Summary
Este método é útil para quantificar a dinâmica precoce da adesão celular e disseminação de células dependentes de ancoragem para a fibronectina. Além disso, este ensaio pode ser usado para investigar os efeitos da homeostase redox alterada na propagação da pilha e/ou nas vias de sinalização intracelular adesão-relacionadas da pilha.
Abstract
A adesão e disseminação de células para a matriz extracelular (ECM) são processos celulares essenciais durante o desenvolvimento organizador e para a homeostase de tecidos adultos. Curiosamente, o estresse oxidativo pode alterar esses processos, contribuindo assim para a fisiopatologia de doenças como o câncer metastático. Conseqüentemente, compreender o mecanismo (s) de como as pilhas anexam e espalham no ECM durante as perturbações no status redox pode fornecer a introspecção em Estados normais e da doença. É descrito abaixo um protocolo passo-sábio que utilize um ensaio immunofluorescence-baseado para quantificar especificamente a adesão e a propagação da pilha de pilhas imortalizado do fibroblasto no fibronectina (FN) in vitro. Brevemente, as células dependentes de ancoragem são mantidas em suspensão e expostas ao inibidor da quinase ATM Ku55933 para induzir o estresse oxidativo. As pilhas são chapeadas então na superfície FN-revestida e permitidas anexar por períodos de tempo predeterminados. As células que permanecem ligadas são fixas e rotuladas com marcadores de anticorpos de adesão à base de fluorescência (por exemplo, paxillin) e espalhamento (por exemplo, F-Actina). A aquisição e a análise dos dados são executadas usando o equipamento de laboratório geralmente disponível, incluindo um microscópio da epifluorescência e software livremente disponível de Fiji. Este procedimento é altamente versátil e pode ser modificado para uma variedade de linhas celulares, proteínas de ECM, ou nervos inibidores a fim examinar uma escala larga de perguntas biológicas.
Introduction
Aderências de matriz celular (ou seja, aderências focais) são grandes e dinâmicos complexos proteicos multimoleculares que mediam a adesão e disseminação celular. Estes processos são críticos para o desenvolvimento do tecido, a manutenção, e a função physiological. As aderências focais são compostas de receptores ligados à membrana, como as integrinas, bem como as proteínas de andaimes que ligam a actina citoesquelética à matriz extracelular (ECM)1. Esses complexos são capazes de responder a pistas fisioquímicas presentes no ambiente extracelular através da ativação de várias vias de transdução de sinalização. Como tal, as aderências focais servem como centros de sinalização para propagar pistas mecânicas extracelulares em vários processos celulares, incluindo migraçãodirecionada, regulaçãodo ciclo celular, diferenciação e sobrevida1,2. Um grupo de moléculas de sinalização que regulam e interagem com aderências focais inclui membros da família Rho de pequenos GTPases. As GTPases Rho são proteínas-chave que regulam a migração celular e a dinâmica de aderência através de sua ativação espaciotemporal específica3. Não surpreendentemente, a desregulação da função da proteína Rho tem sido implicada em um número de patologias humanas, tais como metástases, angiogênese, e outros. De particular interesse, o status redox celular desempenha um papel predominante na modulação da migração celular e adesão. Alterações na homeostase redox, como aumentos de espécies reativas de oxigênio (ROS), têm sido demonstradas para regular a atividade protéica de Rho, bem como adesão, em um número de tipos de células e doenças humanas4,5,6 ,7,8. Por exemplo, indivíduos que sofrem da desordem neurológica ataxia-Telangiectasia (A-T), que é causada por uma mutação no reparo de danos de DNA serina/treonina quinase A-T-Mutated (ATM), têm um risco aumentado de câncer metastático9, a 10. A perda da atividade da quinase ATM nesses pacientes e linhagens celulares, seja por meio da mutação genética ou da inibição química, resulta em altos níveis de estresse oxidativo devido à disfunção da via de fosfato pentose7,11, doze anos. Além disso, os estudos recentes do laboratório destacaram um papel patofisiológico para ROS em A-T alterando a dinâmica do cytoesquelético (isto é. adesão e espalhar) como um resultado direto de ativar GTPases da família de Rho in vitro5. Em última análise, essas alterações na dinâmica citoesquelética causadas pela ativação da família Rho podem levar ao aumento do risco de câncer metastático observado em pacientes com A-T5,13. Portanto, compreender a interação entre as interações célula-matriz durante o estresse oxidativo pode fornecer insights sobre a regulação da adesão e disseminação. Estes estudos podem igualmente ajustar o estágio para umas investigações mais adicionais em um papel possível para GTPases da família de Rho nestes processos de sinalização.
Descrito aqui é um protocolo para estudar a dinâmica celular precoce do conjunto de aderência e disseminação durante o estresse oxidativo causado pela inibição da atividade da quinase ATM. Este ensaio baseia-se no mecanismo bem caracterizado de adesão de células dependentes de ancoragem à fibronectina de proteína ECM (FN). Quando as células mantidas em suspensão são chapeadas na FN, vários Rho GTPases coordenam o controledo remodelamentocitoesquelético de actina14,15. Alterações morfológicas são observadas à medida que as células mudam de volta e circulares na aparência para achatado e expandido. Concomitante com estas observações é o desenvolvimento de aderências numerosas da matriz com o ECM. Essas alterações são atribuídas à ativação bifásica de Rhoa com Rac1 durante a primeira hora em que as células aderem e se espalham 15,16.
Uma variedade de métodos tem sido utilizada para examinar a morfologia da adesão e dinâmica, bem como a propagação celular. No entanto, esses métodos dependem de sistemas sofisticados de fluorescência de reflexão interna (TIRF) ou de microscopia confocal de longo prazo e de imagem viva. Assim, os usuários devem ter acesso a equipamentos e softwares especializados. Além disso, o tempo de set-up exigido por esses sistemas de bioimagem torna a captura de eventos de adesão precoce desafiador, especialmente quando o teste de múltiplos inibidores ou condições de tratamento simultaneamente.
Os métodos detalhados, aqui, fornecem uma maneira direta, econômica, contudo quantitativa de avaliar os parâmetros que governam o conjunto da adesão e que espalham in vitro. O protocolo é realizado usando equipamentos laboratoriais comumente disponíveis, como um microscópio de epifluorescência e câmera CCD. Este ensaio envolve a aplicação de células dependentes de ancoragem a uma superfície revestida com FN após um período de estresse oxidativo causado pela inibição química da atividade da quinase ATM, que tem sido demonstrada anteriormente5. Após o chapeamento, as células são permitidas para anexar e aderir para comprimentos especificados de tempo. As células não anexadas são lavadas, enquanto as células anexadas são fixas e marcadas com anticorpos à base de fluorescência para marcadores de aderência (por exemplo, paxillin) e espalhamento (por exemplo, F-Actina)2,5. Essas proteínas são então visualizadas e gravadas usando um microscópio de epifluorescência. A análise de dados subseqüente é executada usando o software livremente disponível de Fiji. Além disso, este método pode ser adaptado para examinar a dinâmica de adesão uma ampla gama de condições, incluindo diferentes proteínas de ECM, tratamento com vários oxidantes/condições de cultura celular ou uma variedade de linhas celulares dependentes de ancoragem para abordar uma ampla gama de questões biológicas.
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Protocol
1. os preparativos
Nota: o protocolo descrito abaixo foi otimizado para o uso com células REF52 e ATM+/+ ou ATM-/- fibroblastos humanos. Outros tipos de célula podem exigir mais otimização conforme descrito nas seções de anotações e solução de problemas abaixo.
- Faça 500 mL de meio de cultura celular completo para células REF52. Para 500 mL de alta-glicose contendo Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) adicionar 10% FBS, 2 mM L-glutamina, e 100 unidades/mL penicilina-estreptomicina.
- Prepare uma solução de 25 μg/mL de fibronectina (FN) adicionando 300 μL de 1 mg/mL de solução FN a 12 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato 1x estéril (PBS), pH 7,4. Misture bem.
- Prepare uma solução de albumina sérica bovina (dlBSA) de 0,5% (p/v) delipidada (ou seja, livre de ácidos graxos) em meio de cultura de células DMEM livre de soro. Adicionar 0,5 g de dlBSA a 100 mL de meio livre de soro DMEM. Misture bem a solução, mas não vórtice. Filtro estéril a solução em um novo recipiente estéril, usando um filtro de seringa de 0,22 μM antes de usar. Conservar a 4 ° c.
- Fazer 3,7% paraformaldeído solução dissolvendo 3,7 g de paraformaldeído em 100 mL de 1X PBS. Use calor suave e agitação para obter o paraformaldeído em solução.
Nota: a solução paraformaldeído é sensível à luz e deve ser protegida da luz. É bom para até uma semana quando armazenado em 4 ° c.
Cuidado: o paraformaldeído é tóxico, inflamável, corrosivo e um perigo para a saúde. Reveja a ficha de dados de segurança do material para o paraformaldeído antes da utilização. Use o equipamento de proteção pessoal apropriado ao manusear, incluindo protetor ocular, protetor facial, respirador de partículas de rosto completo, luvas e jaleco. - Prepare a solução de permeabilização contendo 0,2% de surfactante não iônico em 1X PBS (v/v). Para 100 mL, adicione lentamente 0,2 mL de Triton X-100 a 100 mL de 1X PBS, enquanto mexendo.
- Faça o tampão de obstrução da imunofluorescência que contem 2,5% BSA, soro de cabra de 5%, e 0, 5% surfactante non-ionic (w/v/v) dissolvido na solução de 1X PBS. Para 100 mL, adicione 5 mL de soro de cabra, 2,5 g de BSA e 0, 5 mL de Triton X-100 em ~ 95 mL 1X PBS, enquanto mexendo.
- Cresça REF52 pilhas no meio de cultura completo de DMEM em uma placa cultura-tratada da pilha de 10 cm2 (ou qualquer outro tamanho da embarcação) em uma incubadora da cultura de pilha em 37 ° c e em 5% co2.
2. placas da cultura da pilha do revestimento com o fibronectina da proteína da matriz extracelular
Nota: Realize esta seção usando a técnica asséptica e os reagentes estéreis em uma capa de fluxo laminar certificada BSL-2. Refira a Figura 1a para uma vista geral das etapas chaves antes do começo.
- Usando uma cultura de tecido certificada 24-placa bem, coloque uma lamínula de vidro (12-CIR-1) em cada poço. Rotule a chapa de acordo com a Figura 1b.
- Pipete 500 μL da solução de 25 μg/mL FN para cada poço de uma placa de 24 poços.
- Pipeta a solução sobre cada lamela algumas vezes para assegurar mesmo o revestimento e a submersão completa. Coloque a tampa de volta na placa.
- Incubar a placa em uma incubadora da cultura de pilha em 37 ° c e em 5% CO2 para 1 h.
Nota: Alternativamente, incubar durante a noite a 4 ° c. - Após 1 h, retire a placa da incubadora e aspirar a solução FN dos poços.
- Lave os poços três vezes com 500 μL de 1X PBS. Aspirar a lavagem final de 1X PBS.
- Bloqueie os poços com 500 μL de solução de dlBSA 0,5% por um mínimo de 15 min a 37 ° c e 5% CO2.
- Aspirar a solução de dlBSA antes de células de chapeamento na etapa 3 abaixo.
Nota: se armazenar placas, adicione 500 μL de 1X PBS a cada lamínula após aspiração da solução de dlBSA. As placas podem então ser mantidas em 4 ° c por até uma semana.
3. preparação de células dependentes de ancoragem para o ensaio de adesão
Nota: Realize esta seção usando a técnica asséptica e os reagentes estéreis em uma capa de fluxo laminar certificada BSL-2.
- Pelo menos 30 minutos antes do chapeamento de pilha, Pre-aqueça as seguintes soluções: meio completo de DMEM, solução de dlbsa, 1X PBS, solução do tripsina-EDTA de 0,5%, e soro neutralizando do tripsina (TNS) em um banho de água de 37 ° c.
- Começando com uma monocamada confluente de células REF52 em um prato de 10 cm2 , lave as células duas vezes com 6 ml de PBS 1x quente. O soro passa fome nas células por pelo menos 1 h (dependendo do tipo de célula) em 6 mL de solução de dlBSA morna a 37 ° c e 5% CO2.
- As células de lavagem com 6 mL de PBS aquecido 1x, aspiram PBS e adicionam 1,5 mL de solução morna de Trypsin-EDTA a 0,5%.
- Coloc pilhas em uma incubadora da cultura de pilha em 37 ° c e em 5% CO2 para ~ 2 min.
- Observe as células um microscópio de luz para garantir que o descolamento esteja completo. Se as pilhas são ainda aderentes após ter escutados a placa na parte superior de banco, retorne à incubadora do ° c 37 por uns 2 minutos adicionais Trypsinize as pilhas para tão pouco tempo como é necessário.
- Pipetar 1,5 ml de solução de neutralização de tripsina quente (TNS) para o prato para parar a tripsinização e coletar células destacadas. Pipeta a solução para cima e para baixo sobre a parte inferior da placa inúmeras vezes para remover todas as restantes células aderentes. Se as células pareceram desajeitando, triturar ainda mais a suspensão da célula gentilmente pipetando para cima e para baixo sobre a parte de trás do prato.
- Contagem de células usando Tripan exclusão azul e um hemocitômetro um microscópio de luz. Alternativamente, use um contador de células automatizado.
- Remova uma quantidade apropriada de células para criar uma suspensão de célula 1,0-3,0 x 104 Cells/ml em 5 ml de dlbsa em um tubo cônico de 15 ml.
- Centrifugue pilhas em ~ 300 x g por 5 minutos usando um rotor de ângulo fixo em uma centrífuga Table-Top.
- Aspirar o sobrenadante do pellet celular, e suspender as células em um total de 7 mL de solução de dlBSA quente. Não permita que as pilhas sejam excessivamente confluentes em cima do chapeamento do lamela, mas distribuído uniformente com poucas pilhas que tocam-se um outro.
- Divida uniformemente a suspensão celular em 2 15 mL de tubos cônicos, um para o controle do veículo sozinho (DMSO) e um para Ku55933 (inibidor da quinase ATM, oxidante)5. Assegure-se de que cada tubo contenha 3,5 mL da suspensão celular.
- Usando um rotator do tubo, giram em torno os tubos em 37 ° c por 90-120 minutos em uma incubadora da cultura de pilha.
- 30 min antes do revestimento, adicione uma concentração final de 10 μM Ku55933 e DMSO (1:1000) a cada tubo respectivo. Coloque a suspensão da célula de volta no rotor para o tempo restante.
- Imediatamente antes de galvanizar as células, recupere a placa de 24 poços da incubadora e aspire a solução de dlBSA.
- Depois de girar a suspensão celular por 90-120 min, remova 500 μL de suspensão celular de cada grupo de tratamento e acrescente a uma cobertura de FN revestida na placa de 24 poços da etapa 2 como ilustrado (Figura 1b). Retorne a placa ao ° c 37 e à incubadora da cultura da pilha de 5% CO2 e à suspensão da pilha de volta à rotação.
- Depois de chapeamento da suspensão da célula no FN cobertas-COVERSLIP, permitir que as células aderir para o período de tempo desejado (por exemplo, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min) e, em seguida, prossiga imediatamente para o passo 4.
4. fixação celular e coloração de anticorpos para imunofluorescência
Nota: as seguintes etapas são executadas circunstâncias não estéreis e na temperatura ambiente a menos que indicado de outra maneira.
- Após o tempo desejado para a adesão passou, aspirar a solução celular de cada lamínula na placa.
- Usando os lados do poço, dispense suavemente 500 μL de solução de paraformaldeído 3,7% em cada lamínula e aguarde 10-15 min.
- Retire a solução paraformaldeído e lave cada lamínula com 500 μL de 1X PBS para um total de duas vezes.
Nota: descarte o resíduo de paraformaldeído de forma responsável, de acordo com o plano de saúde e segurança ambiental da instituição. - Aspirar a PBS, e permeabilizar as células em cada lamínula com 500 μL de 0,2% Triton X-100 em 1X PBS (v/v) para 10-15 min à temperatura ambiente.
- Lave cada lamínula com 500 μL de 1X PBS três vezes.
- Bloqueie as células em cada lamínula com 500 μL de tampão de bloqueio de imunofluorescência contendo 5% de soro de cabra, 2,5% BSA e 0, 5% Triton X-100 dissolvidos em uma solução de 1 X PBS por 30-60 minutos.
- Diluir o anticorpo primário anti-paxilina (1:250) no tampão de bloqueio. Misture bem e adicione 200 μL da solução de anticorpos a cada lamínula. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
Nota: Alternativamente, a solução de anticorpos primários pode ser incubada durante a noite a 4 ° c. Há muitos marcadores de adesão focal comuns que podem ser usados para a coloração de complexos de adesão e posterior análise de FA. Estes incluem anticorpos contra as seguintes proteínas: subunidades de integrina (β1, α5, ou αV), Talin, ou vinculin2. - Aspirar a solução de anticorpos e lavar cada lamínula com 500 μL de 1X PBS três vezes por 10 min cada. Proteja as amostras da luz deste ponto para a frente.
- Diluir a sonda de faloidina F-Actin conjugada ao corante fluorescente vermelho Alexa 594 (1:1000) e o anticorpo secundário fluorescente de cabra-anti-rato 488 (1:400) na mesma solução tampão de bloqueio. Misture bem e adicione 200 μL da solução de anticorpos a cada lamínula durante 30 min.
Nota: os anticorpos secundários conjugados fluorescently de outras espécies podem ser usados também. No entanto, o uso de anticorpos de outras espécies exigirá a modificação do soro tampão de bloqueio. - Aspirar a solução de anticorpos e lavar cada lamínula com 500 μL de 1X PBS três vezes por 10 min cada.
- Aspirar o 1X PBS e enxaguar uma vez com 500 μL de dIH2O.
- Monte as coberturas em lâminas de microscópio usando o meio de montagem antirdesvanecimento contendo DAPI.
- Deixe slides de microscópio para definir durante a noite no escuro à temperatura ambiente.
- Armazene as lâminas do microscópio no escuro em 4 ° c para o armazenamento a longo prazo e até a imagem latente.
Nota: imagem utilizando técnicas de imunofluorescência padrão. Recomenda-se usar uma lente objetiva de 60 x de imersão de óleo de alta potência para garantir uma resolução suficiente para observar as aderências focais e os babados periféricos nas bordas das células. Adquira imagens de 20-30 células em vários campos de visão para cada lamínula cada condição de tratamento e tempo. A partir de repetições combinadas, isso deve render pelo menos 60 células, a fim de realizar a análise estatística. Salvar e exportar imagens de fluorescência como um. TIFF com um mínimo de resolução de 300 dpi.
5. quantificando as fibras de estresse, circularidade celular, e formação de adesão focal
Nota: as análises de imagem a seguir são executadas usando a versão mais recente do pacote de processamento de imagens de código aberto Fiji is just Image J (Fiji), que pode ser baixado gratuitamente em (http://fiji.sc/).
- Processamento de imagem geral
Nota: todas as imagens precisarão ser preparadas para análises computacionais realizando as etapas 5.1.1-5.1.5 abaixo (Figura 2). Posteriormente, qualquer ou todos os procedimentos de quantificação subsequentes podem ser selecionados.- Abra o. Imagem de fluorescência TIFF usando Fiji. Verifique se as imagens são de 8 bits e escala de cinza.
- Selecione imagem-ajustar-janela/nível e selecione auto (Figura 2a).
- Selecione processo-subtrair fundo para subtrair a fluorescência de fundo. Verifique deslizando Paraboloid e selecione a opção de um raio de bola rolando de 50 pixels (Figura 2b).
Nota: para verificar o tamanho adequado para o raio da bola de rolamento, selecione a ferramenta de linha e desenhe um raio na maior aderência da imagem. Selecione Measure para verificar o comprimento da linha desenhada. Se o valor do raio for demasiado grande, as características que incluem aderências serão perdidas na imagem. Se o raio for muito pequeno, ele dará origem a artefatos na imagem processada devido ao ruído de fundo. - Selecione imagem-ajuste-brilho/contraste para verificar a intensidade da aderência sobre o fundo. Ajuste se necessário.
Observação: para otimizar o brilho/contraste e evitar saturar o sinal, use a ferramenta de pesquisa da imagem para examinar seu histograma para ajustar o brilho/contraste. - Selecione os seguintes parâmetros em analisar-definir medições: área, valor médio cinza, descritores de forma e densidade integrada.
- Análise de formação de fibras de stress
Nota: as fibras de stress podem ser quantificadas várias formas, dependendo do fenótipo.- Conte o número de células com fibras de tensão como uma porcentagem sobre o número total de células. Essa análise é melhor se houver diferenças visuais no número de fibras de estresse formadas diferentes condições experimentais.
- Conte o número de fibras de estresse que transvertem a célula. Esta análise permite a comparação do número de fibras de estresse formadas por célula.
- Medir a intensidade de fluorescência total dada pela coloração de faloidina (por exemplo, F-Actina) por célula17,18. Este método destacará aumentos/diminuições drásticas na intensidade da fluorescência devido à mancha de F-Actin.
- Defina os parâmetros de medição na etapa 5.1.5 acima.
- Selecione a ferramenta mão livre na barra de ferramentas de Fiji e Trace manualmente as células de interesse. Selecione analisar-medida. Uma nova janela aparecerá mostrando os parâmetros de medição selecionados.
- Selecione a ferramenta mão livre na barra de ferramentas de Fiji e Trace manualmente um espaço vazio sem células presentes. Selecione analisar-medida. Esta medida servirá como a fluorescência de fundo.
- Use a equação abaixo para determinar a fluorescência total de F-Actina por célula:
Nota: a medição resultante pode ser normalizada e comparada com outras células para dar fluorescência de F-Actina por célula.
- Análise de circularidade celular
Nota: informações sobre a área celular (um indicador de propagação celular ao longo do tempo), bem como, a circularidade também pode ser gravado. Esta medida é dada como uma relação entre 0 a 1 como uma maneira de quantificar as células que são alongadas para arredondar, respectivamente.- Selecione a ferramenta mão livre na barra de ferramentas Fiji e Trace uma célula individual. Selecione imagem-medida e registre a área da célula e as medições de perímetro para cada célula. Repita este procedimento para cada célula.
Nota: a função set medições , circularidade é fornecida como a medida descritores de forma (passo 5.1.5). - Conte manualmente as ruinas ou saliências enriquecidas com actina por célula, conforme representado na Figura 3 e na Figura 4.
- Selecione a ferramenta mão livre na barra de ferramentas Fiji e Trace uma célula individual. Selecione imagem-medida e registre a área da célula e as medições de perímetro para cada célula. Repita este procedimento para cada célula.
- Análise de aderência focal
Nota: antes de realizar a análise de aderência focal, instale o plugin mexicano Hat Filter na última versão do Fiji. O seguinte protocolo foi modificado a partir de estudos anteriores19,20,21.- Selecione processo-realce o contraste local (Clahe) usando um tamanho de bloco de 19, escaninhos do histograma 256, e uma inclinação máxima de 6, sem a máscara e não rápido. (Figura 2C)
- Selecione processo-filtros-Gaussian Blur com um Sigma (RADIUS) de 2,0 para filtrar a imagem (Figura 2D).
- Selecione plugins-Mexican Hat Filter (MHF) com um raio de 2,0 (Figura 2e).
- Execute o limiar e selecione fundo escuro e acima/abaixo usando Huang ou isodata como o método limiarização. Selecione limite automático.
Nota: esta etapa assegura-se de que as aderências estejam destacadas, mas igualmente distintas de uma outra. - Selecione analisar-analisar partículas com os seguintes parâmetros selecionados: Size = 20, pixels-Infinity e circularity = 0.00-0.99. Verific os contornos para assegurar a deteção e a separação apropriadas de aderências focais.
Nota: estes resultados produzem o número, a área, e a descrição da forma de aderências focais individuais.
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Representative Results
Um esquema geral da set-up experimental
A Figura 1 representa o esquema geral para a adesão da célula e o protocolo de espalhamento começando com a inanição sérica de células REF52 e terminando com a análise computacional de imagens de fluorescência adquiridas. As etapas principais no protocolo são ilustradas na linha do tempo. Da nota, a etapa 2 do protocolo descreve a preparação dos COVERSLIP FN-revestidos, que devem ser executados simultaneamente com etapa 3: pilhas REF52 de fome do soro antes de coloc as em suspensão (Figura 1a). Um exemplo de uma placa de 24 poços com rótulo simulado que indica grupos de tratamento e duração da adesão celular antes da fixação de amostras para microscopia de fluorescência (Figura 1b).
Processamento de imagens de imunofluorescência para quantificação da adesão focal
REF52 células foram mantidas em suspensão por 90 minutos, banhadas na FN, e autorizadas a aderir por 15 minutos adicionais. Após a fixação e a mancha com um anticorpo do anti-paxillin, as imagens de cinza de 8 bocados fluorescentes das pilhas foram adquiridas. A análise de processamento de imagem foi realizada de acordo com o protocolo delineado na etapa 5. São mostradas imagens representativas de cada etapa de processamento distinta, incluindo a imagem original (Figura 2a), e imagens após a subtração de fundo (bola pós-rolamento) (Figura 2b), Clahe (Figura 2C), Gaussian Blur ( Figura 2D) e filtro mexicano do chapéu (borne-MHF) (Figura 2e) que filtra etapas. Depois de completar todas as etapas de processamento de imagem, as aderências focais individuais devem ser proeminentes, em foco, e prontamente distinguíveis umas das outras (Figura 2e). Depois que as imagens são filtradas, as aderências focais podem ser quantificadas e sua área medida (etapas 5,1 e 5,4).
Visualização da adesão celular e disseminação da FN após estresse oxidativo
Uma imagem de fluorescência de escala de cinza representativa de anti-paxilina (marcador de adesão focal) (Figura 3, painel superior) e faloidina F-Actin sonda de coloração (Figura 3, painel inferior) de REF52 células após o chapeamento em FN com ou sem Ku55933 ( Tratamento de ROS-induzindo o agente). Antes do ensaio, as pilhas REF52 eram soro fome para 1 h. Após a fome sérica, as células foram mantidas em suspensão enquanto estavam sendo tratadas com o veículo isoladamente ou 10 μM Ku55933 para induzir estresse oxidativo. As pilhas foram chapeadas em COVERSLIP FN-coated para os tempos indicados, reparados, e manchados então com um anticorpo às aderências focais e ao faloidina para detectar proteínas do F-Actin. As adesões focais proeminentes e as fibras de esforço devem prontamente ser visíveis em REF52 pilhas após ter sido permitida aderir para 20-30 minutos em FN. as pilhas chapeadas não devem sobrepor um com o outro para permitir a propagação celular cheia após a adesão. Observe as bordas claras e distintas da célula, bem como o espaço para que as células individuais se espalhem (Figura 3). F-Actina enriquecido babados na borda principal das membranas celulares são visíveis e indicadas com uma seta (Figura 3, painel inferior).
Representação gráfica de imagens de fluorescência quantificadas de fibras de estresse e o grau de espalhamento celular
Exemplos de imagens quantificadas exibidas em forma de gráfico de barras representando a porcentagem de células com fibras de estresse e o grau de disseminação celular com e sem tratamento Ku55933 em vários momentos após a adesão. Imagens fluorescentes de sonda de faloidina F-Actin e coloração antipaxilina, semelhantes às imagens mostradas na Figura 3, foram analisadas quanto ao percentual de fibras de estresse e disseminação celular (i.e., índice de circularidade) utilizando os procedimentos de análise de imagem descrito na etapa 5 do protocolo. Notavelmente, o tratamento oxidante causou um aumento significativo na formação de fibras de estresse em todos os pontos de tempo de adesão examinados (figura 4a) e uma diminuição na propagação celular após 15 minutos de adesão celular à FN (Figura 4B).
Imagens de imunofluorescência não quantificáveis devido à confluência celular
As pilhas REF52 soro-Starved foram prendidos na suspensão por 90 minutos, durante que o tempo foram tratados com 10 μM Ku55933 para induzir a formação dos ROS. As pilhas foram chapeadas então em FN e permitidas aderir por 20 minutos, depois do qual foram fixadas e manchadas com a ponta de prova do anti-paxillin ou do Phalloidin-Alexa 594 F-Actin. O chapeamento em densidades de pilha mais elevadas conduz ao crowding celular, que proíbe pilhas de espalhar inteiramente devido à confluência excedente. As bordas da célula de aviso são indistinguíveis das células adjacentes (setas amarelas) (Figura 5a). Em conseqüência, a quantificação de pilhas individuais é impedida, e a circunferência de espalhamento não pode exatamente ser determinada. Na figura 5B, uma linha celular separada, fibroblastos embrionários do rato (MEF), foram mantidos em suspensão e, em seguida, banhado na FN por 30 minutos. As pilhas foram fixadas então e manchadas com um anticorpo do anti-paxillin. As células fora de foco são indicadas por setas vermelhas (Figura 5b). Além disso, a reatividade cruzada do anticorpo anti-paxilina com detritos celulares (seta azul) alterará a limiarização durante a análise quantitativa da imagem (parte 5) e não deve ser incluída na análise (Figura 5b).
Figura 1: tempo-linha do protocolo e exemplo 24-Set-up da placa do poço.
(A) o tempo-linha realça etapas chaves no procedimento da adesão e da propagação da pilha. (B) representante rotulado 24-Plate, ilustrando grupos de tratamento e horários de adesão celular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: exemplos de imagens de imunofluorescência representativas após processamento de imagem.
REF52 células foram mantidas em suspensão por 90 min, banhadas na FN, e autorizadas a aderir por 15 min. as células foram fixadas e coradas com um anticorpo antipaxilina. (A) imagem original e imagens seguintes (B) subtração de fundo (bola pós-rolamento), (C) clahe, (D) Gaussian Blur e (e) mexicano Hat Filter (post-MHF) etapas de filtragem. Bar, 20 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens representativas da imunofluorescência da sonda antipaxilina e faloidina F-Actin coradas REF52 células banhadas na FN.
Antes do ensaio, as pilhas REF52 eram soro fome para 1 h. Após a fome sérica, as células foram mantidas em suspensão enquanto tratadas com o veículo isoladamente ou 10 μM Ku55933 para causar estresse oxidativo. As pilhas foram chapeadas em COVERSLIP FN-coated para os tempos indicados, fixados e manchados com um anticorpo às aderências focais e ao faloidina para detectar proteínas do F-Actin. F-Actin enriquecido babados na borda principal das membranas celulares são indicados com uma seta. Bar, 40 μm. Este número foi modificado de Tolbert et al.5por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: quantificação das imagens de imunofluorescência.
Gráficos ilustrando (a) a percentagem de células que exibem fibras de tensão e (B) medições de circularidade celular. A circularidade celular foi definida como a área celular dividida pelo perímetro celular. Os valores variaram de 0-1,0 indicando uma morfologia alongada ou arredondada, respectivamente. As barras de erro indicam o teste tde Student m.e.v. para amostras pareadas * p < 0,01 de experimentos realizados em triplicado. Este número foi modificado de Tolbert et al.5por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imagens de imunofluorescência não quantificáveis.
(A) as células REF52 de soro-fome foram mantidas em suspensão por 90 min, enquanto tratadas com 10 μm Ku55933. As pilhas foram chapeadas no FN e permitidas aderir por 20 minutos. as pilhas foram fixas e manchadas com a ponta de prova do anti-paxillin ou do Phalloidin-Alexa 594 F-Actin. As bordas das células são mostradas por setas amarelas. (B) as células MEF foram mantidas em suspensão e, em seguida, BANHADAS na FN durante 30 min. as células foram fixadas e coradas com um anticorpo antipaxilina. As células fora de foco são indicadas por setas vermelhas e a reatividade cruzada do anticorpo antipaxilina com detritos celulares são indicadas com setas azuis. Bar, 30 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui é uma maneira versátil e econômica de tela ràpida uma série de tipos ancoragem-dependentes da pilha para o citoesqueleto dinâmico que remodela durante espalhar da pilha. Em particular, este método examina quantitativamente a fibra de estresse e a formação de adesão focal durante o estresse oxidativo quando as células aderem à FN (Figura 1a). Além disso, estes fenótipos celulares podem sugerir um papel regulamentar para membros da família de Rho de GTPases pequenos desde que têm papéis documentados durante o acessório da pilha e espalhar15,16,22. Entretanto, as técnicas bioquímicas adicionais seriam exigidas para identificar a participação possível de GTP-bound, proteínas ativas da família de Rho.
O protocolo apresentado utiliza a detecção da imunofluorescência de F-Actin e de paxilina para examinar especificamente a adesão e a propagação da pilha de pilhas imortalizado do fibroblasto no FN após o esforço oxidativo induzido pela inibição da quinase do ATM (Figura 2, Figura 3 e Figura 4). No entanto, este procedimento também pode ser adaptado para uso em outras proteínas de ECM e/ou para outros tipos de células aderentes. Ao se adaptar a outras linhas celulares, é importante otimizar as condições experimentais, particularmente: número de células/densidade, tempo de fome sérica, concentração protéica de ECM e condições de tratamento de estresse oxidativo. Ao testar os efeitos de um estímulo desconhecido sobre a adesão e a dinâmica de espalhamento, é necessário incluir amostras de controle negativas e positivas para verificar se o ensaio está funcionando corretamente. Amostras de controle negativo podem incluir uma amostra não tratada ou somente veicular, enquanto um controle positivo deve induzir estresse oxidativo (por exemplo, H2O2). Além disso, embora não discutido aqui, também é essencial para utilizar os controles de anticorpos adequados. Recomenda-se que três controles separados sejam usados para cada anticorpo para verificar sua especificidade e para identificar todo o sangramento potencial da fluorescência-através de23,24. Estes incluem: 1) um controle preliminar do anticorpo para assegurar a ligação específica do anticorpo preliminar ao antígeno e para confirmar que a ligação do antígeno ocorre as condições da fixação usadas, 2) um controle secundário do anticorpo (para conjugated-anticorpos não secundários ) que mostra especificidade para o anticorpo primário, e 3) controles de fluoróforo que asseguram que o fluoróforo adicionado não é o resultado de fluorescência endógena ou sangramento-através de outro anticorpo.
Quando este ensaio for útil para analisar os eventos cinéticos adiantados do conjunto e da propagação da adesão, não é apropriado para a examinação detalhada da força da desmontagem ou da adesão da adesão e do reforço celular. O último exige o uso de bio-estações da imagem latente a longo prazo ou de técnicas da espectroscopia da força da único-pilha. As últimas técnicas incluem microscopia de força atômica, pinças ópticas, sensores de tensão de proteínas de adesão, como a vinculação25 ou Talina26,27e microscopia de força 3D28.
As etapas críticas no protocolo incluem coberturas minuciosamente de revestimento com FN. Isto é necessário para o espalhamento uniforme e adesão das células. Portanto, é importante para pipetas a solução FN para cima e para baixo sobre as coberturas múltiplas vezes antes da incubação. As coberturas devem permanecer totalmente submersas na solução FN durante o tempo de incubação. Os COVERSLIP revestidos FN podem ser armazenados por até 2 semanas a 4 ° c.
A densidade da pilha é igualmente importante, porque as pilhas que são chapeadas demasiado densamente não alcançarão a circunferência de espalhamento máxima. Além disso, não seria possível distinguir aderências focais individuais ou babados celulares para cada célula individual. É, conseqüentemente, necessário contar as pilhas usando um hemocitômetro ou um contador automatizado da pilha antes de coloc as pilhas na suspensão. Enquanto uma estimativa da densidade celular é fornecida para células REF52, isso terá de ser empiricamente determinado para outras células em estudo. As células devem ser banhadas de forma escassa o suficiente para que poucas células se sobreponham, permitindo que elas se espalhem totalmente (Figura 5).
Outras etapas críticas no protocolo a considerar são cDNAs conjugado Phalloidin-Alexa 594 F-Actin sonda e anticorpos secundários são sensíveis à luz. Portanto, as amostras devem ser minimamente expostas à luz após a aplicação destes reagentes. Além disso, um número de agentes que induzem o stress oxidativo tem meias-vidas curtas. É, portanto, necessário para testar o oxidante escolhido para a dose ideal e tempo de exposição para atingir a atividade de pico.
As seções a seguir contêm dicas de problemas de disparo com relação à concentração de FN, condições de inanição sérica e metodologias de descolamento de células. Estas pontas são úteis ao adaptar o protocolo para outras linhas das pilhas e/ou condições do tratamento.
Para a análise consistente do FA, o acessório óptimo e as condições de espalhamento são necessários, que variarão dependendo do ligand do ECM. Para FN, comece a utilizar um intervalo dinâmico de 10-30 μg/mL. Em concentrações mais elevadas de FN, há pouca diferença no acessório da pilha. No entanto, alguns tipos de células não se espalham eficientemente em concentrações mais elevadas de ECM.
Cada tipo de célula responde de forma diferente às condições de fome sérica. REF52 células podem ser facilmente faminta durante a noite sem qualquer perda de viabilidade, no entanto, isso não é verdade para todas as linhas celulares. Portanto, é necessário determinar o grau em que a linha celular em estudo pode resistir à fome sérica.
Para a propagação de ensaios, as células precisam ser tripsinizadas por tão pouco tempo quanto possível para resultados reprodutíveis29. Após o destacamento de células por trypsinization, receptores de superfície celular, seus ligantes cognatos e atividade de Rho GTPase requerem um período de recuperação para retornar aos níveis de estado estacionário14,15. O procedimento de tripsinização descrito neste protocolo deve permitir que as células mantenham a maioria de seus receptores de ligação FN de superfície celular29. Entretanto, determinados tipos da pilha podem exigir métodos alternativos do destacamento da pilha para impedir completamente a digestão de receptores de superfície da pilha. Esses métodos incluem células quelantes usando soluções baseadas em EDTA (por exemplo, Versene) ou soluções de dissociação enzimática mais suaves (por exemplo, Accutase). O uso destas soluções da dissociação pode deixar as adesões da pilha-pilha intactas tendo por resultado grupos da pilha. Portanto, é importante resuspender completamente as células individuais para garantir a reprodutibilidade experimental.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos Drs. Scott R. Hutton e Meghan S. Blackledge pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela High Point University ' s Research and patrocinado Programs (MCS) e o programa de biotecnologia da North Carolina State University (MCS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
References
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