Summary
GPCR-β-tutucu etkileşimleri GPCR uyuşturucu keşfi 'nde ortaya çıkan bir alandır. Canlı sistemlerde bu tür etkileşimleri izlemek için doğru, hassas ve kolay ayarlanabilir Yöntemler gereklidir. Biz gerçek zamanlı yaşam hücrelerinde GPCR-β-tutucu etkileşimleri izlemek için yapısal bir uluslara tahlil göstermek, ve herhangi bir GPCR uzatılabilir.
Abstract
G-protein bağlantılı reseptörler (GPCRs) ve β-tutucu arasındaki etkileşimler, büyük öneme sahip fizyolojik etkileri olan hayati süreçlerden ibaret. Şu anda, yeni ilaçların β-tutucu ve diğer sitosolik proteinleri ile etkileşimlerine yönelik karakterizasyonu, özellikle GPCR önyargılı agonizmin incelenmesi sırasında GPCR uyuşturucu keşfi alanında son derece değerlidir. Burada, biz gerçek zamanlı yaşam sistemlerinde reseptör-β-tutucu etkileşimleri doğru izlemek için bir roman yapısal uluslara tahlil uygulama gösterir. Bu yöntem, basit, doğru ve kolayca herhangi bir GPCR faiz uzatılabilir ve aynı zamanda her vektör sisteminde mevcut bir düşük ifade Organizatör varlığı nedeniyle spesifik olmayan etkileşimlerin üstesinden avantajı vardır. Bu yapısal uluslara tahlil reseptör-β-tutucu etkileşimlerin doğru ve hassas bir şekilde izlenmesi izin temel özellikleri sağlar, herhangi bir GPCR sistemi yanı sıra GPCR c-Terminus ' fosforilasyon önyargılı agonizm çalışmada uygun hale farklı GPCR-kinazlar (GRKs) ve reseptör-β-tutucu kompleksini stabilize eden veya istikrarsızlaştıracak olan tutucu sonrası translasyonel değişikliklerle yazılmış kodlar.
Introduction
GPCRs piyasada mevcut ilaçların yaklaşık% 35 hedef temsil1,2 ve onların farmakolojisinin net bir anlayış yeni terapötik ilaçların gelişimi için çok önemlidir3. Özellikle önyargılı agonistlerin gelişimi sırasında GPCR uyuşturucu keşfinin önemli yönlerinden biri, yeni ligizlerin reseptör-β-tutucu etkileşimleri4 ve β-tutucu diğer sitosolik proteinlerle etkileşimlerine doğru karakterize edilmedir. Clathrin5olarak.
Β-tutucu bağımlı sinyalizasyon, bipolar bozukluk, büyük depresyon ve şizofreni6 gibi nörolojik hastalıklarda önemli bir rol oynadığını ve morfin7gibi bazı ilaçlarda da ciddi yan etkileri olduğunu belgelenmiş.
Bu etkileşimleri izlemek için kullanılan geçerli yöntemler genellikle çalışma proteinlerinin gerçek endojen düzeylerini temsil etmez, bazı durumlarda zayıf sinyal, photobleaching ve GPCR bağlı olarak teknik olarak8kurmak zor olabilir gösterir. Bu roman yapısal uluslara tahlil endojen fizyolojik seviyeleri taklit etmek için düşük ifade Organizatör vektörler kullanır ve mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında yüksek hassasiyet sağlar9. Bu yaklaşımı kullanarak, kolayca galanin reseptör-β-arrestin1/2 ve β-arrestin2-Clathrin etkileşimleri karakterize etmek mümkün oldu10. Bu metodoloji, β-tutucunun önemli bir fizyolojik fonksiyon çalabileceği veya sinyallerinin bazı hastalıklarda ilgili olduğu belirli bir ilgi alanı için yaygın olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Primer tasarım stratejisi
- Pbit 1.1-c [TK/lgbit], pbit 2.1-c [TK/smbit], pbit 1.1-n [TK/lgbit] ve pbit 2.1-n [TK/smbit] vektörler içine ilgi genler tanıtmak için tasarım astarlar.
- Şekil 111' de gösterildiği gibi multicloning siteyi böler bir çerçeve içi stop kodon varlığı nedeniyle yönlü klonlama için gereken iki benzersiz kısıtlama enzimleri biri olarak bu üç siteden en az birini seçin.
- Tablo 211' de kırmızı renkte gösterilen bağlayıcı kalıntıları kodlamak için Tablo 1 ' de gösterildiği gibi astar içine nükreotid dizisini birleştirin.
- Pbit 1.1-c [TK/lgbit] ve pbit 2.1-c [TK/smbit] vektörler için, 5 ' astar bir ATG kodon ve güçlü bir kozak görüş sırası (gccgccacc) içerdiğinden emin olun.
- PBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vektörler için 3 ́ astar bir stop Codon içerdiğinden emin olun.
Not: her vektörünün nonspesifik ilişkiyi en aza indirmek ve deneysel eserler azaltmak için HSV-TK promotör içerir, Ayrıca her vektör bakterilerde ampisilin direnci için bir ifade kaseti vardır.
2. PCR
- Adım 1 ' den tasarlanan astar kullanarak, faiz geninin eklemek DNA 'sını yükseltmek için PCR reaksiyonları ayarlayın ve çalıştırın. Mutasyonları en aza indirmek için yüksek sadakat DNA polimeraz kullanmak önemlidir.
- 50 μL PCR reaksiyonu hazırlamak için tam olarak aşağıdaki sırayı kullanın. Ekle 35,5 μL distile su, 5 μL 10X polimeraz tampon, 5 μL dNTP karışımı (2,5 mM her), 1 μL Plasmid şablonu (200 ng/μL), 1,25 μL ileri ve ters astar (10 μM) ve 1 μL yüksek sadakat polimeraz (5 U/μL).
- Bir termocycler kullanarak aşağıdaki DNA amplifikasyon programı kurmak.
- 95 Ila 5 dk. arasında denature
- Aşağıdaki termal döngüsü 25 kez tekrarlayın: 95 °C için 30 s, 60 °C 1 dk, 72 °C için 1 KBP başına 2 dk amplifikatördür.
- 72 °C ' de 10 dakika boyunca son bir uzatma çalıştırın.
- Numuneleri 4 °C ' de thermocycler içinde tutun.
Not: özellikle uzun sıraları amplifikasyon sırasında meydana gelen nokta mutasyonları en aza indirmek için yüksek sadakat polimeraz kullanmak için tavsiye edilir. Amplikon uzunlaştığında, DNA 'nın çoğaltmasında doğruluk derecesi azalır. PCR reaksiyon için, oligos doğrudan DNA şablonu ile melezleşme ve astar tüm dizisi ile değil bölgenin erime sıcaklığına dayalı tavlama sıcaklığını seçin.
- PCR ürün arıtma
- PCR ürününü,12' si bir üreticiden bir kit kullanarak PCR reaksiyonunun geri kalanından ayırın. PCR ürün şimdi kısıtlama sindirim için hazırdır.
3. DNA sindirim
- PCR ürün sindirim hazırlamak için 50 μL sindirim reaksiyonu aşağıdaki gibi.
- 1,5 mL 'Lik bir tüp kullanarak 12 μL distile su ekleyin.
- Her iki kısıtlama enzimiyle en iyi uyumluluğa sahip 5 μL 10X tampon ekleyin.
- 2,4 adımda 30 μL PCR ürün ekleyin
- Son olarak, her kısıtlama enzim 1,5 μL ekleyin.
- Girdap ile kısaca karıştırın ve 37,5 °C ' de bir gecede inküye yapın.
- Alıcı Plasmid sindirim için hazırlamak 50 μL sindirim reaksiyonu aşağıdaki gibi:
- 1,5 mL 'Lik bir tüp kullanarak 23 μL distile su ekleyin.
- Her iki kısıtlama enzimiyle en iyi uyumluluğa sahip 5 μL 10X tampon ekleyin.
- 15 μL alıcı Plasmid (200 ng/μL) ekleyin.
- Her kısıtlama enziminin 1,5 μL değerini ekleyin.
- Girdap ile kısaca karıştırın ve 37,5 °C ' de bir gecede inküye yapın.
Not: DNA agaroz jel arıtma sonrası yeterli malzeme elde etmek için 3 μg alıcı plazmid kullanmak önemlidir. Ayrıca, yüksek klonlama verimliliği elde etmek için her iki enzimi kullanarak bir gecede DNA sindirimleri bırakmak ilgilidir.
4. DNA agaroz jel arıtma ve klonlama
- Sindirilmiş DNA plazmid ve ekler çalıştırmak için% 1 agaroz jel hazırlayın ve ilgili bantları kesmek için devam. Karşılık gelen vektör ve kesici uç bantları purified12 olduktan sonra, spektrofotometreyi kullanarak DNA konsantrasyonunu belirleyin.
- Alıcı Plasmid için eklemek sigorta DNA ligasyon gerçekleştirin.
- Yaklaşık 100 ng, plazmid vektörü 50 ng dahil toplam DNA 'nın ligasyon reaksiyonları hazırlayın.
- Yaklaşık 1:3 alıcı Plasmid-kesici uç oranını ayarlayın; bir Vector-INSERT Calculator13kullanılarak hesaplanabilir.
- Negatif denetimler paralel olarak ayarlayın. Örneğin, herhangi bir Ekle olmadan alıcı plazmid DNA bir ligasyon sindirilmemiş veya self-ligating alıcı Plasmid ne kadar arka plan mevcut hakkında bilgi verecektir.
5. klonlar dönüşümü
- -80 °C ' de dondurucudan DH5α yetkili hücrelerin bir tüp yerleştirin ve hemen 20 dakika buz üzerine aktarın.
- O zamandan sonra, 55 μL DH5α yetkili hücre alın ve 4 μL ligasyon reaksiyonu ekleyin ve tüp Flicking ve 45 dakika boyunca buz üzerinde mağaza karıştırın.
- Daha önce tam 48 s için 42 °C ısıtılmış bir su banyosuna tüp yerleştirin ve hemen başka bir 3 dakika için buz üzerinde geri tüpler almak.
- 37,5 °C ' de daha önce ısınmış Luria broth (LB) orta 600 μL ekleyin ve 200 devirde 1 saat boyunca sallayarak inküye yapın.
- 200 μL 'yi ampisilin 100 μg/mL içeren bir agar plakasına aktarın ve yüzeyden hafifçe yayılır ve sıvıyla çoğunlukla absorbe edilir.
- Ertesi sabah kolonileri görmek için plakaları bir gecede kulbe etmek. Ekle plakasının alıcı plazmid alıcı Plasmid tek başına plaka daha önemli ölçüde daha fazla koloniler olmalıdır.
6. bitmiş Plasmid izolasyonu
- Seçin 3-10 bireysel bakteriyel koloniler ve 1 mL LB orta içeren ampisilin (100 μg/mL) içine transfer ve 6 h için inkük.
- 200 μL bakteriyel süspansiyon alın ve 6,1 adımda olduğu gibi aynı ampisilin konsantrasyonu içeren 5 mL LB orta transfer ve 37,5 ° c 'de bir gecede, 200 rpm 'de sallayarak ile inküye.
- Bir Sage DNA kiti arıtma kullanarak, 5 ml lb kullanarak Sage DNA saflaştırmaları gerçekleştirmek bir gecede üretici talimatlar14aşağıdaki büyüdü.
- Başarılı ligasyonları belirlemek için, ilk PCR sırasında Bölüm 2 ' de olduğu gibi aynı astar ile bir şablon olarak adım 6,3 elde edilen DNA 'Yı kullanarak bölüm 2 ' de aynı şekilde PCR reaksiyonları ayarlayın. Pozitif klonlar ilgili boyutta PCR ürünleri üretecektir.
- Pozitif klonlar büyük hazırlık DNA arıtma sonra, klonlama aşamasında kullanılan enzimler ile 500 ng bir tanı kısıtlama sindirim davranış ve% 1 agaroz jel sindirilmiş ürünleri çalıştırın. İki bant olmalıdır: bir vektör boyutu ve bir yeni ekleme boyutu.
- Aşağıdaki Primers kullanarak sıralama tarafından yapı sırasını doğrulayın: Forward 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' ve Reverse 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '.
Not: DNA, PCR kullanılarak çoğaltıldığında, yüksek sadakat polimeraz kullanırken bile amplifikasyon sırasında her zaman hata olasılığı vardır, bu nedenle son yapıları sıralamak çok önemlidir.
7. transfeksiyon ve protein ifadesi
- Daha önce poli-L-lizin-kaplamalı beyaz 96 iyi plaka, bir gün transfeksiyon önce 2,5 x 104 hücrelerde Iyi Dulbecco değiştirilmiş Eagle 'Nın orta fetal Sığır serum% 10 ile tamamlayıcı kullanarak hücre yapmak, 100 U/ml penisilin G, ve 100 μg/ mL streptomisin.
- Sadece 60 iç kuyuları kullanarak, plaka ve buharlaşma kenar efektleri boyunca termal degradelerin potansiyelini en aza indirmek için. 36 dış kuyularına ve 150 μL 'ye 200 μL steril damıtılmış su ekleyin ve gece boyunca 37,5 °C ve CO2' nin% 5 ' inde kulyur.
- Ertesi sabah kullanarak transfeksiyon gerçekleştirmek 100 toplam DNA NG (50 ng her yapı).
- Şekil 2B'ye göre dört farklı Plasmid kombinasyonu (reseptör: β-tutucu) ayarlayın.
- Her bir Plasmid kombinasyonu için, iyi başına 0,3 μL lipidik transfeksiyon reakajını kullanarak HEPES ile tamponlu 20 μL modifiye kartal minimum Essential medya kullanılır.
- Her bir kuyu için 20 μL lipidik transfeksiyon reagent-DNA karışımı ekleyin ve plakayı 10 s için çevrelerde karıştırın.
- 37,5 °C ve% 5 CO2' de 6 saat İnkübasyon sonrasında taze ortamı değiştirin.
- 37,5 °C ve% 5 CO2' de 24 saat boyunca plakayı kulbe etme.
8. HEK293 hücrelerde reseptör-β-arrestin1/2 etkileşimlerini izleme
- Aspirate orta ve eklemek 100 μL değiştirilmiş Eagle 's asgari Essential Media her iyi HEPES ile tamponlu ve plaka RT 10 dakika stabilize izin.
- 100 x substrat 1 hacminin LCS seyreltme tamponu 19 hacimleri ile birleştirerek furimazin substrat hazırlayın (20 kat seyreltme)11, hücre kültürü orta ile karıştırmak için 5x stok oluşturma.
- Her bir kuyu için 25 μL 5x furimazin ekleyin ve 10 s için çevrelerde hafifçe karıştırın.
- RT 'de sinyal stabilizasyonu için 10 dakika boyunca Luminesans ölçmek.
Not: her iyi tepkisi normalleştirmek için bu taban çizgisi sinyali kullanarak, aynı zamanda transfeksiyon verimliliği, vb farklılıkların hücre sayısı farklılıklar neden farklılıkları azaltmak için yardımcı olacaktır. Hesaplanan bir kez, belirli bir ilaç tedavisi için çoğaltmak kuyuları normalleştirilmiş yanıt ortalama. - Modifiye kartal asgari Essential medya HEPES ile tamponlu 13.5 x ligand solüsyonu hazırlayın.
- 10 μL 13.5 x ligand ilavesi ile Oda sıcaklığında deneyler için, enjektörler veya çok kanallı pipet kullanarak bileşikleri ekleyin ve plakayı elle veya orbital Shaker (200 rpm 'de 20 s) kullanarak karıştırın.
- 10 μL 13.5 x ligand ilavesi ile 37,5 °C ' de deneyler için, cihaz orbital Shaker kullanarak bileşikleri ve karışımı dağıtmak için enjektörler kullanın. Enjektörleri kullanmıyorsanız, plakayı luminometreden çıkarın, ligleri ekleyin ve plakayı elle veya orbital Shaker (200 rpm 'de 20 s) kullanarak karıştırın.
Not: armataktaki plakayı kaldırarak ilgili sıcaklık dalgalanmalarını en aza indirmek için tespit aleti içinde Enjektörler ve bir shaker kullanın. Bu tahlil için standart standtop Luminometreler kullanılabilir. 0.25 – 2 s entegre süresini kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan prosedürü kullanarak, prototip GPCR ile iki β-tutucu isoform arasındaki etkileşimler izleniyor. Peptid reseptör (GLP-1R) gibi glukagon yapıları NheI ve EcoRI enzim kısıtlama siteleri içeren astar kullanılarak yapılmıştır ve vektörler pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] içine klonlanmış β-tutucu durumunda, iki ek vektörler β-arrestin1 durumunda β-arrestin2 ve NheI ve XhoI durumunda pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] kullanarak enzim kısıtlama siteleri Bgiıı ve EcoRI kullanılır. HEK293 hücreler 50 ng GLP-1R-lgbit/smbit ve 50 ng β-tutucu ile etiketlenmiş lgbit veya smbit N-veya C-terminali kullanılarak transfekte edildi. Dört farklı Plasmid kombinasyonu (Şekil 3) ve daha fazla deney için en yüksek Işıksaçan sinyal ile seçilmiş olan (Şekil 4). Her β-tutucu izoformu işe alma için EC50 değerlerini belirlemek amacıyla, doz tepkisi eğrileri 10 μm, 1 μm, 100 Nm, 10 Nm ve 1 Nm GLP-1 ligand konsantrasyonu kullanılarak yapılmıştır (Şekil 4c). Doz tepkisi eğrileri kinetik çalışmalarda her konsantrasyon maksimum tepki elde edildi (Şekil 4a, 4B).
Şekil 1 ' de. GLP-1R-β-arrestin1/2 yapısal tamamlayıcı tahlil tasarımında kullanılan vektörler multicloning sitelerin nükvotid dizileri.
GLP-1R-β-arrestin1/2 sistemi için yapısal uluslara tahlil geliştirmek amacıyla, pbit 1.1-c [TK/lgbit] ve pbit 2.1-c [TK/smbit] içinde enzimlerin kısıtlamaları nhei ve ecori kullanarak lgbit ve smbit ile C-Terminal GLP-1R etiket gerekli oldu Vektör. Β-arrestin1/2 durumunda, dört vektörde β-arrestin1 için β-arrestin2 ve NheI/XhoI için enzim kısıtlamaları BglII/EcoRI kullanarak C-ve N-terminalde LgBiT ve SmBiT ile etiketlenmiştir. Tüm vektörler, nonspesifik ilişkiyi en aza indirmek ve deneysel eserler azaltmak için HSV-TK promotör kullanın ve her vektör bakterilerde ampisilin direnci için bir ifade kaseti içerir. Görüntü referans 11 ' den uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2. GPCR şematik temsili: β-arrestin1/2 yapısal tamamlayıcı tahlil.
(a) nasıl GPCR: β-arrestin1/2 yapısal uluslara tahlil ligand varlığında çalışır. (b) lgbit veya smbit ile etiketlenmiş GPCR ve β-tutucu isoformlar için farklı Plasmid kombinasyonları yapısal temsili. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 ' ü. GLP-1R/β-tutucu oryantasyon taraması.
En yüksek hassasiyete sahip olmak için 4 farklı Plasmid kombinasyonu transfeksiyondan sonra 24 saat içinde ifade edildi. Sadece bir GLP-1R: β-tutucu oryantasyon (d) haricinde neredeyse tüm farklı Plasmid kombinasyonlarında (a-c) Işıksaçan sinyaller tespit edildi. Sonuçlar, yinelenen olarak gerçekleştirilen iki deneyin ortalama ± S.E.M. olarak ifade edilir; her yinelenen S.E.M. hesaplanmadan önce ortalamadan Oklar, hücrelerin 10 μM son konsantrasyonda GLP-1 ile tedavi edildiği zamanı gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4. GLP-1R-β-arrestin1/2 etkileşimleri doz bağımlı şekilde.
Β-arrestin2 (a) ve β-arrestin1 işe alma (b) dozunun bağımlı ligand ilişkisi. Β-arrestin1 ve β-arrestin2 arasında GLP-1R (c) ile diferansiyel işe alma gösteren doz tepkisi eğrileri. Sonuçlar, yinelenen olarak gerçekleştirilen iki deneyin ortalama ± S.E.M. olarak ifade edilir; her yinelenen S.E.M. hesaplanmadan önce ortalamadan Oklar, hücrelerin ilgili konsantrasyonlarda GLP-1 ile tedavi edildiği süreyi gösterir (10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM ve 1 nM, son konsantrasyonlar). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Vektör | Kullanılan enzim kısıtlaması | Primer sıra |
| pBiT 1.1-C [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] | Şahin | 5 ́-XXXXXXXXGAGCTCC(Rev sı)-3 ́ |
| EcoRI | 5 ́-XXXXXXXXGAATTCCC(Rev sı)-3 ́ | |
| XhoI, Vietnam | 5 ́-XXXXXXXXCTCGAGCC(Rev sı)-3 ́ | |
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] | Xho | 5 ́-XXXXXXXXCTCGAGCGGT (sı)-3 ́ |
| Şahin | 5 ́-XXXXXXXXGAGCTCAG(sı)-3 ́ | |
| EcoRI | 5 ́-XXXXXXXXGAATTCA(sı)-3 ́ |
Tablo 1. PBiT 1.1 ve pBiT 2.1 vektörler için bağlayıcı kodlama dizideki farklı kısıtlama enzim siteleri için astar dizileri.
Sı = ilgi dizisi; Rev sı = ilgi dizisinin tersine tamamlayıcı. Tablo referans 11 ' den uyarlanmıştır.
| Vektör | Bağlayıcı sırası | Kullanılan enzim kısıtlaması | ||
| pBiT 1.1-C [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] | SI-GLYalaglnglyasnserglyserserglyglyglyglyserglyglyglymorgly-(lgbit/smbit) | Şahin | ||
| SI-GLYasnserglyserserglyglyglyglyserglyglyglisgly-(lgbit/smbit) | EcoRI | |||
| SI-GLYserserglyglyglypogserglyglyglyglisergly-(lgbit/smbit) | XhoI, Vietnam | |||
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] | (LgBiT/SmBiT)-GlyserserglyglyglyserglyglyglyglyserSergly-sı | XhoI, Vietnam | ||
| (LgBiT/SmBiT)-Glyserserglyglypogerglyglyglygliserglyglyalagln-sı | Şahin | |||
| (LgBiT/SmBiT)-Glyserserglyglyglyserglyglyglygliserglyglyalaglnglyasnser-SI | EcoRI | |||
Tablo 2 ' ye. PBiT 1.1 ve pBiT 2.1 vektörler sacı, EcoRI veya XhoI kısıtlama siteleri ile ilgili bağlayıcı amino asit dizileri.
Kırmızı kalıntıları PCR astar tarafından kodlanmış olması gerekir. Tablo referans 11 ' den uyarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntemi kullanarak, herhangi bir GPCR ve β-arrestin1/2 arasındaki etkileşimler bu GPCR-β-tutucu yapısal tamamlayıcı tahlil kullanarak gerçek zamanlı yaşam sistemlerinde izlenebilir. Bu bağlamda, GLP-1R (prototip Sınıf B GPCR) tarafından iki β-tutucu isoform arasında diferansiyel β-tutucu işe alma izlenmesini başardık, biz de maksimum ulaştıktan sonra birkaç dakika reseptör-β-tutucu kompleksi bir ayrışma gözlenen Işıksaçan sinyal.
Yapısal tamamlayıcı tahlil sisteminde en iyi hassasiyete sahip olmak için, reseptör ile her β-tutucu izoformu arasındaki dört farklı uzamsal oryantasyon ile ekranlaştırılmış ve posterior için en yüksek Işıksaçan sinyal kullanılmıştır. doz reaksiyon stimülasyon eğrileri gibi çalışmalar (Şekil 4). Bu metodolojisi kullanarak, diabetes mellitus15gibi endokrinolojik hastalıklarda yüksek terapötik değeri olan bir GPCR kullanarak reseptör-β-tutucu etkileşimlerini karakterize etmek mümkün oldu. Aynı şekilde bu strateji kolayca herhangi bir GPCR için C-terminali LgBiT veya SmBiT ile ilgi GPCR etiketleme ve burada açıklanan β-arrestin1/2 yapıları kullanarak uyarlanabilir ve mevcut metodolojileri güçlü bir alternatif olarak ortaya çıkar olmadan donör ve alıcı arasındaki çakışan bir karmaşık kurmak gereksinimi BRET ve FRET bazı durumlarda olduğu gibi bir engel olabilir. Bir başka önemli avantajı da bu sistemde kullanılan vektörler endojen ifade düzeylerini taklit etmek için bir girişim düşük ifade Rehberleri içerdiğinden olmasıdır. Bu özellik ile reseptör ve/veya β-tutucu yüksek ifade seviyeleri nedeniyle spesifik olmayan dernekler olasılığını dışarı kural olabilir. Şekil 3 ve Şekil 4' te β-arrestin1 ile β-arrestin2 arasındaki reseptör-β-tutucu kompleksinde net bir fark vardır ve β-arrestin2 üzerinde β-arrestin1 karşı daha yüksek bir etkinlik ve yoğunluğa sahiptir. Dört farklı oryantasyon içine taramanın sistem endojen ifade seviyelerinde bile son derece hassas hale tahlil duyarlılığı artırmak için önerilmiştir.
Bu metodoloji çok düz ileri gerçekleştirmek için. Belki de bu protokol içinde en kritik adım, faiz reseptörü yükseltmek için primer tasarımıdır. Kullanıcı, Şekil 1 ' e göre kullanmak için ne kısıtlama enzim seçiminde çok dikkatli olmalı ve bu dayalı kırmızı vurgulanan amino asitler (Tablo 2) kodlamak için astar (Tablo 1) karşılık gelen nükleotid eklemek için.
Bu metodolojinin bir sınırlaması, furimazin 'in fizyolojik pH 'da ya da yakınında sulu bir çözelti içinde düşmesi, GPCR-β-tutucu etkileşimleri16' nın herhangi bir değişikliklerinden bağımsız olarak Luminesans yoğunluğunda aşamalı bir azalma sağlayacak olabilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için Kullanıcı her zaman uzun zaman dilimleri için lüminesans sürekli izlerken bir normalleştirme kontrolü (araç tedavi örnekleri) içermelidir. Bu furimazin bozulması oranını artırabilir varlığı beri tahlil sırasında fetal sığır serumu düşük düzeylerde kullanmak da önemlidir16. Tahlil sırasında ortaya çıkabilecek bir sorun, bilinen bir GPCR-β-tutucu etkileşimi için ışıldayan değerler için, dört farklı plazmid kombinasyonlarında temel satır değerlerine kıyasla önemli bir artış kaydedilmemektedir. Bu HSV-TK Organizatör17düşük ifade nedeniyle olabilir. Bu durumda, bir alternatif CMV Promoter kullanarak ifade vektörler içine LgBiT ve SmBiT füzyon proteinlerini kodlama açık okuma çerçeveleri subclone etmektir. Ne zaman daha güçlü bir organizatör için, nakledilmiş DNA miktarının optimizasyonu en iyi tahlil yanıtı elde etmek için yapılmalıdır değişiyor.
Bu yapısal uluslara assay kullanarak biz büyük bir doğruluk β-arrestin1/2 işe alma etkileşimleri prototip Sınıf B GPCR tarafından gözlemlemek başardık. Bu yöntemi kullanarak, GPCRs hedefleyen özellikle ilgi yeni ilaçlar farmakolojik karakterize mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirir.
Acknowledgments
Bu çalışma, bilim, BIT ve gelecekteki Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) araştırma programı (NRF-2015M3A9E7029172) tarafından hibe tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J.
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
- Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
- New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
- Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
