Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Undersøge dynamikken i cellulære vedhæftning og spredning af Epiteliale celler på Fibronectin under oxidativ stress

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/59989
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Chemistry, High Point University, 3Biotechnology Program and the Department of Molecular Biomedical Sciences, North Carolina State University

Summary

Denne metode er nyttig til at kvantificere den tidlige dynamik i cellulær vedhæftning og spredning af forankring-afhængige celler på fibronectin. Desuden kan denne analyse anvendes til at undersøge virkningerne af ændret redox homeostase på celle spredning og/eller celle vedhæftning-relaterede intracellulære signalering veje.

Abstract

Adhæsion og spredning af celler til den ekstracellulære matrix (ECM) er essentielle cellulære processer under organismal udvikling og til homeostase af voksent væv. Interessant, oxidativ stress kan ændre disse processer, og dermed bidrage til Patofysiologi af sygdomme som metastatisk kræft. Derfor forståelse mekanismen (r) af, hvordan cellerne vedhæfte og sprede på ECM under forstyrrelser i redox status kan give indsigt i normale og sygdomstilstande. Beskrevet nedenfor er en Step-Wise protokol, der udnytter en immunofluorescens-baseret assay til specifikt kvantificere celle vedhæftning og spredning af udødeliggjort fibroblast celler på fibronektin (FN) in vitro. Kort, forankrings-afhængige celler holdes i suspension og udsat for ATM kinase-hæmmer Ku55933 at fremkalde oxidativt stress. Cellerne er derefter belagt på FN-belagt overflade og lov til at vedhæfte i forudbestemte perioder. De celler, der forbliver fastgjort, er faste og mærket med fluorescens baserede antistof markører for adhæsion (f. eks. paxillin) og spreder sig (f. eks. F-actin). Data opsamling og-analyse udføres ved hjælp af almindeligt tilgængeligt laboratorieudstyr, herunder et epifluorescens mikroskop og frit tilgængeligt Fiji-software. Denne procedure er meget alsidig og kan ændres for en række forskellige cellelinjer, ECM proteiner, eller hæmmere for at undersøge en bred vifte af biologiske spørgsmål.

Introduction

Celle-matrix sammenvoksninger (dvs. fokale sammenvoksninger) er store og dynamiske multimolecular protein komplekser, som mægle celle vedhæftning og spredning. Disse processer er afgørende for vævs udvikling, vedligeholdelse og fysiologiske funktion. Fokale sammenvoksninger er sammensat af membran-bundne receptorer, såsom integriner, samt stilladser proteiner, der forbinder cytoskelet actin til den ekstracellulære matrix (ECM)1. Disse komplekser er i stand til at reagere på fysisk-kemiske signaler til stede i det ekstracellulære miljø gennem aktivering af forskellige signalering transduktionsveje. Som sådan, fokale sammenvoksninger tjene som signalering centre til at udbrede ekstracellulære mekaniske signaler i en række cellulære processer, herunder instrueret migration, celle cyklus regulering, differentiering, og overlevelse1,2. En gruppe af signalering molekyler, der regulerer og interagerer med fokale sammenvoksninger omfatter medlemmer af Rho familien af små GTPases. Rho GTPases er nøgle proteiner, der regulerer celle migration og vedhæftnings dynamik gennem deres specifikke spatiotemporale aktivering3. Ikke overraskende, dysregulering af Rho protein funktion har været impliceret i en række menneskelige patologier såsom metastase, angiogenese, og andre. Af særlig interesse, cellulære redox status spiller en fremtrædende rolle i modulering af celle migration og vedhæftning. Ændringer i redox homøostase, såsom stigninger i reaktive oxygenarter (ros), er blevet påvist at regulere Rho protein aktivitet, samt vedhæftning, i en række celletyper og sygdomme hos mennesker4,5,6 ,7,8. For eksempel, personer, der lider af den neurologiske lidelse Ataxia-telangiectasia (A-T), som er forårsaget af en mutation i DNA-skade reparation Serin/threonine kinase A-T-muteret (ATM), har en øget risiko for metastatisk kræft9, 10. Tab af ATM kinaseaktivitet hos disse patienter og cellelinjer, enten gennem genetisk mutation eller kemisk hæmning, resulterer i høje niveauer af oxidativ stress på grund af dysfunktion af pentose fosfat pathway7,11, 12. Desuden har nylige undersøgelser fra laboratoriet fremhævet en patofysiologisk rolle for ROS i A-T ved at ændre cytoskelet dynamik (dvs. vedhæftning og spredning) som et direkte resultat af aktivering af Rho Family GTPases in vitro5. Isidste ende kan disse ændringer i cytoskelet dynamik forårsaget af Rho familie aktivering føre til den øgede risiko for metastatisk kræft konstateret i A-T patienter5,13. Derfor kan forståelse af samspillet mellem celle-matrix interaktioner under oxidativ stress give indsigt i reguleringen af vedhæftning og spredning. Disse undersøgelser kan også sætte scenen for yderligere undersøgelser af en mulig rolle for Rho Family GTPases i disse signalerings processer.

Beskrevet heri er en protokol til at studere den tidlige cellulære dynamik af vedhæftning samling og spredning under oxidativ stress forårsaget af hæmning af ATM kinase aktivitet. Denne analyse er baseret på den velkarakteriserede mekanisme af forankring-afhængige celler vedhæftning til ECM protein fibronektin (FN). Når celler opretholdes i suspension er belagt på FN, flere Rho gtpases koordinere kontrol af actin cytoskelet remodeling3,14. Morfologiske ændringer observeres som celler skifte fra runde og cirkulære i udseende til fladtrykt og ekspanderet. Samtidig med disse observationer er udviklingen af talrige matrix sammenvoksninger med ECM. Disse ændringer tilskrives bifasisk aktivering af rhoa med Rac1 i løbet af den første time, da cellerne klæber og spredes 15,16.

En række forskellige metoder er blevet udnyttet til at undersøge vedhæftnings morfologi og dynamik samt celle spredning. Men disse metoder er afhængige af sofistikerede langsigtede, Live-imaging samlede interne refleksion fluorescens (TIRF) eller confokale mikroskopi systemer. Således, brugere skal have adgang til specialiseret udstyr og software. Desuden gør den opsatte tid, der kræves af disse Bio-Imaging systemer, indfangning af tidlige vedhæftnings hændelser udfordrende, især ved testning af flere hæmmere eller behandlingsbetingelser samtidig.

Metoderne detaljeret, heri, giver en enkel, økonomisk, men alligevel kvantitativ måde at vurdere parametre, der regulerer vedhæftnings samlingen og sprede in vitro. Protokollen udføres ved hjælp af almindeligt tilgængelige laboratorieudstyr, såsom et epifluorescens mikroskop og CCD-kamera. Denne analyse omfatter anvendelse af forankrings afhængige celler på en FN-belagt overflade efter en periode med oxidativt stress forårsaget af kemisk hæmning af ATM kinaseaktivitet, hvilket tidligere er påvist5. Efter plating, er cellerne tilladt at vedhæfte og overholde specificerede længder af tid. Ikke-tilsluttede celler vaskes væk, mens tilknyttede celler er faste og mærket med fluorescens baserede antistoffer til markører for adhæsion (f. eks. paxillin) og breder sig (f.eks. f-actin)2,5. Disse proteiner visualiseres og registreres derefter ved hjælp af et epifluorescens mikroskop. Efterfølgende dataanalyse udføres ved hjælp af frit tilgængelige Fiji software. Desuden kan denne metode tilpasses til at undersøge vedhæftnings dynamik under en lang række betingelser, herunder forskellige ECM-proteiner, behandling med forskellige oxidanter/celle dyrkningsbetingelser eller en række forankrings afhængige cellelinjer for at løse en bred vifte af biologiske spørgsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. præparater

Bemærk: den protokol, der er beskrevet nedenfor, er optimeret til brug med REF52-celler og ATM+/+ eller ATM-/- humane fibroblaster. Andre celletyper kan kræve yderligere optimering som beskrevet i afsnittene noter og fejlfinding nedenfor.

  1. Lav 500 mL komplet cellekulturmedium for REF52 celler. Til 500 mL højt glucose indeholdende Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) tilsættes 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 100 enheder/mL penicillin-streptomycin.
  2. Der forberedes en 25 μg/ml opløsning af fibronektin (FN) ved tilsætning af 300 μl 1 mg/ml FN-opløsning til 12 ml steril 1x fosfat bufferet saltvand (PBS), pH 7,4. Bland godt.
  3. Forbered en 0,5% (w/v) delipidateret (dvs. fedtsyrefri) bovin serumalbumin (dlBSA) opløsning i serum fri DMEM cellekulturmedium. Tilsæt 0,5 g dlBSA til 100 mL serumfrit DMEM medium. Bland opløsningen godt, men ikke vortex. Steril Filtrer opløsningen til en ny steril beholder ved hjælp af et 0,22 μM sprøjte filter før brug. Opbevares ved 4 °C.
  4. Lav 3,7% PARAFORMALDEHYD opløsning ved at opløse 3,7 g PARAFORMALDEHYD i 100 mL 1x PBS. Brug blid varme og omrøring for at få PARAFORMALDEHYD i opløsning.
    Bemærk: PARAFORMALDEHYD opløsningen er lysfølsom og bør beskyttes mod lys. Det er godt i op til en uge, når de opbevares ved 4 °C.
    Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftigt, brandfarligt, ætsende og en sundhedsrisiko. Gennemgå materiale sikkerhedsdatabladet for PARAFORMALDEHYD før brug. Brug de relevante personlige værnemidler, når du håndterer dem, herunder øjen skjold, ansigts skjold, partikel respirator med fuld ansigt, handsker og laboratorie belægning.
  5. Forbered permeabiliserings opløsningen, der indeholder 0,2% ikke-ionisk overfladeaktivt stof i 1x PBS (v/v). For 100 mL tilsættes langsomt 0,2 mL Triton X-100 til 100 mL 1x PBS under omrøring.
  6. Lav immunofluorescens blokerende buffer, der indeholder 2,5% BSA, 5% gede serum og 0,05% ikke-ionisk overfladeaktivt stof (w/v/v) opløst i 1x PBS-opløsning. For 100 mL tilsættes 5 mL gede serum, 2,5 g BSA og 0,05 mL Triton X-100 i ~ 95 mL 1x PBS, under omrøring.
  7. Vokse REF52 celler i DMEM komplet kulturmedium i en 10 cm2 (eller enhver anden beholderstørrelse) cellekultur-behandlet plade i en cellekultur inkubator ved 37 °c og 5% Co2.

2. belægning cellekultur plader med ekstracellulær matrix protein fibronektin

Bemærk: Udfør dette afsnit ved hjælp af aseptisk teknik og sterile reagenser i en BSL-2 certificeret laminar flow hætte. Se figur 1a for at få en oversigt over de vigtigste trin før starten.

  1. Ved hjælp af en vævskultur certificeret 24-brønd plade, Placer en glas dækseddel (12-CIR-1) i hver brønd. Mærk pladen i henhold til figur 1b.
  2. Der afpipetteres 500 μL af 25 μg/mL FN-opløsningen til hver brønd på en 24-brønd plade.
  3. Afpipettér opløsningen over hver dækseddel et par gange for at sikre en jævn belægning og fuldstændig nedsænkning. Anbring låget på pladen igen.
  4. Pladen i en cellekultur inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i 1 time.
    Bemærk: du kan også inkubere natten over ved 4 °C.
  5. Efter 1 time fjernes pladen fra inkubator og aspirerer FN-opløsningen fra brøndene.
  6. Vask brønde tre gange med 500 μL 1x PBS. Aspirer den endelige vask af 1x PBS.
  7. Blok brønde med 500 μL 0,5% dlBSA opløsning i mindst 15 min ved 37 °C og 5% CO2.
  8. Du skal aspirere dlBSA-opløsningen forud for plating celler i trin 3 nedenfor.
    Bemærk: hvis pladerne opbevares, tilsættes 500 μL 1x PBS til hver dækseddel efter aspiration af dlBSA-opløsningen. Pladerne kan derefter opbevares ved 4 °C i op til en uge.

3. klargøring af forankrings afhængige celler til vedhæftnings analysen

Bemærk: Udfør dette afsnit ved hjælp af aseptisk teknik og sterile reagenser i en BSL-2 certificeret laminar flow hætte.

  1. Mindst 30 min før celle plating, pre-Warm følgende opløsninger: DMEM komplet medium, dlBSA opløsning, 1x PBS, 0,5% trypsin-EDTA opløsning, og trypsin neutraliserende serum (TNS) i en 37 °C vandbad.
  2. Begyndende med en konflydende enkeltlags af REF52 celler i en 10 cm2 skål, vaske celler to gange med 6 ml varm 1x PBS. Serum udsulter cellerne i mindst 1 time (afhængig af celletype) i 6 mL varm dlBSA-opløsning ved 37 °C og 5% CO2.
  3. Vask cellerne med 6 mL opvarmet 1x PBS, aspirere PBS og tilsæt 1,5 mL varm 0,5% trypsin-EDTA opløsning.
  4. Placer cellerne i en celle kulturinkubator ved 37 °C og 5% CO2 i ~ 2 min.
  5. Observere celler under et let mikroskop for at sikre, at løsrivelse er færdig. Hvis cellerne stadig er klæbridige efter at have tappe pladen på bænken, skal du vende tilbage til 37 °C inkubator i yderligere 2 min. Trypsinere cellerne i så lidt tid, som det er nødvendigt.
  6. 1,5 mL varm trypsin neutraliserende opløsning (TNS) afpipetteres til skålen for at stoppe trypsinisering og indsamle løsrevne celler. Afpipettér opløsningen op og ned over bunden af pladen adskillige gange for at fjerne alle resterende vedblivende celler. Hvis cellerne vises clumpy, yderligere udriv cellesuspensionen ved forsigtigt pipettering op og ned over bagsiden af skålen.
  7. Tæl celler ved hjælp af trypan og et blå udelukkelse og et hemocytometer under et let mikroskop. Alternativt kan du bruge en automatiseret celle tæller.
  8. Fjern en passende mængde celler for at oprette en 1,0-3,0 x 104 celler/ml cellesuspension i 5 ml dlbsa i et 15 ml konisk rør.
  9. Centrifuge celler ved ~ 300 x g i 5 minutter ved hjælp af en fast vinkel rotor i en tabel-top centrifuge.
  10. Aspirér supernatanten fra celle pellet, og resuspender cellerne i alt 7 mL varm dlBSA-opløsning. Lad ikke cellerne være alt for flydende på dækglas plating, men jævnt fordelt med få celler, der rører hinanden.
  11. Opdel cellesuspensionen jævnt i 2 15 mL koniske rør, en til køretøjets alene kontrol (DMSO) og en til Ku55933 (ATM kinasehæmmer, oxidant)5. Sørg for, at hvert rør indeholder 3,5 mL af cellesuspensionen.
  12. Ved hjælp af en rørrotator drejes rørene ved 37 °C i 90-120 min i en cellekultur inkubator.
  13. 30 min før plating tilsættes en endelig koncentration på 10 μM Ku55933 og DMSO (1:1000) til hver af de respektive rør. Placer cellesuspensionen tilbage på rotator for den resterende tid.
  14. Umiddelbart før de celler, skal du hente 24-brønden fra inkubator og aspirere dlBSA opløsning.
  15. Efter drejning af cellesuspensionen i 90-120 min., fjernes 500 μL af cellesuspensionen fra hver behandlingsgruppe og tilsættes til en FN-belagt dækseddel i 24-brønd pladen fra trin 2 som illustreret (figur 1b). Pladen returneres til 37 °C og 5% CO2 celle kulturinkubator og cellesuspensionen tilbage til rotationen.
  16. Efter plating cellesuspensionen på FN dækket-dæksedler, tillade celler at overholde den ønskede længde af tid (f. eks 10 min, 15 min, 20 min, 30 min) og derefter straks gå videre til trin 4.

4. celle fiksering og antistof farvning for immunofluorescens

Bemærk: følgende trin udføres under ikke-sterile forhold og ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

  1. Efter den ønskede tid for vedhæftning er passeret, aspirere celle opløsningen fra hver dækseddel i pladen.
  2. Brug siderne af brønden til forsigtigt at dispensere 500 μL 3,7% PARAFORMALDEHYD opløsning på hver dækseddel og vente 10-15 min.
  3. Fjern PARAFORMALDEHYD opløsningen og vask hver dækseddel med 500 μL 1x PBS i alt to gange.
    Bemærk: Bortskaf PARAFORMALDEHYD affald ansvarligt i henhold til instituttets miljø sundheds-og sikkerhedsplan.
  4. Du aspirerer PBS, og permeabiliserer cellerne på hver dækseddel med 500 μL 0,2% Triton X-100 i 1x PBS (v/v) for 10-15 min ved stuetemperatur.
  5. Vask hver dækseddel med 500 μL 1x PBS tre gange.
  6. Bloker celler på hver dækseddel med 500 μL immunofluorescens blokerende buffer, der indeholder 5% gede serum, 2,5% BSA og 0,05% Triton X-100 opløst i en 1 X PBS-opløsning i 30-60 minutter.
  7. Det primære anti-paxillin antistof (1:250) fortyndes i blokerende buffer. Bland godt, og tilsæt 200 μL af antistof opløsningen til hver dækseddel. Inkuber ved stuetemperatur i mindst 1 time.
    Bemærk: Alternativt kan den primære antistof opløsning inkuberet natten over ved 4 °C. Der er mange almindeligt fokale vedhæftnings markører, der kan anvendes til farvning af vedhæftnings komplekser og efterfølgende ANLÆGS analyse. Disse omfatter antistoffer mod følgende proteiner: anti under enheder (β1, Α5 eller αv), Talin eller vinculin2.
  8. Aspirer antistof opløsningen, og vask hver dækseddel med 500 μL 1x PBS tre gange i hver 10 min. Beskyt prøverne mod lys fra dette punkt fremad.
  9. Phalloidin F-actin-sonden konjugeres til den røde fluorescerende Alexa 594 Dye (1:1000) og ged-anti Mouse 488 fluorescerende sekundært antistof (1:400) i samme blokerende bufferopløsning. Bland godt og tilsæt 200 μL af antistof opløsningen til hver dækseddel i 30 minutter.
    Bemærk: Fluorescently konjugerede sekundære antistoffer fra andre arter kan også anvendes. Anvendelse af antistoffer fra andre arter vil dog kræve modifikation af blokerende buffer serum.
  10. Aspirer antistof opløsningen, og vask hver dækseddel med 500 μL 1x PBS tre gange i hver 10 min.
  11. Sug 1x PBS og skyl én gang med 500 μL dIH2O.
  12. Monter coverglider på mikroskop slides ved hjælp af anti-fade monterings medium, der indeholder DAPI.
  13. Efterlad mikroskop slides til at sætte natten over i mørket ved stuetemperatur.
  14. Opbevar mikroskop glider i mørke ved 4 °C for langtidsopbevaring og indtil billeddannelse.
    Bemærk: billede ved hjælp af standard immunofluorescens teknikker. Det anbefales at bruge en høj-drevne olie nedsænkning 60x objektiv linse for at sikre nok opløsning til at notere fokale adhæsioner og perifere flæser på cellekanter. Erhverve billeder af 20-30 celler i flere synsfelter for hver dækglas under hver behandlingstilstand og tid. Fra kombinerede replikater bør dette give mindst 60 celler for at udføre statistisk analyse. Gem og Eksporter fluorescensbilleder som en. TIFF-fil med mindst 300 dpi opløsning.

5. kvantificering af stress fibre, celle cirkularitet og fokale vedhæftnings dannelse

Bemærk: de følgende billedanalyser udføres ved hjælp af den nyeste version af open source Imaging-behandlingspakken Fiji er bare billede J (Fiji), som kan downloades gratis på (http://fiji.sc/).

  1. Generel billedbehandling
    Bemærk: alle billeder skal forberedes til beregningsmæssige analyser ved at udføre trin 5.1.1-5.1.5 nedenfor (figur 2). Derefter kan alle efterfølgende kvantificerings procedurer vælges.
    1. Åbn. TIFF fluorescens billede ved hjælp af Fiji. Sørg for, at billederne er 8-bit og gråtoner.
    2. Vælg billede-Juster-vindue/niveau , og vælg Auto (figur 2a).
    3. Vælg proces-fratræk baggrund for at trække baggrunden fluorescens. Kontroller glidende Paraboloid og vælg muligheden for en rullende kugle radius på 50 pixels (figur 2b).
      Bemærk: for at kontrollere den korrekte størrelse for den rullende kugle radius skal du vælge linje værktøjet og tegne en radius på den største vedhæftning i billedet. Vælg mål for at kontrollere længden af den tegnede linje. Hvis værdien af radius er for stor, vil funktioner, herunder sammenvoksninger, gå tabt i billedet. Hvis radius er for lille, vil det give anledning til artefakter i det forarbejdede billede på grund af baggrundsstøj.
    4. Vælg billede-Juster-lysstyrke/kontrast for at kontrollere intensiteten af vedhæftningen over baggrunden. Justér om nødvendigt.
      Bemærk: for at optimere lysstyrken/kontrasten og undgå at mættet signalet skal du bruge opslagsværktøjet i billedet til at undersøge dets histogram for at justere lysstyrken/kontrasten.
    5. Vælg følgende parametre under analyser-Angiv mål: område, gennemsnitlig grå værdi, figur beskrivelser og integreret tæthed.
  2. Analyse af stress fiber dannelse
    Bemærk: stress fibre kan kvantificeres flere måder afhængigt af fænotype.
    1. Tæl antallet af celler med stress fibre som en procentdel over det samlede antal celler. Denne analyse er bedst, hvis der er visuelle forskelle i antallet af stress fibre dannet under forskellige eksperimentelle betingelser.
    2. Tæl antallet af stress fibre, der omvers cellen. Denne analyse giver mulighed for sammenligning af antallet af stress fibre dannet pr celle.
    3. Måle den totale fluorescens intensitet givet ved phalloidin (f. eks. f-actin) farvning pr. celle17,18. Denne metode vil fremhæve drastiske stigninger/fald i fluorescens intensitet på grund af F-actin farvning.
      1. Indstil måle parametrene i trin 5.1.5 ovenfor.
      2. Vælg frihånds værktøjet på Fiji-værktøjslinjen, og spor manuelt de (t) celle (r), du er interesseret i. Vælg Analysér-mål. Der vises et nyt vindue, der viser de valgte målings parametre.
      3. Vælg frihånds værktøjet på Fiji-værktøjslinjen, og spor manuelt en tom plads uden celler til stede. Vælg Analysér-mål. Denne måling vil tjene som baggrund fluorescens.
      4. Brug ligningen nedenfor til at bestemme den totale F-actin fluorescens pr. celle:
        Equation 1
        Bemærk: den resulterende måling kan normaliseres og sammenlignes med andre celler for at give F-actin fluorescens pr. celle.
  3. Analyse af celle cirkularitet
    Bemærk: oplysninger om celleområde (en indikator for celle spredning over tid), samt, cirkularitet kan også registreres. Denne måling gives som et forhold mellem 0 og 1 som en måde at kvantificere celler, der er aflange til runde, hhv.
    1. Vælg frihånds værktøjet på Fiji-værktøjslinjen, og spor en enkelt celle. Vælg billede-mål og Optag celleområdet og perimeter målingerne for hver celle. Gentag denne procedure for hver celle.
      Bemærk: under funktionen set-målinger angives cirkularitet som måling af form deskriptorer (trin 5.1.5).
    2. Manuelt tælle actin-beriget eller fremspring per celle som afbildet i figur 3 og figur 4.
  4. Fokal vedhæftnings analyse
    Bemærk: før du udfører fokal vedhæftnings analyse, Installer den mexicanske hat filter plugin på den nyeste version af Fiji. Følgende protokol er blevet ændret fra tidligere undersøgelser19,20,21.
    1. Vælg proces-forbedre lokale kontrast (Clahe) ved hjælp af en blokstørrelse på 19, histogram bins 256, og en maksimal hældning på 6, uden maske og ikke hurtigt. (Figur 2c)
    2. Vælg proces filtre-Gaussisk sløring med en Sigma (radius) på 2,0 for at filtrere billedet (figur 2D).
    3. Vælg plugins-Mexican Hat filter (MHF) med en Radius på 2,0 (figur 2E).
    4. Kør tærskel og vælg mørk baggrund og over/under ved hjælp af enten Huang eller isodata som tærskel metode. Vælg automatisk tærskel.
      Bemærk: dette trin sikrer, at adhæsioner fremhæves, men også adskiller sig fra hinanden.
    5. Vælg Analysér-Analysér partikler med følgende parametre valgt: Size = 20, pixels-Infinity og cirkularitet = 0.00-0,99. Kontroller konturerne for at sikre korrekt detektering og adskillelse af fokale sammenvoksninger.
      Bemærk: disse resultater giver tal, område og form beskrivelse af individuelle fokale sammenvoksninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et generelt skema for den eksperimentelle opsætning

Figur 1 repræsenterer det generelle skema for celle vedhæftnings-og sprednings protokollen begyndende med serum-sult af REF52 celler og slutter med beregningsmæssige analyse af erhvervede fluorescensbilleder. De vigtigste trin i protokollen er illustreret på tidslinjen. Bemærk, at trin 2 i protokollen beskriver forberedelsen af de FN-belagte dæksedler, som skal udføres samtidig med trin 3: serum sultende REF52 celler, før de anbringes i suspension (figur 1a). Et eksempel på en mock-mærket 24-brønd plade, der indikerer behandlingsgrupper og varigheden af celle adhæsion forud for fiksering af prøver til fluorescens mikroskopi (figur 1b).

Immunofluorescens billedbehandling til kvantificering af fokale adhæsion

REF52 celler blev holdt i suspension i 90 minutter, belagt på FN, og lov til at holde sig til yderligere 15 minutter. Efter fiksering og farvning med et anti-paxillin antistof blev der erhvervet fluorescerende 8-bit gråtonebilleder af cellerne. Analyse af billedbehandling blev udført i henhold til den protokol, der blev afgrænset i trin 5. Vist er repræsentative billeder af hvert enkelt behandlingstrin, herunder det originale billede (figur 2a), og billeder efter subtraktion af baggrund (efter rullende kugle) (figur 2b), Clahe (figur 2C), Gaussisk sløring ( Fig. 2D) og mexicansk hat filter (post-MHF) (figur 2E) filtreringstrin. Efter at have afsluttet alle billedbehandlings trin skal individuelle fokale sammenvoksninger være fremtrædende, i fokus og let skelne fra hinanden (figur 2E). Når billederne er filtreret, kan fokale sammenvoksninger kvantificeres og deres areal måles (trin 5,1 og 5,4).

Visualisering af celle vedhæftning og spredning på FN efter oxidativ stress

Et repræsentativt fluorescens billede af anti-paxillin (fokal vedhæftnings markør) (figur 3, toppanel) og phalloidin F-actin-sonde farvning (figur 3, bundpanel) af REF52 celler efter plating på FN med eller uden Ku55933 ( ROS-inducerende middel) behandling. Forud for analysen, REF52 celler var serum sultet for 1 h. Efter serum sult blev cellerne holdt i suspension, mens de blev behandlet med enten køretøjet alene eller 10 μM Ku55933 for at fremkalde oxidativt stress. Celler blev belagt på FN-belagte dæksedler for de angivne tidspunkter, fast, og derefter farvet med et antistof til fokale adhæsioner og phalloidin til at detektere F-actin proteiner. Fremtrædende fokale sammenvoksninger og stress fibre bør være let synlige i REF52 celler efter at have fået lov til at holde sig til 20-30 min på FN. belagte celler bør ikke overlappe hinanden for at tillade fuld cellulær spredning efter vedhæftning. Bemærk de klare, særskilte cellekanter samt plads til individuelle celler til at sprede sig (figur 3). F-actin beriget flæser på forkant med cellemembraner er synlige og indikeret med en pil (figur 3, bundpanel).

Grafisk gengivelse af kvantificerede fluorescensbilleder af stress fibre og graden af celle spredning

Eksempler på kvantificerede billeder, der vises i søjlediagram form, som repræsenterer procentdelen af celler med stress fibre og graden af celle spredning med og uden Ku55933 behandling på forskellige tidspunkter efter adhæsion. Fluorescerende billeder af phalloidin F-actin Probe og anti-paxillin farvning, svarende til billeder vist i figur 3, blev analyseret for procentdelen af stress fibre og celle spredning (dvs. cirkularitet index) ved hjælp af billedanalyse procedurer beskrevet i trin 5 i protokollen. Især oxidant behandling forårsagede en signifikant stigning i stress fiber dannelse ved alle adhæsion tidspunkter undersøgt (figur 4a) og et fald i celle spredning efter 15 minutters celle VEDHÆFTNING til FN (figur 4b).

Ikke-kvantificerbare immunofluorescens billeder på grund af cellulær over konfluency

Serum-sultede REF52 celler blev holdt i suspension i 90 minutter, i hvilket tidsrum de blev behandlet med 10 μM Ku55933 at inducere ROS dannelse. Celler blev derefter belagt på FN og lov til at holde sig i 20 minutter, hvorefter de blev fastsat og plettet med anti-paxillin eller phalloidin-Alexa 594 F-actin sonde. Plating ved højere celle tætheder fører til cellulære fortrængning, som forbyder celler fra fuldt ud at sprede på grund af over konfluency. Bemærk cellekanter skelnes fra tilstødende celler (gule pile) (figur 5a). Som følge heraf er kvantificering af individuelle celler udelukket, og spredning af omkredsen kan ikke bestemmes nøjagtigt. I figur 5B, en separat cellelinje, mus embryonale fibroblaster (MEF), blev holdt i suspension og derefter belagt på FN i 30 minutter. Cellerne blev derefter fikseret og plettet med et anti-paxillin antistof. Ud af fokus celler er angivet med røde pile (figur 5b). Endvidere vil Krydsreaktiviteten af anti-paxillin-antistoffer med cellulær snavs (blå pil) ændre tærskel værdien under kvantitativ billedanalyse (del 5) og bør ikke indgå i analysen (figur 5b).

Figure 1
Figur 1: tidslinje for protokol og eksempel 24-brønd plade set-up.
A) tidslinjen fremhæver de vigtigste trin i proceduren for celle vedhæftning og-spredning. B) repræsentativ mærket 24-plade, som illustrerer behandlingsgrupper og tidspunkter for celle vedhæftning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: eksempler på repræsentative immunofluorescens billeder efter billedbehandling.
REF52 celler blev holdt i suspension til 90 min, belagt på FN, og lov til at holde sig til 15 min. cellerne blev fikseret og plettet med et anti-paxillin antistof. (A) originalt billede og billeder efter (B) baggrunds subtraktion (efter rullende kugle), (C) clahe, (D) Gaussisk sløring og (E) filtreringstrin for mexicansk hat filter (post-MHF). Bar, 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentative immunofluorescens billeder af anti-paxillin og phalloidin F-actin Probe plettet REF52 celler belagt på FN.
Forud for analysen, REF52 celler var serum sultet for 1 h. Efter serum sult blev cellerne holdt i suspension, mens de blev behandlet med enten køretøjet alene eller 10 μM Ku55933 for at forårsage oxidativ stress. Celler blev belagt på FN-belagte dæksedler for de angivne tidspunkter, fast og plettet med et antistof til fokale adhæsioner og phalloidin til at detektere F-actin proteiner. F-actin beriget flæser i den førende kant af cellemembraner er indikeret med en pil. Bar, 40 μm. Dette tal er blevet ændret fra Tolbert et al.5venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: kvantificering af immunofluorescens billeder.
Grafer, der illustrerer (A) procentdelen af celler, der udviser stress fibre og (B) målinger af celle cirkularitet. Celle cirkularitet blev defineret som celleområdet divideret med cellens omkreds. Værdierne varierede fra 0-1,0, hvilket indikerer henholdsvis en aflang eller afrundet morfologi. Fejllinjer indikerer S.E.M. studerendes t-test for parrede prøver * p < 0,01 fra eksperimenter udført i tre eksemplarer. Dette tal er blevet ændret fra Tolbert et al.5venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: ikke-kvantificerbare immunofluorescens billeder.
A) serum SULTEDE REF52 celler blev holdt i suspension i 90 min., mens de blev behandlet med 10 μM Ku55933. Celler blev belagt på FN og lov til at holde sig til 20 min. cellerne blev fikseret og plettet med anti-paxillin eller phalloidin-Alexa 594 F-actin Probe. Cellekanter vises med gule pile. (B) MEF-celler blev holdt i suspension og derefter belagt på FN i 30 min. cellerne blev fikseret og plettet med et anti-paxillin antistof. Ud af fokus celler er betegnet med røde pile og Cross-reaktivitet af anti-paxillin-antistof med cellulære rester er angivet med blå pile. Bar, 30 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den protokol, der er beskrevet her, er en alsidig og økonomisk måde til hurtigt at screene en række forankrings afhængige celletyper til dynamisk cytoskelet remodeling under celle spredning. Især undersøger denne metode kvantitativt stress fiber og fokal vedhæftnings dannelse under oxidativ stress, når cellerne overholder FN (figur 1a). Desuden kan disse cellulære fænotyper foreslå en regulerende rolle for medlemmer af Rho familien af små gtpases, da de har dokumenteret roller under celle fastgørelse og sprede15,16,22. Det vil imidlertid være nødvendigt med yderligere biokemiske teknikker for at identificere den mulige involvering af GTP-bundne, aktive Rho-familie proteiner.

Den præsenterede protokol anvender immunofluorescens detektion af F-actin og paxillin til specifikt at undersøge celle vedhæftning og spredning af udødeliggjort fibroblast celler på FN efter oxidativ stress induceret af ATM kinase hæmning (figur 2, Figur 3 og figur 4). Denne procedure kan dog også tilpasses til brug på andre ECM-proteiner og/eller til andre vedlige celletyper. Ved tilpasning til andre cellelinjer, er det vigtigt at optimere de eksperimentelle betingelser, især: celle nummer/tæthed, tid af serum sult, ECM proteinkoncentration, og oxidativ STRESSBEHANDLING betingelser. Ved afprøvning af virkningerne af en ukendt stimulus på vedhæftning og sprede dynamik, er det nødvendigt at inkludere både negative og positive kontrolprøver for at kontrollere, at analysen fungerer korrekt. Negative kontrolprøver kan omfatte en ubehandlet prøve eller et køretøj kun, mens en positiv kontrol bør fremkalde oxidativt stress (f. eks. H2O2). Desuden, selv om ikke diskuteret her, det er også vigtigt at udnytte den korrekte antistof kontrol. Det anbefales, at der anvendes tre separate Kontroller for hvert antistof for at verificere dets specificitet og identificere potentielle fluorescens blødninger23,24. Disse omfatter: 1) en primær antistofkontrol for at sikre specifik binding af det primære antistof til antigenet og for at bekræfte, at antigen binding forekommer under de anvendte fikserings betingelser, 2) en sekundær antistofkontrol (for ikke-sekundære konjugeret antistoffer ), der viser specificiteten af det primære antistof, og 3) fluoroforet Kontroller, der sikrer, at fluoroforet tilsættes ikke er resultatet af endogene fluorescens eller bløder fra et andet antistof.

Mens denne analyse er nyttig til analyse af de tidlige kinetiske hændelser af vedhæftnings samling og spredning, er den ikke egnet til detaljeret undersøgelse af adhæsion eller vedhæftningsstyrke og cellulær forstærkning. Sidstnævnte kræver brug af langsigtede Billeddannende bio-stationer eller enkelt celle kraft spektroskopi teknikker. De sidstnævnte teknikker omfatter atomkraften mikroskopi, optiske pincet, spændings sensorer af adhæsions proteiner såsom vinculin25 eller Talin26,27og 3D-Force mikroskopi28.

Kritiske trin i protokollen omfatter grundigt belægning dæksedler med FN. Dette er nødvendigt for ensartet spredning og vedhæftning af celler. Det er derfor vigtigt at afpipettere FN-opløsningen op og ned over dæksedlerne flere gange før inkubationen. Dæksedler skal forblive fuldt nedsænket i FN-opløsningen under inkubationstiden. FN-belagte dæksedler kan opbevares i op til 2 uger ved 4 °C.

Celletæthed er også vigtigt, som celler, der er belagt for tæt vil ikke opnå maksimal spredning omkreds. Desuden ville det ikke være muligt at skelne individuelle fokale sammenvoksninger eller cellulære flæser for hver enkelt celle. Det er derfor nødvendigt at tælle cellerne ved hjælp af en hemocytometer eller automatiseret celle tæller forud for placering af cellerne i suspension. Mens et estimat af celletæthed er fastsat for REF52 celler, dette skal være empirisk bestemt for andre celler under undersøgelse. Celler bør være belagt tyndt nok, at nogle celler overlapper hinanden, så de kan spredes fuldt ud (figur 5).

Andre kritiske trin i protokollen at overveje er fluorescently konjugeret phalloidin-Alexa 594 F-actin sonde og sekundære antistoffer er lysfølsomme. Derfor bør prøverne være minimalt eksponeret for lys efter anvendelsen af disse reagenser. Endvidere, en række agenter, der inducerer oxidativ stress har korte halverings steder. Det er derfor nødvendigt at teste den valgte oxidant for optimal dosis og eksponeringstid for at opnå peak aktivitet.

De følgende afsnit indeholder tips til fejlfinding med hensyn til FN-koncentration, serum-sult forhold og celle indløsningsmetoder. Disse tips er nyttige, når du tilpasser protokollen for andre celler linjer og/eller behandling betingelser.

For konsekvent FA analyse, optimal fastgørelse og spredning betingelser er nødvendige, som vil variere afhængigt af ECM ligand. For FN, begynde at bruge et dynamisk område på 10-30 μg/mL. Ved højere koncentrationer af FN, der er lille forskel i celle fastgørelse. Men, nogle celletyper ikke effektivt spredes ved højere koncentrationer af ECM.

Hver celletype reagerer forskelligt på betingelserne for serum sult. REF52 celler kan nemt blive udsultet natten over uden tab af levedygtighed, men det er ikke sandt for alle cellelinjer. Derfor er det nødvendigt at bestemme, i hvilket omfang celle linjen under undersøgelse kan modstå serum sult.

For at sprede assays, celler skal være trypsinized for så lidt tid som muligt for reproducerbare resultater29. Efter celle løsrivelse ved trypsinisering, celleoverflade receptorer, deres cognate ligands og Rho gtpase aktivitet kræver en restitutionsperiode for at vende tilbage til Steady-State niveauer14,15. Den trypsinserings procedure, som er skitseret i denne protokol, skal gøre det muligt for cellerne at beholde de fleste af deres celleoverflade FN-bindings receptorer29. Men, visse celletyper kan kræve alternative metoder til celle løsrivelse til helt at forhindre fordøjelsen af celleoverflade receptorer. Disse metoder omfatter chelaterende celler, der anvender EDTA-baserede opløsninger (f. eks. versene) eller mildere enzymatiske dissociations opløsninger (f. eks. Accutase). Brug af disse dissociations opløsninger kan efterlade celle celle sammenvoksninger intakt, hvilket resulterer i celle klumper. Det er derfor vigtigt helt at resuspendere individuelle celler for at sikre eksperimentel reproducerbarhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker DRs. Scott R. Hutton og Meghan S. Blackledge for den kritiske gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af High point Universitetets forskning og sponsorerede programmer (MCS) og den bioteknologiske program på North Carolina State University (MCS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Gibco by Life Technologies 25300-054 cell dissociation
10 cm2 dishes Cell Treat 229620 sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes Fisher Scientific 05-539-5 sterile
1X Phosphate Buffered Saline Corning Cellgro 21-031-CV PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates Fisher Scientific 07-200-740 sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) BD Transduction Laboratories 610620 marker of focal adhesions
Aspirator Argos EV310
Biosafety cabinet Nuair NU-477-400 Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder Fisher Scientific BP9704-100 dlBSA
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231-100 organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose Fisher Scientific 11965092 REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum Fisher Scientific 16000044 certified, cell culture medium supplement
Fiji National Institutes of Health http://fiji.sc/ image analysis program
Filter syringe Fisher Scientific 6900-2502 0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5) Fisher Scientific 12-545-81 autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum Gibco by Life Technologies 16210-064 component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer Fisher Scientific 22-600-107 for cell counting
Human Plasma Fibronectin Gibco by Life Technologies 33016-015 FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope Olympus microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933 Sigma-Aldrich SML1109-25MG ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera Optimos
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) Invitrogen A12381 marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36941 cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control Corning Incorporated PC-420D
Syringe BD Biosciences 309653 60 mL syringe
Tissue culture incubator Nuair
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution Fisher Scientific 15-250-061 for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x) Gibco by Life Technologies R-002-100 TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator Fisher Scientific 11-676-341
water bath Fisher Scientific FSGPD02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
  3. Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
  4. Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
  5. Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
  6. Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
  8. Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
  9. Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
  10. Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
  11. Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
  12. Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
  13. Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
  14. Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
  15. Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
  16. Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
  17. Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
  18. Fitzpatrick, M. Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html (2014).
  19. Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
  20. Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
  21. Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
  22. Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
  23. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
  24. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  25. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  26. Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
  27. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  28. Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
  29. Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).

Tags

Biokemi celle vedhæftning cellulære spredning oxidativ stress fibronectin epitelceller ATM hæmning flæser stress fibre celle cirkularitet
Undersøge dynamikken i cellulære vedhæftning og spredning af Epiteliale celler på Fibronectin under oxidativ stress
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tolbert, C. E., Palmquist, L.,… More

Tolbert, C. E., Palmquist, L., Dixon, H. L., Srougi, M. C. Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (152), e59989, doi:10.3791/59989 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter