Summary
Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), transkripsiyonel düzenlemede ve proteinler arasındaki iletişimlerde rol alabilecek kodlamayan RNA'lardır. CircRNA sıralama kütüphanelerinin inşası için farklı parametrelerin değerlendirilmesinin ardından, RNase R ön arıtma ile mahsur kalan toplam RNA kitaplığı hazırlığı kullanılarak bir protokol derlenmiş ve burada sunulmuştur.
Abstract
Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), mikro-RNA (miRNA) düzenlemesi, protein-protein etkileşimlerinin arabuluculuğu ve ebeveyn gen transkripsiyonunun düzenlenmesi gibi işlevlerde yer alan kodlamayan RNA'lar sınıfıdır. Klasik yeni nesil RNA sıralamasında (RNA-seq), circRNA'lar genellikle mRNA kitaplıklarının inşası sırasında poli-A seçiminin bir sonucu olarak gözden kaçırılır veya çok düşük bollukta bulunur ve bu nedenle izole etmek ve tespit etmek zordur. Burada, bir circRNA kütüphane inşaat protokolü kütüphane hazırlama kitleri, ön işlem seçenekleri ve çeşitli toplam RNA giriş miktarları karşılaştırılarak optimize edildi. RNase R ön işlem li ve olmayan ve değişken miktarda toplam RNA girişi (1 ila 4 g) kullanılarak, ticari olarak kullanılabilen iki tam transkripsiyon kitaplığı hazırlama kitleri test edildi. Son olarak, birden fazla doku tipleri; karaciğer, akciğer, lenf düğümü ve pankreas dahil; yanı sıra birden fazla beyin bölgeleri; beyincik dahil, inferior parietal lob, orta temporal girus, oksipital korteks, ve üstün frontal girus; doku tipleri arasında circRNA bolluğunu değerlendirmek için karşılaştırıldı. Altı farklı circRNA algılama aracı (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC ve CIRCexplorer) kullanılarak oluşturulan RNA-seq verilerinin analizi, RNase R ön işlem ve 4 μg RNA girişi ile mahsur toplam RNA kitaplık hazırlama kitinin en uygun olduğunu ortaya koymuştur. circRNA'ların en yüksek göreli sayısını belirleme yöntemi. Önceki bulgularla tutarlı olarak, beyin dokularında diğer doku tiplerine göre en yüksek circRNA zenginleştirme gözlendi.
Introduction
Dairesel RNA'lar (CircRNA'lar) ökaryotik transkripsiyon1,2,3'teyaygın olarak ifade edilen endojen, kodlamayan RNA'lardır. Onlar exons birbirlerine geri-splice oluşur ve bu nedenle başlangıçta eserler4,5birleştirme olarak kabul edildi . Ancak, son çalışmalar, circRNA'ların hücre tipini, dokuyu ve gelişim evresine özgü ekspresyonu3,6 ve evrimsel olarak korunmuş2,3olduğunu göstermiştir. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri arabuluculuk yer almaktadır7, mikro-RNA (miRNA) bağlayıcı3,8,9,10, ve ebeveyn gen transkripsiyon11düzenlenmesi .
Klasik RNA diziliminde (RNA-seq), circRNA'lar mRNA'lar için poli-A seçimi sonucunda kütüphane inşaatı sırasında tamamen kaybolabilir veya düşük bollukları göz önüne alındığında izole edilmesi zor olabilir. Ancak, son circRNA karakterizasyon çalışmaları amacıyla circRNA2,12,13için zenginleştirmek için RNase R kullanarak bir ön tedavi adımı dahil var. RNase R, dairesel RNA yapılarını geride bırakarak lineer RNA'ları sindiren bir exoribonuclease'dir. CircRNA zenginleştirme protokolleri, rnase R ön işlem adımı olan ve olmayan iki ticari olarak kullanılabilen tüm transkripsiyon kitaplığı yapı kitlerinden elde edilen verilerin üretilmesi ve karşılaştırılması ve değişen miktarlarda toplam RNA girişi kullanılarak optimize edilmiştir (1 ila 4 g). Optimize edilmiş protokol daha sonra beş farklı beyin bölgesinde (beyincik [BC], inferior parietal lob [IP], orta temporal girus [MG], oksipital korteks [OC] ve üstün frontal girus [SF]) ve diğer dört doku tipi (karaciğer [LV], akciğer [LU], lenf nodu [LN] ve pankreas [PA]) arasında circRNA bolluğunu değerlendirmek için kullanıldı. RNA-seq kütüphaneleri sıralı olarak eşleştirilmiş ve veriler altı farklı circRNA tahmin algoritmaları kullanılarak analiz edildi: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, ve CIRCexplorer18. Analizlerimize göre, RNase R ön işlem ve 4 μg toplam giriş RNA ile mahsur toplam RNA kütüphane hazırlama kiti kullanılarak en yüksek sayıda benzersiz circNA tespit edilmiştir. Optimize edilmiş protokol burada açıklanmıştır. Daha önce bildirildiği gibi19,20, circRNA en yüksek zenginleştirme diğer doku tipleri ile karşılaştırıldığında beyinde gözlendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Beyin dokuları Sun City, AZ Banner Güneş Sağlık Araştırma Enstitüsü Beyin ve Vücut Bağışı Programı elde edildi. Beyin ve Vücut Bağışı Programı'nın faaliyetleri Western Kurumsal İnceleme Kurulu (WIRB protokolü #20120821) tarafından onaylanmıştır. Tüm konular veya yasal temsilcileri bilgilendirilmiş onayı imzaladı. Ticari (beyin dışı) biyonumuneler Proteogenex'ten satın alınmıştır.
1. RNase R Tedavisi
NOT: Aşağıdaki adımlarda reaksiyon hacmi toplam 50 μL hacmine ayarlanır. Bu, RNA temizleme ve konsantratörü kitinde kullanılacak minimum numune hacmidir (bkz. Malzeme Tablosu). Ayrıca, burada açıklanan en iyi duruma getirilmiş protokol toplam RNA 4 μg giriş miktarı içindir. RNase R tedavisi için daha uzun bir kuluçka süresi giriş miktarı >4 g için önerilir.
- Mikrosantrifüj tüpünde 39 μL RNase içermeyen suda toplam RNA'yı 4°g'ya seyreltin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
- Ayrı bir tüpte, RNase R'yi 1x RNase R Reaksiyon Tamponu ile 2 U/μL çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Sadece hemen kullanmak için yeterli olun.
- Pipet 39 μL toplam RNA ve 5 μL 1.5 mL reaksiyon tüpü içine RNase R Reaksiyon Tampon ve pipetleme ile iyice karıştırın (50 μL toplam reaksiyon hacmi olacaktır). Daha sonra 6 μL R (2 U/μL) ekleyin.
- Pipeti tam reaksiyon hacmine (50°L) ayarlayın ve 10 kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın.
- Tüpü 10 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Tüpü buza yerleştirin ve hemen RNA temizleme ve konsantrasyonu (bölüm 2) ile devam edin.
2. RNA Temizleme ve Konsantratörü Kiti Kullanarak Arınma RNA
NOT: Yüksek kaliteli RNA (RIN>8, DV200>%80) kullanılırken RNa tedavisi RNA'nın yaklaşık %60'ında kayba neden olabilir. 4 μg'lik bir giriş kullanılarak, 2-2,5 μg tedavi edilen RNA'nın bölüm 1'den sonra bırakıldığı tahmin edilmektedir.
- Başlamadan önce, tampon konsantresine %100 etanol 48 mL ekleyerek RNA Yıkama Tamponu'nu hazırlayın ve pipetleme ile iyice karıştırın. Temizleme kolonlarını toplama tüplerine yerleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu)ve bir tüp rafına yerleştirin.
NOT: Aşağıdaki tüm adımlar için aşağıdaki santrifüj ayarlarını kullanın: 10.000-16.000 x g. DNase I tedavisi zaten yapıldıysa, bu aşamada DNase I tedavisini atlayın. - RNase R işlem görmüş numuneye 2 cilt RNA Bağlama Tamponu ekleyin ve pipetleme (toplam hacim: 150°L) ile iyice karıştırın.
- RNA Bağlayıcı Tampon ve RNase R işlenmiş numune karışımına %100 etanol ekleyin ve pipetleme (toplam hacim: 300°L) ile iyice karıştırın.
- Tüm hacmi sütuna aktarın ve sütunu 30 s. Akış tanzim edin.
- Doğrudan sütuna 400 μL RNA Hazırlık Arabelleği ekleyin, sütunu 30 s'lik santrifüj edin ve akışı atın.
- Doğrudan sütuna 700 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin, sütunu 30 s'lik santrifüj edin ve akışı atın.
- Doğrudan sütuna 400 μL RNA Yıkama Tamponu ekleyin, sütunu 2 dakika santrifüj edin ve sütunu taze bir RNase içermeyen 1,5 mL tüpe aktarın.
- Pipet ucunu kolon filtresinin hemen üzerinde tutarak ve suyun yalnızca kolon filtresine inmesini sağlayarak doğrudan kolona 11 μL RNase içermeyen su ekleyin.
- Oda sıcaklığında 1 dakika ve santrifüj 1 dk için sütun kuluçka.
- Before discarding the column, check for flow through in the RNase-free tube. Elüsasyon başarılı olduysa, örneğini -80 °C'de saklayın veya hemen kütüphane hazırlığına devam edin. Yaklaşık 10 μL'lik son toplam elüsyon hacmi kütüphane inşaatı için kullanılır.
NOT: Durma noktası: Kütüphane hazırlığına devam etmeden önce RNA'yı -80 °C'de 7 güne kadar bırakın.
3. circRNA Kütüphane Hazırlık
NOT: Bu bölümde kullanılan çoğu reaktifi içeren kit için Malzeme Tablosu'na bakın.
- rRNA tükenmesi ve parçalanma
- Yeni 96 kuyulu 0,3 mL PCR plakalı temiz bir kuyuya 2.10 adımdan 10 μL saf RNA aktarın. Kuyuya 5 μL rRNA Bağlama Tamponu ve ardından 5 μL rRNA Kaldırma Karışımı ekleyin. Yavaşça pipet yukarı ve aşağı 10 kez karıştırmak için.
- Önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğunda 68 °C'de 5 dk'lık sızdırmazlık plakası ve kuluçka makinesi. 5 dk kuluçka tamamlandıktan sonra, tezgah üzerine plaka yerleştirin ve 1 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- Plakadan mühür çıkarın. Örnek için 35 μL girdaplı oda sıcaklığında rRNA kaldırma boncukları ekleyin. Pipeti 45°L ve pipeti 10-20x yukarı ve aşağı doğru ayarlayarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 1 dk kuluçka plakası.
- Plakayı manyetik bir standa aktarın ve 1 dakika boyunca veya çözelti temize çıkana kadar standda kuluçkaya yatırın. Tüm supernatant 'ı (~45 μL) aynı plaka veya yeni plaka üzerindeki yeni kuyuya (kaç örnekle çalıştığınıza bağlı olarak) aktarın.
- Vortex RNA temizleme boncukları (Malzeme Tablosubakınız) kadar iyi dağılmış ve her örnek için boncuk 99 μL ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10x karıştırmak için. 10 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka.
- Plakayı manyetik standa aktarın ve çözelti temize çıkana kadar 5 dakika daha kuluçkaya yatırın. Tüm supernatant'ı kuyudan çıkarın ve atın.
- Plaka hala manyetik standda yken, boncukları bozmadan kuyuya 200 μL taze hazırlanmış %80 EtOH ekleyin. 30 s için kuluçka, sonra çıkarın ve etanol atın. Toplam 2 yıkıntı için tekrarlayın.
- Her kuyuya 11 μL Elütion Tampon ve karıştırmak için 10 kat yukarı ve aşağı pipet ekleyin. 2 dakika oda sıcaklığında kuluçka, ve sonra çözelti (1-5 dk) temizler kadar manyetik standa aktarın.
- Süpernatantın 8,5 μL'sini kuyudan aynı plakalı yeni bir kuyuya veya yeni bir plakaya aktarın. İçerdeki her numuneye 8,5 l Elute, Primer, Fragment High karışımı ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için.
- Önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğunda 94 °C'de 8 dk'lık sızdırmazlık plakası ve kuluçka makinesi. 4 °C'ye ulaştığında termocycler'dan ve kısa bir süre santrifüjden çıkarın.
NOT: Hemen Synthesize First Strand cDNA protokolüne devam edin.
- Sentez cDNA
- Hazırlanan her numune için 9 μL First Strand Synthesis Mix ile 1 μL ters transkriptaz karıştırın (bkz. Malzeme Tablosu). Karışımdan 8 μL'lik karışımı numuneye ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 6 kez karıştırmak için.
- Mühür plakası ve önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğu nda aşağıdaki parametreleri kullanarak inkübat: 10 dk için 25 °C, 15 dk için 42 °C, 15 dk için 70 °C, 4 °C tutun. Hemen ikinci iplikçik sentezine devam edin.
- Her numuneye 5 μL Resuspension arabelleği ve ardından 20 μL İkinci İplik İşaretleme ana karışımı ekleyin. Pipet tüm hacmi yukarı ve aşağı 6 kez.
- Mühür plakası ve önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler blok üzerinde 1 saat için 16 °C olarak ayarlanır. Kuluçkadan sonra, plakayı termocycler'dan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar dengelenin.
- Vortex PCR arınma boncukları (Bkz. Malzeme Tablosu)ve numunenin her kuyuya 90°L boncuk ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- Boncuk/numune karışımını manyetik standa aktarın ve 5 dakika veya sıvı temizlene kadar kuluçkaya yatırın. Supernatant'ı çıkarın ve atın.
- Her numuneye 200 μL %80 EtOH ekleyin. 30 s. Supernatant atın oda sıcaklığında manyetik standı üzerinde kuluçka örnekleri. 1x'i tekrarlayın.
- Boncukların oda sıcaklığında 6 dk kurumasını bekleyin ve manyetik standdan çıkarın.
- Resuspension tampon 19.5 μL boncuklar resuspend. Pipet yukarı ve aşağı 10 kez iyice karıştırmak için. 2 dakika oda sıcaklığında kuluçka, sonra manyetik standa aktarın ve ek bir 1 dakika veya sıvı temizler kadar kuluçka.
- 17,5 μL supernatant'ı yeni iyi/yeni plakaya aktarın.
NOT: Hemen devam edilmezse, numuneler -20 °C'de 7 güne kadar saklanabilir.
- Hazırlanan her numune için 9 μL First Strand Synthesis Mix ile 1 μL ters transkriptaz karıştırın (bkz. Malzeme Tablosu). Karışımdan 8 μL'lik karışımı numuneye ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 6 kez karıştırmak için.
- Kütüphane hazırlama
- Supernatant içeren her kuyuya 12,5 l A-Tailing Mix ekleyin. Pipet tüm hacmi yukarı ve aşağı 10 kez karıştırmak için.
- Aşağıdaki parametreleri kullanarak 37 °C'ye ayarlanmış önceden programlanmış, önceden ısıtılmış bir termocycler bloğunda reaksiyonu kuluçkaya yatırın: 30 dk için 37 °C, 5 dk için 70 °C, 4 °C tutun. Numuneler 4 °C'ye ulaştığında hemen adaptör ligasyonuna geçin.
- Her numune için 2,5 l Resuspension arabellek, 2,5 μL benzersiz bir RNA adaptörü ve 2,5 μL Ligasyon Karışımı ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 10x karıştırmak için.
- Önceden programlanmış, önceden ısıtılmış termocycler bloğunda 30 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Her numuneye 5 μL Stop Ligation tamponu ekleyin ve karıştırmak için pipet yukarı ve aşağı.
- Her numuneye 42 μL karışık PCR arınma boncukları ekleyin ve iyice karıştırın. 3.2.6 ile 3.2.10 adımlarını izleyin, ancak geri süspansiyon hacmini 52°L ve son elüsyon hacmini 50°L olarak değiştirin.
- PCR arınma boncuk protokolünü adım 3.3.6'dan 50 μL elüsiyon ile tekrarlayın, ancak geri süspansiyon hacmini 22 μL ve son elüsyon hacmini 20 μL olarak değiştirin.
NOT: Hemen devam edilmezse, numuneler -20 °C'de 7 güne kadar saklanabilir. - Her örneğe 5 000 ADET PCR Primer Kokteyl ve 25 000 ADET PCR Master Mix ekleyin. 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak karıştırın. Reaksiyonu önceden programlanmış, önceden ısıtılmış bir termocycler bloğunda aşağıdaki parametreleri kullanarak kuluçkaya yatırın: 30 s için 98 °C; daha sonra 10 s için 98 °C'nin 8 döngüsü, 30 s için 60 °C ve 30 s için 72 °C; sonra 72 °C için 5 dk, sonra 4 °C tutun.
NOT: Sıralama için yeterli miktarda kitaplık oluşturmak için toplam PCR döngüsü sayısının optimizasyonu gerekebilir. - PCR boncuk arınma protokolünü (3.2.4'ten 3.2.9'a kadar) uygulayın, ancak 50 μL iyi karıştırılmış PCR saflaştırma boncukları ekleyin ve geri süspansiyon hacmini 30 μL'lik son bir elüsasyon hacmiyle 32,5 μL'ye değiştirin.
NOT: Numuneler -20 °C'de saklanmalıdır.
- Nükleik asit analizörü kullanılarak Niceleme ve Kalite Kontrolü
- Bantların ve reaktiflerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dengede olmasını bekleyin.
- 2 μL'lik kitaplığı 2 μL HS D1000 arabelleğiyle karıştırın ve uyumlu bir kuyu plakasına ekleyin.
- Uyumlu folyo conta ile sıkıca kapatın ve 2000 rpm'de 1 dk girdap.
- Yazılım istemlerini izleyerek analizöre plakayı indirin ve yükleyin.
NOT: Kütüphaneler yaklaşık 260 bp boyutunda olmalıdır.
4. Veri Analizi İş Akışı
- Sıra RNA-seq kitaplıkları (Bkz. Malzeme Tablosu) oluşturmak için 82 bp eşleştirilmiş uçlu okumalar. Bcl2fastq aracını (v0.2.19) kullanarak ham sıralama verilerini basecall dosyaları (.bcl) şeklindefastq'lara dönüştürün.
- CircRNA'ları algıla.
NOT: Daha önce bildirilen kanıtlara dayanarak bir topluluk circRNA algılama yaklaşımı tek bir algılama aracı21,22kullanarak karşılaştırıldığında daha iyi performans , biz circRNA algılama için birden fazla araç kullanarak öneririz. Burada, circRNA'lar mevcut altı circRNA tahmin algoritması kullanılarak tanımlanmıştır: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE ve DCC, her algoritma için önerilen parametre ayarlarını uygulayarak.- Geliştiriciler tarafından sağlanan yönergeleri kullanarak her circRNA algılama algoritmasını linux yüksek performanslı bilgi işlem kümesine indirin ve kurun.
- RNA-seq FASTQ'ları referans genomuna (GRCh37) göre hizalayın ve her bir araç için önerilen hizalayıcıyı kullanın.
- Hizalamayı takiben, ilgili önerilen parametre ayarlarını uygulayarak circRNA algılama algoritmalarını çalıştırın.
- Her araç, algılanan circRNA'ların listesini içeren çok sütunlu bir sonuç dosyası çıkar, her örnek/test koşulunda tespit edilen aday sayısını ölçmek için circRNA koordinatlarını ve destekleyici okuma sayısını ayıklayacaktır.
- CIRCRNA koordinatçıktısını CIRI, Mapsplice ve DCC'nin diğer üç algoritmayla tutarlı olması için 0 tabanlı koordinatlara dönüştürün.
- İki veya daha fazla destekleyici okuma veya aşağı akış analizleri ve karşılaştırmaları ile circRNA'ları seçin. Tablo 1, çalışmamızda değerlendirilen tüm parametreleri ve her örnek için oluşturulan sıralama okumalarının toplam sayısını özetlemektedir.
- Her örnek/test koşulu için, bu kitaplık için oluşturulan haritalı okuma sayısına normalleştirilen algılanan circRNA sayısını milyonda sayın. Sonuçları, Temsilci Sonuçlarında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, kutu çizimlerinde bulunan çeşitli araçlar/örnekler arasında özetleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ticari olarak kullanılabilen evrensel kontrol RNA (UC) kullanılarak ve her ikisi de protokollerinde ribo-tükenme adımı içeren iki kitaplık hazırlama kitleri kullanılarak oluşturulan veriler ilk olarak değerlendirildi. Truseq veri kümelerinde Kapa veri kümelerine göre daha yüksek sayıda circRNA saptandı (Veri analizi iş akışı, bölüm 4), genel olarak (Şekil 1). Ribozomal RNA (rRNA) yüzdeleri daha düşük giriş miktarları için her iki kitten (1, 2 ug) veri kümelerinde %5'in altında olmasına rağmen, Kapa veri kümelerinde 4, 5 ve 10 ug girişleri için daha yüksek rRNA içeriği vardı(Tablo 2). Bu nedenle, tespit edilen circRNA sayısına ve rRNA tükenme verimliliğine bağlı olarak, TruSeq kiti kullanılarak başka deneyler yapılmıştır.
Daha sonra, RNase R ön arıtmanın önemi, RNase R önceden tedavi edilmiş ve tedavi edilmemiş kütüphanelerden elde edilen veriler karşılaştırılarak test edilmiştir. Bu amaçla, sağlıklı yaşlı bireylerin MG'sinden toplam RNA çıkarıldı ve (N = 3) ve (N = 3) olmayan kütüphanelerden oluşturulan sıralama verileri RNase R23 kullanılarak karşılaştırıldı. Önceden tedavi edilmeyen kütüphanelerde, önceden tedavi edilmeyen kütüphanelere kıyasla daha fazla sayıda circRNA saptandı(Şekil 2). Bu, ön arıtmanın lineer RNA'ları ortadan kaldırarak circRNA türleri için zenginleşmesi nden dolayı beklenmektedir.
Üçüncü olarak, daha yüksek bir circRNA çeşitliliğini tespit etmek için en uygun olan giriş RNA miktarı test edilmiştir. Kütüphaneler MG, OC ve SF beyin bölgelerinden çıkarılan toplam giriş RNA'sının 1, 2 ve 4 g'ı ile UC RNA kullanılarak hazırlanmıştır. Her kütüphaneden saptanan circRNA'ların bolluğu karşılaştırıldığında, tanımlanan benzersiz circRNA sayısına göre 4 μg giriş RNA(Şekil 3)ile karşılaştırıldığında en yüksek circRNA türlerinin çeşitliliği gözlenmiştir. Unutulmaması gereken bir uyarı, RNaSe R tedavisi sırasında çeşitli kuluçka süreleri test edilmese de, diğer tüm parametreler kontrol edilirken toplam RNA girdilerinde 1 ila 4 μg'lik circRNA sayısının giderek arttığı bir eğilim gözlenmiştir.
Bu optimize protokol daha sonra circRNA bolluklarını karşılaştırmak için birden fazla doku tipine uygulandı. Dört sağlıklı yaşlı bireyden BC, MG, OC, IP ve SF dahil olmak üzere beş beyin bölgesi, LV, LU, LN ve PA dahil olmak üzere dört diğer doku tipleri ile birlikte, altı sağlıklı donörden test edildi. Genel olarak, daha önce19,20bildirilmiştir , diğer doku tipleri(Şekil 4)ile karşılaştırıldığında beyinde daha yüksek bir bolluk gözlendi .
Şekil 1: TruSeq vs Kapa toplam RNA kitleri kullanılarak CircRNA algılama. UC RNA için her biri 1, 2, 4, 5 ve 10 μg girişli iki toplam RNA kitaplık hazırlama kitleri kullanılarak sıralama verileri oluşturuldu RNA ve ribonükleaz R (RNase R) ön işlem. Her örnekteki araçlar tarafından algılanan circRNA sayısı, milyonda (Y ekseni) eşlenen okuma sayısına göre normalleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: RNase R ön arıtmalı ve olmadan CircRNA tespiti. TruSeq kiti kullanılarak oluşturulan sıralama verileri RNase R ön işlem etkisini karşılaştırmak için kullanılmıştır. RNA bu analiz için sağlıklı yaşlı kontrollerinin orta temporal girus (MG) elde edildi. Algılanan circRNA'ların normalleştirilmiş sayısı (Y ekseni) Şekil 1'ebenzer şekilde hesaplanmıştır. RNase R+ = RNase R, RNase R- = ile önceden tedavi edilmemiş rNase R. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farklı miktarda giriş RNA kullanarak CircRNA tespiti. MG, oksipital korteks (OC) ve üstün frontal girus (SF) ve UC RNA'dan çıkarılan RNA kullanılarak, her biri TruSeq kiti ve RNase R ön işleme kullanılarak inşa edilen 1, 2 ve 4 μg giriş RNA'sı kullanılarak tespit edilen benzersiz circRNA sayısı karşılaştırıldı. Algılanan circRNA'ların normalleştirilmiş sayısı (Y ekseni) Şekil 1'ebenzer şekilde hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Beyinde CircRNA tespiti diğer doku tiplerine karşı. CircRNA, beyincik (BC), inferior parietal lob (IP), MG, OC ve SF gibi çeşitli beyin bölgelerinden elde edilen RNA kullanılarak zenginleştirilmiş veri kümelerinin yanı sıra karaciğer (LV), akciğer (LU), lenf düğümü (LN) ve pankreas (PA) dahil olmak üzere diğer dört doku tipi oluşturuldu. CircRNA zenginleştirme RNase R ön arıtma ve toplam giriş RNA 4 μg ile Illumina TruSeq kiti kullanılarak yapılmıştır. Kutu çizimleri, her beyin bölgesi/doku tipinden alınan örnekler arasında altı araçtan en az üçü tarafından algılanan circRNA sayısını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Test # | Parametre değerlendirildi | Test koşulları | Örnek kaynak | Giriş miktarları/koşulları/numuneleri test | Toplam sıralama okuma sayısı |
| 1 | Kütüphane hazırlama kiti | Illumina TruSeq Mahsup Toplam RNA vs Roche Kapa Toplam RNA kitleri | Uc | TruSeq: 1 μg | 8,91,46,128 |
| TruSeq: 2 μg | 7,93,90,202 | ||||
| TruSeq: 4 μg | 6,66,12,238 | ||||
| TruSeq: 5 μg | 7,88,56,902 | ||||
| TruSeq: 10 μg | 6,61,06,874 | ||||
| Kapa: 1 μg | 8,83,95,496 | ||||
| Kapa: 2 μg | 10,66,59,272 | ||||
| Kapa: 4 μg | 10,62,34,954 | ||||
| Kapa: 5 μg | 7,47,75,914 | ||||
| Kapa: 10 μg | 11,00,68,504 | ||||
| 2 | Ön arıtma | RNase R önceden tedavi edilen vs. önceden tedavi edilmemiş | Mg | Çift1: MG_1 (RNase R+) | 10,76,09,934 |
| Çift1: MG_5 (RNase R-) | 9,62,15,516 | ||||
| Çift2: MG_2 (RNase R+) | 9,68,40,790 | ||||
| Çift2: MG_6 (RNase R-) | 10,16,09,754 | ||||
| Pair3: MG_3 (RNase R+) | 11,15,76,344 | ||||
| Çift3: MG_7 (RNase R-) | 11,13,14,114 | ||||
| 3 | Toplam RNA girişi | 1 μg vs. 2 μg - 4 μg | MG, OC, SF, UC | MG: 1 μg | 12,00,94,758 |
| MG: 2 μg | 11,64,75,728 | ||||
| MG: 4 μg | 12,13,15,232 | ||||
| OC: 1 μg | 11,11,18,120 | ||||
| OC: 2 μg | 11,53,25,492 | ||||
| OC: 4 μg | 11,49,13,266 | ||||
| SF: 1 μg | 12,27,24,142 | ||||
| SF: 2 μg | 9,39,33,288 | ||||
| SF: 4 μg | 12,33,31,474 | ||||
| UC: 1 μg | 9,24,48,120 | ||||
| UC: 2 μg | 12,58,15,354 | ||||
| UC: 4 μg | 12,56,92,534 | ||||
| 4 | Doku tipleri | Beyin bölgeleri ve diğer doku tipleri | BC, MG, OC, SF, IP, LU, LV, LN, PA | BC_1 | 10,72,08,904 |
| BC_2 | 11,18,33,362 | ||||
| BC_3 | 9,61,25,856 | ||||
| BC_4 | 9,62,77,094 | ||||
| IP_1 | 9,86,56,506 | ||||
| IP_2 | 11,35,95,746 | ||||
| IP_3 | 12,87,81,536 | ||||
| IP_4 | 9,59,81,446 | ||||
| MG_1 | 10,76,09,934 | ||||
| MG_2 | 9,68,40,790 | ||||
| MG_3 | 11,15,76,344 | ||||
| MG_4 | 10,05,39,028 | ||||
| OC_1 | 8,85,47,042 | ||||
| OC_2 | 12,09,83,142 | ||||
| OC_3 | 10,26,55,452 | ||||
| OC_4 | 10,84,49,330 | ||||
| SF_1 | 8,76,21,824 | ||||
| SF_2 | 14,50,57,894 | ||||
| SF_3 | 11,01,52,030 | ||||
| SF_4 | 9,67,24,472 | ||||
| LN_1 | 15,02,94,816 | ||||
| LN_2 | 8,33,30,187 | ||||
| LN_3 | 11,30,96,032 | ||||
| LN_4 | 10,78,38,278 | ||||
| LU_1 | 16,05,27,595 | ||||
| LU_2 | 8,94,30,799 | ||||
| LU_3 | 9,14,51,858 | ||||
| LV_1 | 9,72,18,369 | ||||
| LV_2 | 10,54,16,880 | ||||
| LV_3 | 8,86,53,148 | ||||
| LV_4 | 8,61,02,943 | ||||
| LV_5 | 12,87,88,483 | ||||
| LV_6 | 11,87,76,622 | ||||
| PA_1 | 8,79,20,160 | ||||
| PA_2 | 7,82,36,741 | ||||
| PA_3 | 10,21,24,209 | ||||
| PA_4 | 11,53,22,926 |
Tablo 1: Örnek ve test koşulları özeti. Bu çalışmada değerlendirilen tüm parametrelerin ve test koşullarının özeti ve her örnek için oluşturulan sıralama okumalarının toplam sayısı. UC = evrensel kontrol, MG = orta temporal girus, OC = oksipital korteks, BC = beyincik, IP = inferior parietal lob, SF = superior frontal girus, LU = akciğer, LV = karaciğer, LN = lenf düğümü, PA = pankreas, RNase R = ribonuklez R, RNase R+ = rnase R, RNase R ile ön tedavi edilmez.
| Örnek kaynak | Giriş miktarları/numuneleri test edildi | Yüzde rRNA |
| Uc | TruSeq: 1 μg | 5.53% |
| TruSeq: 2 μg | 4.11% | |
| TruSeq: 4 μg | 4.38% | |
| TruSeq: 5 μg | 3.21% | |
| TruSeq: 10 μg | 3.74% | |
| Kapa: 1 μg | 5.57% | |
| Kapa: 2 μg | 4.56% | |
| Kapa: 4 μg | 9.67% | |
| Kapa: 5 μg | 12.69% | |
| Kapa: 10 μg | 15.59% |
Tablo 2: TruSeq vs Kapa kütüphanelerinde rRNA yüzdeleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, circRNA sıralama kitaplıklarının inşası için circRNA zenginleştirme protokolünü optimize etmek amacıyla ticari olarak kullanılabilen iki kütüphane hazırlama kitleri, ön işlem seçenekleri ve giriş RNA miktarları test edilmiştir. Bu çalışmanın değerlendirmelerine dayanarak, circRNA sıralama kitaplıklarının oluşturulmasında önemli ve kritik adımlar ortaya çıkmıştır. Değerlendirmemiz, tespit edilen circRNA sayısının artmasıyla yansıtTığı üzere RNase R ön arıtmanın yararını doğrulamaktadır. Genel olarak, RNase R ön arıtma ve 4 μg giriş RNA ile Illumina TruSeq kütüphane kiti kullanırken circRNA daha yüksek bir çeşitlilik gözlendi. Bu sonuçlar, RNase R zenginleştirme adımının circRNA2'nin saptanması nda yararlı olduğu önceki bulgularla uyumludur.
CircRNA kitaplık yapısının diğer önemli yönleri arasında sıralama için kullanılabilen toplam RNA miktarı nın yanı sıra RNA'nın elde ettiği doku tipi de yer almaktadır. Toplam RNA'nın 4 μg'lik girişinin tespit edilen circRNA'ların en yüksek sayıda olduğu saptansa da, RNAseq çalışmalarının çoğu toplam RNA'nın <=1 μg'sini kullanır ve bu da özellikle insan örneklerinin analizi için daha yüksek miktarlarda elde etmek zor olabilir. CircRNA'ların tanımlanması daha düşük giriş tutarları için uygulanabilir olmaya devam etmektedir, ancak analizin özgüllüğünün etkilenebileceğini kabul etmek önemlidir. Bu çalışmada daha önce bildirilen19,20,diğer dokulara göre insan beyninde tespit edilen circRNA'ların daha yüksek sayıda vurgulamaktadır. Bu nedenle farklı doku tipleri arasında circRNA'ların diferansiyel ekspresyonunu kabul etmek çok önemlidir. Ayrıca, hastalık bağlamında ek araştırmalar, çERNA'ların patojenik süreçlere nasıl dahil olabileceğine ışık tonuyla aydınlatılması açısından önemli olacaktır.
Değerlendirilen iki RNA kitaplık hazırlama kitlerinin performansı, farklı ticari olarak kullanılabilen kitlerin önemli benzerlikler gösterse de, circRNA'ları analiz ederken hala farklılıklar ın gözlendiğini vurgulamaktadır. Bu karşılaştırmadan elde edilen iki önemli bulgu arasında azalmış rRNA tükenmesi ve tek bir yaklaşımla tanımlanan daha az sayıda circRNA bulunmaktadır. Bir olasılık, bir örnekteki daha yüksek miktarda rRNA'nın sıralanabilir circRNA kütüphane molekülleri oluşturmaya engel olabileceği olmakla birlikte, bu bulgu, özellikle reaktifler tescilli olduğunda benzer kitleri değerlendirme gereğini vurgulamaktadır.
Burada sunulan veriler çeşitli doku tiplerinde circRNA'ların varlığı ve bolluğu hakkında bilgi sağlasa da, bu çalışmanın birkaç teknik sınırlaması vardır. İlk olarak, RNase R tedavisi bir örnekte lineer RNA popülasyonunu azaltırken, bu tükenme adımının circRNA tespitinde herhangi bir önyargı getirip getirmediği ve circRNA'ları tüketip tüketemeyeceği iyi anlaşılamamıştır. Önceki çalışmalarda bazı durumlarda, circRNARRAs RNase R2duyarlıolduğunu bildirdin ,24,25. İkinci olarak, toplam RNA girişinin 4 μg'nin üzerine çıkarılmasının tanımlanan circNA sayısında doğrusal bir artışa yol açacağı belirsizdir. Daha önce de belirtildiği gibi, mevcut toplam RNA genellikle araştırma çalışmalarında sınırlıdır bu yüzden düşük girdi miktarları burada kabul edildi. Dikkat, daha düşük girdiler ilerlerken circRNA'lar hala algılanabilir, ancak daha düşük girdilerin daha düşük sayıda circRNA'nın tespitiyle ilişkili olduğunu kabul etmek önemlidir. Üçüncü olarak, burada sunulan optimize edilmiş protokol, belirli bir doku kümesinden çıkarılan RNA'ları kullanır. Farklı doku tipleri arasında circRNA ekspresyonunun değişken dağılımı göz önüne alındığında, toplam RNA giriş miktarları ile tanımlanan circRNA sayısı arasındaki ilişki dokular arasında farklılık gösterebilir.
CircRNA'ların biyolojik rolünü anlamada artan ilgilerle, circNA'ların karakterizasyonu ve tanımlanmasını daha iyi sağlamak için yeni stratejiler geliştirilmektedir. Yeni bir biyoinformatik yaklaşım, tam uzunlukta circRNA'ların yeniden yapılandırılması yoluyla düşük bir şekilde ifade edilebilen circRNA'ların tanımlanmasını sağlarken, spesifik circRNA izoformlarının ekspresyonunun nicelleştirilmesini de sağlar26. Bu yaklaşım, circRNA kitaplık moleküllerinin 3' veya 5' uçlarında oluşabilecek ters çakışma (RO) okuması olarak tanımlanan özelliklerden yararlanır. Hem laboratuvar yaklaşımlarını hem de biyoinformatik araçlarını kapsayan circRNA'ların belirlenmesine yönelik yeni stratejilergeliştirilmesi, alanın circNA'ların işlevini ve etkisini anlamasına katkıda bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz Banner Güneş Sağlık Araştırma Enstitüsü Beyin ve Vücut Bağışı Programı (BBDP) Sun City, Arizona insan beyin dokularının sağlanması için müteşekkiriz. BBDP Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (U24 NS072026 Parkinson Hastalığı ve İlişkili Bozukluklar için Ulusal Beyin ve Doku Kaynağı), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (P30AG19610 Arizona Alzheimer Hastalığı Çekirdek Merkezi), Arizona Sağlık Hizmetleri Bölümü (sözleşme 211002, Arizona Alzheimer Araştırma Merkezi), Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (sözleşmeler 4001, 0011, 05-901 ve 1001 Arizona Parkinson Hastalığı Konsorsiyumu için) ve Michael J. Parkinson Araştırma Fox Vakfı27. Bu çalışma aynı zamanda DHS ve Arizona Eyaleti (ADHS hibe # ADHS14-052688) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Andrea Schmitt (Banner Araştırma) ve Cynthia Lechuga (TGen) idari destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al.
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al.
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
