Summary
التفاعلات GPCR-β-arrestin هي حقل الناشئة في اكتشاف المخدرات GPCR. ومن الضروري وضع أساليب دقيقة ودقيقة وسهلة الإعداد لرصد هذه التفاعلات في النظم الحية. نعرض فحص اكمبية هيكلية لمراقبة تفاعلات GPCR-β-arrestin في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي، ويمكن توسيعه إلى أي GPCR.
Abstract
التفاعلات بين مستقبلات G-البروتين المقترنة (GPCRs) وβ-arrestins هي عمليات حيوية مع الآثار الفسيولوجية ذات أهمية كبيرة. حاليا، فإن توصيف الأدوية الجديدة نحو تفاعلاتها مع β-arrestins وغيرها من البروتينات السيتوسية هو قيمة للغاية في مجال اكتشاف المخدرات GPCR لا سيما خلال دراسة الآلام المتحيزة GPCR. هنا، نعرض تطبيق تحليل استكمال الهيكلية رواية لرصد بدقة مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي. هذه الطريقة بسيطة ودقيقة ويمكن أن تمتد بسهولة إلى أي GPCR ذات أهمية، وأيضا لديها ميزة أنه يتغلب على التفاعلات غير محددة بسبب وجود المروج التعبير منخفضة موجودة في كل نظام ناقلات. يوفر هذا التحليل التكامل الهيكلي السمات الرئيسية التي تسمح برصد دقيق ودقيق للتفاعلات مستقبلات بيتا-arrestin، مما يجعلها مناسبة في دراسة الآلام المتحيزة من أي نظام GPCR، فضلا عن GPCR c-terminus 'الفسفورية رموز ' مكتوبة من قبل مختلف GPCR-kinases (GRKs) والتعديلات ما بعد الترجمة من arrestins التي استقرار أو زعزعة استقرار مجمع مستقبلات بيتا-arrestin.
Introduction
تمثل GPCRs الهدف من ما يقرب من 35٪ من الأدوية الحالية في السوق1،2 وفهم واضح للأدوية لها أمر بالغ الأهمية في تطوير الأدوية العلاجية الجديدة3. واحدة من الجوانب الرئيسية في اكتشاف المخدرات GPCR، لا سيما خلال تطوير الناهضات المتحيزة هو توصيف ligands جديدة نحو مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات4 وبيتا-arrestin التفاعلات مع البروتينات الربابية الأخرى مثل كما clathrin5.
وقد تم توثيق أن إشارات تعتمد على β-arrestin يلعب دورا رئيسيا في الاضطرابات العصبية مثل اضطراب ثنائي القطب, الاكتئاب الكبير, والفصام6 وأيضا الآثار الجانبية الشديدة في بعض الأدوية مثل المورفين7.
الأساليب الحالية المستخدمة لرصد هذه التفاعلات عادة لا تمثل المستويات الذاتية الفعلية للبروتينات في الدراسة، في بعض الحالات أنها تظهر إشارة ضعيفة، وتبييض الصور واعتمادا على GPCR قد يكون من الصعب من الناحية الفنية لإعداد8. هذا الفحص التكامل الهيكلي الجديد يستخدم ناقلات المروج التعبير المنخفض من أجل تقليد المستويات الفسيولوجية الذاتية ويوفر حساسية عالية بالمقارنة مع الأساليب الحالية9. باستخدام هذا النهج، كان من الممكن بسهولة توصيف مستقبلات Galanin-β-arrestin € وأيضا β-arrestin2-clathrin التفاعلات10. ويمكن استخدام هذه المنهجية على نطاق واسع إلى أي GPCR ذات أهمية خاصة حيث β-arrestins تلعب وظيفة فسيولوجية رئيسية أو إشاراتها ذات الصلة في بعض الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التمهيدي استراتيجية التصميم
- تصميم مواد أولية لإدخال الجينات ذات الأهمية في pBiT1.1-C [TK/LgBiT]، pBiT2.1-C [TK/SmBiT]، pBiT1.1-N [TK/LgBiT] وpBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.
- حدد واحدًا على الأقل من هذه المواقع الثلاثة كواحد من اثنين من إنزيمات التقييد الفريدة اللازمة للاستنساخ الاتجاهي نظرًا لوجود codon توقف في الإطار يقسم موقع الاستنساخ المتعدد كما هو موضح في الشكل 111.
- إدراج تسلسل النيوكليوتيد في المواد التمهيدية كما هو مبين في الجدول 1 لترميز بقايا الرابط المبينة باللون الأحمر في الجدول 211.
- بالنسبة لناقلات pBiT1.1-C [TK/LgBiT] وpBiT2.1-C [TK/SmBiT]، تأكد من أن الدليل التمهيدي 5 يحتوي على codon ATG وتسلسل توافق الآراء Kozak قوية (GCCGCCACC).
- لpBiT1.1-N [TK/LgBiT] و pBiT2.1-N [TK/SmBiT] ناقلات, تأكد من أن التمهيدي 3 € يحتوي على وقف codon.
ملاحظة: يحتوي كل ناقل على مروج HSV-TK لتقليل الارتباط غير المحدد وتقليل القطع الأثرية التجريبية، كما أن كل ناقل لديه كاسيت تعبير لمقاومة أمبيسيلين في البكتيريا.
2. PCR
- إعداد وتشغيل ردود فعل PCR لتضخيم الحمض النووي إدراج الجين ذات الفائدة باستخدام التمهيديات المصممة من الخطوة 1. من المهم استخدام بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة للحد من الطفرات.
- استخدم بالضبط الترتيب التالي لإعداد 50 ميكرولتر من تفاعل PCR. إضافة 35.5 ميكرولتر من الماء المقطر، و5 ميكرولتر من 10 x عازلة للبوليميراز، و5 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 مليمتر لكل منهما)، و1 ميكرولتر من قالب البلازميد (200 نانوغرام/لتر)، و1.25 ميكرولتر من المواد التمهيدية الأمامية والعكسية (10 ميكرومتر) و1 ميكرولتر من بوليميراز عالية الدقة (5 U/μL).
- باستخدام دراجة حرارية إعداد برنامج تضخيم الحمض النووي التالي.
- تشوه في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- كرر 25 مرة الدورة الحرارية التالية: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لكل 1 كيلوبت في الدقيقة ليتم تضخيمها.
- تشغيل ملحق النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- عقد العينات في 4 درجة مئوية داخل دراجة حرارية.
ملاحظة: من المستحسن للغاية استخدام بوليميراز عالية الدقة من أجل تقليل الطفرات نقطة خاصة تلك التي تحدث أثناء تضخيم تسلسل طويل. كما يصبح amplicon أطول، ودرجة الدقة في النسخ المتماثل للحمض النووي يقلل. لرد فعل PCR، اختر درجة حرارة الصلب على أساس درجة حرارة ذوبان المنطقة حيث القلة تهجين مباشرة مع قالب الحمض النووي وليس مع كل تسلسل التمهيدي.
- PCR تنقية المنتج
- عزل المنتج PCR من بقية رد فعل PCR باستخدام مجموعة من الشركة المصنعة للتفضيل12. منتج PCR جاهز الآن لتقييد الهضم.
3. هضم الحمض النووي
- لهضم المنتج PCR إعداد 50 درجة مئوية من رد فعل الهضم على النحو التالي.
- باستخدام أنبوب 1.5 مل، إضافة 12 ميكرولتر من الماء المقطر.
- إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10X مع أفضل التوافق مع كل من الإنزيمات تقييد.
- من الخطوة 2.4 إضافة 30 μL من المنتج PCR
- وأخيرا، إضافة 1.5 ميكرولتر من كل إنزيم تقييد.
- مزيج لفترة وجيزة من دوامة وحضانة في 37.5 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- للهضم بلازميد المتلقي إعداد 50 درجة مئوية من رد فعل الهضم على النحو التالي:
- باستخدام أنبوب 1.5 مل، إضافة 23 ميكرولتر من الماء المقطر.
- إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10X مع أفضل التوافق مع كل من الإنزيمات تقييد.
- إضافة 15 ميكرولتر من بلازميد المتلقي (200 نانوغرام / ميكرولتر).
- إضافة 1.5 ميكرولتر من كل إنزيم تقييد.
- مزيج لفترة وجيزة من دوامة وحضانة في 37.5 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: من المهم استخدام 3 ميكروغرام من بلازميد المتلقي من أجل الحصول على ما يكفي من المواد بعد تنقية هلام أغاروز الحمض النووي. ومن المهم أيضا أن تترك هضم الحمض النووي بين عشية وضحاها باستخدام كلا الإنزيمات للحصول على كفاءة استنساخ عالية.
4. الحمض النووي أغاروز هلام تنقية والاستنساخ
- إعداد هلام أغاروز 1٪ لتشغيل بلازميد الحمض النووي المهضوم وإدراج والمضي قدما في خفض العصابات المقابلة. وبمجرد تنقية المتجهات المقابلة ونطاقات الإدراج12، حدد تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
- إجراء ربط الحمض النووي لصهر إدراج إلى بلازميد المتلقي.
- إعداد ردود الفعل الربط من حوالي 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي بما في ذلك 50 نانوغرام من ناقلات بلازميد.
- إعداد نسبة بلازميد-إدراج المستلم من حوالي 1:3; يمكن حسابها باستخدام آلة حاسبة إدراج ناقلات13.
- إعداد عناصر تحكم سالبة في نفس الوقت. على سبيل المثال، فإن ربط الحمض النووي بلازميد المتلقي دون أي إدراج سوف توفر معلومات حول مدى الخلفية من بلازميد المتلقي غير مهضوم أو الذاتي الربط موجود.
5- تحويل الحيوانات المستنسخة
- وضع أنبوب من الخلايا المختصة DH5α من الثلاجة في -80 درجة مئوية ونقلها على الفور على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- بعد ذلك الوقت، تأخذ 55 درجة مئوية من الخلايا المختصة DH5α وإضافة 4 ميكرولتر من رد فعل الربط ومزيج عن طريق نفض الغبار الأنبوب وتخزينها على الجليد لمدة 45 دقيقة.
- وضع الأنبوب في حمام مائي كان يسخن سابقا في 42 درجة مئوية ل48 ق بالضبط والحصول على الفور أنابيب مرة أخرى على الجليد لمدة 3 دقائق أخرى.
- إضافة 600 درجة مئوية من المرق لوريا (LB) المتوسطة التي كانت تسخن سابقا في 37.5 درجة مئوية وحضانة مع الهز لمدة 1 ساعة في 200 دورة في الدقيقة.
- نقل 200 درجة مئوية في لوحة أجار تحتوي على أمبيسيلين 100 ميكروغرام / مل وتنتشر بلطف على السطح مع يتم امتصاص السائل في الغالب.
- احتضان لوحات بين عشية وضحاها لرؤية المستعمرات صباح اليوم التالي. يجب أن يكون البلازميد المتلقي على لوحة إدراج المستعمرات أكثر بكثير من لوحة بلازميد المتلقي وحدها.
6. عزل بلازميد الانتهاء
- اختيار 3-10 المستعمرات البكتيرية الفردية ونقل إلى 1 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) وحضانة لمدة 6 ساعة.
- خذ 200 ميكرو لتر من التعليق البكتيري ونقل إلى 5 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على نفس تركيز أمبيسيلين كما هو الحال في الخطوة 6.1 وحضانة بين عشية وضحاها في 37.5 درجة مئوية مع هز في 200 دورة في الدقيقة.
- باستخدام تنقية مجموعة الحمض النووي miniprep، إجراء تنقية الحمض النووي miniprep باستخدام 5 مل من LB نمت بين عشية وضحاها بعد تعليمات الشركة المصنعة14.
- ولتحديد الأربطة الناجحة، قم بإعداد ردود فعل تفاعل PCR بنفس الطريقة الواردة في القسم 2 باستخدام الحمض النووي الذي تم الحصول عليه من الخطوة 6-3 كقالب بنفس المواد التمهيدية كما هو الحال في القسم 2 أثناء الـ PCR الأول. سوف استنساخ إيجابية تنتج منتجات PCR مع الحجم المقابل.
- بعد تنقية الحمض النووي الإعدادية الكبيرة من الحيوانات المستنسخة الإيجابية، وإجراء عملية هضم تقييد التشخيص من 500 نانوغرام من الحمض النووي النقي مع الإنزيمات المستخدمة خلال خطوة الاستنساخ وتشغيل المنتجات المهضومة على هلام أغاروز 1٪. يجب أن يكون هناك نطاقين: واحد حجم المتجه وواحد في حجم إدراج جديد.
- تحقق من تسلسل الإنشاء عن طريق التسلسل باستخدام التمهيديات التالية: إلى الأمام 5 '- aaggtgacgcgtgggcctcgaac-3' وعكس 5 '-gcatttttttcactccttagtt-3'.
ملاحظة: عندما يتم نسخ الحمض النووي باستخدام PCR، هناك دائماً إمكانية حدوث أخطاء أثناء التضخيم حتى عند استخدام بوليميراز عالية الدقة، وبالتالي من المهم جداً تسلسل المنشآت النهائية.
7. التغوط والتعبير عن البروتين
- في لوحة بيضاء مغلفة سابقا بولي-L-يسين 96 جيدا، وأداء البذر الخلية يوم واحد قبل transfection في 2.5 × 104 خلايا لكل بئر باستخدام دولبكو تعديل النسر المتوسطة تستكمل مع 10٪ من المصل البقري الجنين، 100 U / مل البنسلين G، و 100 ميكروغرام / 100 ميكروغرام / مل ستربيومسين.
- استخدم فقط الآبار الداخلية الـ 60 لتقليل إمكانية التدرجات الحرارية عبر اللوحة وآثار الحافة من التبخر. إضافة 200 درجة مئوية من المياه المقطر المعقمة إلى 36 آبار خارجية و 150 درجة مئوية في المساحات بينالآبار والحضانة بين عشية وضحاها عند 37.5 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون 2.
- في صباح اليوم التالي إجراء التغوط باستخدام 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي (50 نانوغرام كل بناء).
- إعداد أربع تركيبات بلازميد مختلفة (مستقبلات: β-arrestin) وفقا للرقم 2ب.
- لكل تركيبة بلازميد استخدام 20 €L من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية النسر المعدلة المخزنة مع HEPES باستخدام 0.3 ميكرولتر من الكاشف الانجليب الدهون لكل بئر.
- إضافة 20 درجة مئوية من خليط الكاشف الحمض النووي الكاشف الدهون إلى كل بئر وخلط لوحة في دوائر لمدة 10 ثانية.
- تغيير المتوسطة الطازجة بعد حضانة 6 ساعة في 37.5درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- احتضان لوحة لمدة 24 ساعة في 37.5 درجةمئوية و 5٪ CO 2.
8. رصد مستقبلات بيتا-arrestin € التفاعلات في خلايا HEK293
- يستنشق المتوسطة وإضافة 100 درجة مئوية من الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية النسر المعدلة المخزنة مع HEPES إلى كل بئر والسماح لللوحة استقرار في RT لمدة 10 دقيقة.
- إعداد الركيزة furimazine عن طريق الجمع بين 1 حجم من الركيزة 100X مع 19 مجلدات من LCS تخفيف العازلة (20 أضعاف تخفيف)11، وخلق مخزون 5X لخلط مع وسط ثقافة الخلية.
- إضافة 25 درجة مئوية من 5x furimazine إلى كل بئر وتخلط بلطف في دوائر لمدة 10 ثانية.
- قياس الإنارة لمدة 10 دقيقة لتثبيت إشارة في RT.
ملاحظة: باستخدام إشارة خط الأساس هذه لتطبيع استجابة كل بئر سوف يساعد على الحد من التباين الناجم عن الاختلافات في عدد الخلايا المطلية في البئر، وكذلك الاختلافات في كفاءة الانف، الخ. بمجرد حسابها، متوسط الاستجابة العادية من تكرار الآبار لعلاج المخدرات معين. - إعداد 13.5x حل ligand في تعديل النسر الحد الأدنى من الوسائط الأساسية المخزنة مؤقتا مع HEPES.
- بالنسبة للتجارب في درجة حرارة الغرفة مع 10 ميكرولتر من 13.5x ligand بالإضافة، إضافة المركبات باستخدام الحقن أو ماصة متعددة القنوات وخلط لوحة باليد أو باستخدام شاكر المداري (20 ثانية في 200 دورة في الدقيقة).
- بالنسبة للتجارب عند درجة حرارة 37.5 درجة مئوية مع إضافة 10 ميكرولتر من 13.5 x ligand، استخدم الحقن لتوزيع المركبات والاختلاط باستخدام الهزاز المداري للأداة. في حالة عدم استخدام الحقن، قم بإزالة اللوحة من مقياس الإنارة، وأضف الأربطة واخلط اللوحة باليد أو باستخدام شاكر مداري (20 s at 200 rpm).
ملاحظة: استخدام الحقن وشاكر داخل أداة الكشف لتقليل تقلبات درجة الحرارة المرتبطة بإزالة لوحة من مقياس الإنارة. ويمكن استخدام أجهزة قياس الإضاءة القياسية من أعلى مقاعد البدلاء لهذا الفحص. استخدم وقت تكامل من 0.25-2 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الإجراء المعروض هنا، تم رصد التفاعلات بين GPCR نموذجي واثنين من isoforms β-arrestin. تم إجراء الجلوكاجون مثل مستقبلات الببتيد (GLP-1r) المنشآت باستخدام التمهيديات التي تحتوي على مواقع تقييد إنزيم NheI وEcoRI واستنساخها في ناقلات pBiT1.1-C [TK/LgBiT] و pBiT2.1-C [TK/SmBiT] بينما في حالة بيتا-arrestins، كان اثنان من ناقلات إضافية تستخدم pBiT1.1-N [TK/LgBiT] و pBiT2.1-N [TK/SmBiT] باستخدام مواقع تقييد الإنزيم BgIII و EcoRI في حالة β-arrestin2 وNheI وXhoI في حالة β-arrestin1. تم نقل خلايا HEK293 باستخدام 50 نانوغرام من GLP-1r-LgBiT/SmBiT و 50 نانوغرام من β-arrestin الموسومة LgBiT أو SmBiT في محطة N-أو C. تم فحص أربع تركيبات بلازميد مختلفة (الشكل 3) وواحدة مع أعلى إشارة الإنارة تم اختيارها لمزيد من التجارب (الشكل 4). من أجل تحديد قيم EC50 لكل توظيف متساوي الشكل بيتا-arrestin، تم تنفيذ منحنيات استجابة الجرعة باستخدام 10 ميكرومتر، 1 ميكرو متر، 100 نم، 10 نم و 1 nM من تركيز الليغا GLP-1 (الشكل4ج). تم الحصول على منحنيات استجابة الجرعة من الاستجابة القصوى لكل تركيز من الدراسات الحركية (الشكل4أ، 4ب).
الشكل 1 تسلسل النيوكليوتيدات من مواقع الاستنساخ المتعدد للمتجهات المستخدمة في تصميم GLP-1r-β-arrestin1/2 فحص التكميل الهيكلي.
من أجل تطوير التكميل الهيكلي لنظام GLP-1r-β-arrestin1/2، كان من الضروري وضع علامة في محطة C GLP-1r مع LgBiT وSmBiT باستخدام قيود الإنزيم NheI وEcoRI في pBiT1.1-C [TK/LgBiT] و pBiT2.1-C [TK/SmBiT] المتجه. في حالة β-arrestin1/2 كما تم وضع علامة مع LgBiT وSmBiT في C- و N-الطرفية باستخدام قيود الإنزيم BglII/EcoRI لβ-arrestin2 وNheI/XhoI لβ-arrestin1 في ناقلات الأربعة. تستخدم جميع المتجهات مروج HSV-TK لتقليل الارتباط غير المحدد وتقليل القطع الأثرية التجريبية، ويحتوي كل ناقل على كاسيت تعبير لمقاومة أمبيسيلين في البكتيريا. صورة مقتبسة من المرجع 11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 تمثيل تخطيطي للGPCR:β-arrestin1/2 التحليل التكامل الهيكلي.
(أ) كيف يعمل إجراء عملية التكَيّن الإنشائي في حضور الرباط. (ب) التمثيل الهيكلي لتركيبات بلازميد مختلفة لGPCR وβ-arrestin isoforms الموسومة LgBiT أو SmBiT. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 GLP-1r/β-arrestins الفحص التوجيهي.
[إين وردر تو] نلت الحساسية [هيغست] 4 مختلفة [بلازميد] عبّر عن تركيبات كان أثناء 24 [ه] بعد [ترّفكأيشن]. تم الكشف عن إشارات مضيئة في جميع تركيبات بلازميد مختلفة تقريبا (أ-ج) باستثناءواحد فقط GLP-1r: β-arrestin التوجه (د). يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ± S.E.M. من تجربتين أجريت في تكرار; تم متوسط كل تكرار قبل حساب S.E.M. تشير الأسهم إلى الوقت الذي تم فيه التعامل مع الخلايا مع GLP-1 عند التركيز النهائي 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 GLP-1r-β-arrestin1/2 التفاعلات هي طريقة تعتمد على الجرعة.
جرعة تعتمد على علاقة ligand من β-arrestin2 (أ) وβ-arrestin1 التجنيد (ب). منحنيات استجابة الجرعة التي تبين التجنيد التفاضلي بين β-arrestin1 وβ-arrestin2 بواسطة GLP-1r (ج). يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ± S.E.M. من تجربتين أجريت في تكرار; تم متوسط كل تكرار قبل حساب S.E.M. وتشير الأسهم إلى الوقت الذي عولجت فيه الخلايا بـ GLP-1 بالتركيزات المقابلة (10 ميكرومتر، 1 ميكرومتر، 100 نم، 10 نم و 1 نم، التركيزات النهائية). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المتجه | استخدام تقييد الإنزيم | تسلسل التمهيدي |
| pBiT1.1-C [TK/LgBiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] | SacI | 5 - XXXXXXXXGAGCTCC(Rev SI)-3 ... |
| EcoRI | 5 - XXXXXXXXGAATTCCC(Rev SI)-3 ... | |
| في هذا الـ4ل | 5 - XXXXXXXXCTCGAGCC(Rev SI)-3 ... | |
| pBiT1.1-N [TK/LgBiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] | Xho | 5 - XXXXXXXXCTCGAGCGGT (SI) - 3 ... |
| SacI | 5 - كيكونجإكسكجاجتكAG(SI)-3... | |
| EcoRI | 5 - XXXXXXXXGAATTCA(SI)-3 ... |
الجدول 1 تسلسل اتّجاهات من التمهيديات لالمختلفة تقييد أنزيمات موقعات في ال [كدينغ] تسلسل من الرابط ل ال [ببّت1.1] و [بّت2.1] متجهات.
SI = تسلسل الفائدة؛ Rev SI = عكس التكامل مع تسلسل الفائدة. الجدول مقتبس من المرجع 11.
| المتجه | تسلسل الرابط | استخدام تقييد الإنزيم | ||
| pBiT1.1-C [TK/LgBiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] | SI-GlyAlaGlnGlyAsnSerGlySerSerGlyGlyGlyGlyGlySerglyGlyGlyGlySerGly-(LgBiT/SmBiT) | SacI | ||
| SI-GlyAsnSerlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGly-(LgBiT/SmBiT) | EcoRI | |||
| SI-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerlyGlyGlyGlySerGly- (LgBiT/SmBiT) | في هذا الـ4ل | |||
| pBiT1.1-N [TK/LgBiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] | (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSerGly-SI | في هذا الـ4ل | ||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGlyGlyAlAGln-SI | SacI | |||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyAlaGnGlyAsnser-SI | EcoRI | |||
الجدول 2 تسلسل الأحماض الأمينية linker المتعلقة SacI, EcoRI أو XhoI مواقع التقييد في pBiT1.1 و pBiT2.1 ناقلات.
يجب ترميز المخلفات الحمراء بواسطة التمهيديات PCR. الجدول مقتبس من المرجع 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام الطريقة المعروضة هنا، يمكن رصد التفاعلات بين أي GPCR وβ-arrestin1/2 في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي باستخدام هذا الفحص المكمّل الهيكلي GPCR-β-arrestin. في هذا الصدد، تمكنا من مراقبة التفاضلة β-arrestin التجنيد بين isoforms بيتا-arrestin اثنين من قبل GLP-1r (A prototypical فئة B GPCR)، لاحظنا أيضا تفكك مستقبلات بيتا-arrestin معقدة بضع دقائق بعد الوصول إلى الحد الأقصى إشارة مضيئة.
من أجل الحصول على أفضل حساسية في نظام فحص التكملة الهيكلية، تم فحصه مع أربعة اتجاهات مكانية مختلفة بين المستقبلات وكل isoform بيتا-arrestin واحد مع أعلى إشارة الإنارة تم استخدامها للخلف دراسات مثل منحنيات تحفيز استجابةالجرعة (الشكل 4). باستخدام هذه المنهجية كان من الممكن أن تميز التفاعلات مستقبلات بيتا-arrestin باستخدام GPCR ذات قيمة علاجية عالية في أمراض الغدد الصماء مثل مرض السكري15. بنفس الطريقة يمكن تكييف هذه الاستراتيجية بسهولة مع أي GPCR عن طريق وضع علامات بسيطة GPCR من الفائدة مع LgBiT أو SmBiT في محطة C واستخدام بناء β-arrestin € وصفها هنا، وأنه يظهر كبديل قوي للمنهجيات الحالية دون ضرورة إنشاء معقدة حيث التداخل بين المانح ومقبول يمكن أن يكون عقبة كما هو الحال في بعض الحالات من بريت وفري. وثمة ميزة هامة أخرى هي أن المتجهات المستخدمة في هذا النظام تحتوي على مروجين للتعبير المنخفض في محاولة لمحاكاة مستويات التعبير المحلي. مع هذه الميزة، يمكننا استبعاد إمكانية الجمعيات غير محددة بسبب مستويات التعبير عالية من مستقبلات و / أو β-arrestin. في الشكل 3 والشكل 4، هناك فرق واضح في مجمع مستقبلات بيتا-arrestin بين β-arrestin1 مقابل β-arrestin2 وأيضا فعالية أعلى وكثافة نحو β-arrestin1 على β-arrestin2. واقتُرح إجراء الفرز في أربعة اتجاهات مختلفة لزيادة حساسية الفحص مما يجعل النظام شديد الحساسية حتى في مستويات التعبير المحلي.
هذه المنهجية هي مباشرة جدا إلى الأمام لأداء. ربما الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو التصميم التمهيدي لتضخيم مستقبلات الاهتمام. يجب على المستخدم أن يكون حذرا جدا في اختيار ما الانزيم تقييد لاستخدامها وفقا للشكل 1 وبناء على هذا لإضافة النيوكليوتيدات المقابلة إلى التمهيديات (الجدول 1) لترميز الأحماض الأمينية الحمراء المميزة (الجدول 2).
يمكن أن يكون أحد قيود هذه المنهجية أن furimazine سوف تتحلل في محلول مائي في أو بالقرب من درجة الحموضة الفسيولوجية، مما يؤدي إلى انخفاض تدريجي في شدة الإنارة مستقلة عن أي تغيير في التفاعلات GPCR-β-arrestin16. وللتغلب على هذا القيد، ينبغي أن يتضمن المستخدم دائمًا التحكم في التطبيع (العينات المعالجة بالمركبات) عند المراقبة المستمرة للإضاءة لفترات زمنية طويلة. ومن المهم أيضا استخدام مستويات منخفضة من مصل البقر الجنيني خلال عملية التسوس منذ وجوده قد يزيد من معدل تدهور الفيريمازين16. إحدى المشاكل التي قد تنشأ أثناء الفحص هو أنه بالنسبة للقيم المضيئة للتفاعل المعروف GPCR-β-arrestin لا يمكن تسجيل أي زيادة كبيرة بالمقارنة مع قيم الخط الأساسي في جميع تركيبات بلازميد المختلفة الأربعة. ويمكن أن يعزى ذلك إلى انخفاض التعبير من المروج HSV-TK17. في هذه الحالة، بديل واحد هو استنساخ فرعي إطارات القراءة المفتوحة ترميز LgBiT وSmBiT الانصهار البروتينات في ناقلات التعبير باستخدام المروج CMV. عند التحول إلى المروج أقوى، ينبغي أن يتم الاستفادة المثلى من كمية الحمض النووي المنقول ة من أجل الحصول على أفضل استجابة فحص.
باستخدام هذا التكميل الهيكلي ة كان من اقدر من مراقبة بدقة كبيرة التفاعلات التوظيف β-arrestin € من قبل فئة نموذجية B GPCR. وباستخدام هذه الطريقة، من الممكن وصف الأدوية الجديدة ذات الأهمية الخاصة بالأدوية الدوائية ذات الأهمية الخاصة التي تستهدف الـ GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل بمنح من برنامج البحوث (NRF- 2015M3A9E7029172) من المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J.
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
- Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
- New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
- Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
