rasmussen = ribonuklease Rasmussen, RNase r + = præ-behandlet med RNase Rasmussen, RNase r-= ikke præ-behandlet med RNase Rasmussen.
| Eksempelkilde | Input beløb/testede prøver | Procent rRNA |
| Uc | TruSeq: 1 μg | 5,53% |
| TruSeq: 2 μg | 4,11% | |
| TruSeq: 4 μg | 4,38% | |
| TruSeq: 5 μg | 3,21% | |
| TruSeq: 10 μg | 3,74% | |
| Kapa: 1 μg | 5,57% | |
| Kapa: 2 μg | 4,56% | |
| Kapa: 4 μg | 9,67% | |
| Kapa: 5 μg | 12,69% | |
| Kapa: 10 μg | 15,59% |
Tabel 2: rRNA-procenter i biblioteker i TruSeq vs. kapa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse blev to kommercielt tilgængelige Biblioteks forberedelses kits, præ-behandlingsmuligheder og input-RNA-beløb testet for at optimere en circRNA-berigelses protokol til opførelse af circRNA sekvensering biblioteker. På baggrund af undersøgelsens vurderinger er en række vigtige aspekter og kritiske trin i skabelsen af circRNA-sekvensering af biblioteker tydeligt. Vores evaluering bekræfter nytten af RNase R forbehandling, som afspejlet i det øgede antal circRNAs detekteret. Samlet set blev der observeret en større variation af circRNAs ved brug af Illumina TruSeq Library kit med RNase R forbehandling og 4 μg inputrna. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere fund, at RNase R berigelses trinnet er gavnlig for påvisning af circRNAs2.
Yderligere nøgleaspekter af circRNA Library konstruktion omfatter mængden af total RNA, der er tilgængelig for sekvensering samt typen af væv, at RNA ekstraheret fra. Selvom en 4 μg indgang af total RNA blev fundet for at give det højeste antal detekterede circRNAs, udnytter størstedelen af RNAseq-studierne < = 1 μg total RNA, således at opnåelse af højere mængder kan være udfordrende, især til analyse af humane prøver. Identifikation af circRNAs er fortsat mulig for lavere input beløb, men det er relevant at erkende, at specificiteten af analysen kan blive påvirket. Denne undersøgelse fremhæver yderligere det højere antal circrnas, der påvises i menneskets hjerne sammenlignet med andre væv, som tidligere rapporteret19,20. Det er derfor afgørende at anerkende differentialekspression af circRNAs på tværs af forskellige vævstyper. Endvidere vil yderligere forskning i sygdoms sammenhæng være vigtig for at kaste lys over, hvordan circRNAs kan være involveret i sygdomsfremkaldende processer.
Ydeevnen af de to vurderede RNA bibliotek forberedelse kits også fremhæver, at selv om forskellige kommercielt tilgængelige kits kan påvise betydelige ligheder, forskelle er stadig observeret, når du analyserer circRNAs. To vigtige resultater af denne sammenligning omfatter nedsat rRNA-nedbrydning og et lavere antal circRNAs identificeret ved hjælp af en metode. Mens en mulighed er, at en højere overflod af rRNA i en prøve kan forstyrre skabe sekvens-able circRNA bibliotek molekyler, dette fund understreger behovet for at vurdere tilsyneladende lignende kits, især når reagenser er proprietære.
Selv om de data, der præsenteres her giver indsigt i eksistensen og overflod af circRNAs i forskellige vævstyper, denne undersøgelse har et par tekniske begrænsninger. For det første, mens RNase R behandling reducerer populationen af lineære RNAs i en prøve, det er ikke godt forstået, hvis dette udtynding trin introducerer nogen bias i circRNA detektion og om det kan nedbryder circRNAs. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at i nogle tilfælde, circrnas er følsomme over for RNase R2,24,25. For det andet er det uklart, om en forøgelse af det samlede RNA-input over 4 μg vil resultere i en lineær stigning i antallet af identificerede circRNAs. Som tidligere nævnt er tilgængelig total RNA ofte begrænset i forskningsundersøgelser, så lavere input beløb blev overvejet her. Bemærk, at circRNAs stadig kan detekteres ved brug af lavere indgange, men det er vigtigt at erkende, at lavere indgange er forbundet med påvisning af et lavere antal circRNAs. For det tredje, den optimerede protokol præsenteret her udnytter RNAs udvundet fra et bestemt sæt af væv. I betragtning af den variable fordeling af circRNA-ekspression på tværs af forskellige vævstyper kan tilknytningen mellem totale RNA-input beløb og antallet af identificerede circRNAs variere på tværs af væv.
Med stigende interesser i forståelsen af den biologiske rolle circRNAs, nye strategier er også ved at blive udviklet til bedre at kunne karakterisering og identifikation af circRNAs. En ny Bioinformatik tilgang muliggør identifikation af circRNAs, der kan være svagt udtrykt gennem rekonstruktion af fuld-længde circRNAs, og også muliggør kvantificering af ekspression af specifikke circRNA isoformer26. Denne fremgangsmåde udnytter de funktioner, der beskrives som omvendte overlap (RO)-læsninger, som kan forekomme på de 3 ' eller 5 ' ender af circRNA Library-molekyler. Udvikling af nye strategier til identificering af circRNAs, som omfatter både laboratoriemetoder og bioinformatik værktøjer, vil bidrage til feltets forståelse af circRNAs ' funktion og virkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for banneret Sun Health Research Institute Brain og Body donation program (BBDP) af Sun City, Arizona for levering af menneskelige hjernevæv. BBDP er blevet støttet af det nationale Institut for neurologiske lidelser og slagtilfælde (U24 NS072026 national hjerne-og vævs ressource for Parkinsons sygdom og beslægtede lidelser), National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimers sygdom Core Center), Arizona Department of Health Services (kontrakt 211002, Arizona Alzheimers Research Center), Arizona biomedicinsk forskning provision (kontrakter 4001, 0011, 05-901 og 1001 til Arizona Parkinsons sygdom konsortium) og Michael Jørgensen. Fox Foundation for Parkinsons forskning27. Denne undersøgelse blev også støttet af DHS og staten Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). Vi takker også Andrea Schmitt (banner Research) og Cynthia Lechuga (TGen) for administrativ støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al.
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al.
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
