Summary
GPCR-β-מפיגור אינטראקציות הם שדה המתעוררים בגילוי סמים GPCR. מדויק, מדויק וקל להגדיר שיטות נחוצים כדי לפקח על אינטראקציות כאלה במערכות החיים. אנו מראים שיטת compleמנטציה מבנית לניטור GPCR-β-בפיגור בתאי החיים בזמן אמת, וזה יכול להיות מורחב לכל GPCR.
Abstract
אינטראקציות בין חלבון G מצמידים קולטנים (GPCRs) ו-β-הפיגור הם תהליכים חיוניים עם השלכות פיזיולוגיות של חשיבות רבה. כיום, האפיון של תרופות הרומן כלפי האינטראקציות שלהם עם β-מפיגור וחלבונים אחרים ציטוסולוריג הוא בעל ערך רב בתחום של גילוי תרופות GPCR במיוחד במהלך המחקר של GPCR מוטה האגניזם. כאן, אנו מראים את היישום של הרומן מבנה מבנית הספר כדי לפקח במדויק על β-מפיגור של אינטראקציות במערכות החיים בזמן אמת. שיטה זו היא פשוטה, מדויקת יכול להיות מורחב בקלות לכל GPCR של עניין וגם יש לו את היתרון כי הוא מתגבר על אינטראקציות לא ספציפיות עקב נוכחות של מקדם ביטוי נמוך נוכח בכל מערכת וקטורים. זה מבנה קומפלמנטציה מספקת תכונות מפתח המאפשרות ניטור מדויק ומדויק של קולטן-הβ-מפיגור האינטראקציות, מה שהופך אותו מתאים במחקר של אגוניזם מוטה של כל מערכת GPCR, כמו גם הסוף GPCR c-הטרמינוס ' זירחון קודים שנכתבו על ידי GPCR שונים (GRKs) ו פוסט-טרנסלtional שינויים של הפיגור הייצוב או יציבות הקולטן-β-מורכב.
Introduction
GPCRs מייצגים את היעד של כמעט 35% התרופות הנוכחיות בשוק1,2 והבנה ברורה של פרמקולוגיה שלהם הוא חיוני בפיתוח תרופות טיפוליות הרומן3. אחד ההיבטים המרכזיים בגילוי הסמים GPCR, במיוחד במהלך התפתחות של אגוניסטים מוטה הוא האפיון של ליגונים הרומן לקראת קולטן-β-מפיגור של אינטראקציות4 ו-β-מפיגור עם חלבונים אחרים ציטוסולונים כגון כקלרין5
זה תועד כי β-מפיגור איתות משחק תפקיד מפתח בהפרעות נוירולוגיות כגון הפרעה דו-קוטבית, דיכאון חמור, ו סכיזופרניה6 וגם תופעות לוואי חמורות בתרופות מסוימות כגון מורפיום7.
השיטות הנוכחיות המשמשות לניטור האינטראקציות הללו בדרך כלל לא מייצגים רמות אנדוגניים בפועל של החלבונים במחקר, במקרים מסוימים הם מראים אות חלשה, photobleaching לבנת ובהתאם GPCR זה יכול להיות מאתגרת טכנית להגדיר8. זה מבנה הרומן מבנית משתמש וקטורים ביטוי נמוך מקדם כדי לחקות רמות פיזיולוגיות אנדודוגני ומספק רגישות גבוהה לעומת שיטות נוכחיות9. באמצעות גישה זו, ניתן היה לאפיין בקלות את הקולטן Galanin-β-arrestin1/2 וגם β-arrestin2-clathrin רין אינטראקציות10. מתודולוגיה זו יכולה לשמש רבות לכל GPCR של עניין מסוים שבו β-הפיגור לשחק פונקציה פיזיולוגית מפתח או האיתות שלהם רלוונטי מחלות מסוימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פריימר אסטרטגיית עיצוב
- עיצוב התחל להציג גנים של עניין לתוך pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] וקטורים.
- בחר לפחות אחד משלושת האתרים האלה כאחד משני אנזימי ההגבלה הייחודיים הדרושים לשכפול כיוונים בשל נוכחותם של מסגרת עצירה במסגרת שמפרידה את האתר הרב כמוצג באיור11.
- שילוב רצף נוקלאוטיד לתוך התחל כפי שמוצג בטבלה 1 כדי לקודד את שאריות המקשר המוצגים באדום בטבלה 211.
- עבור pbit 1.1-c [tk/lgbit] ו-pbit 2.1-c [tk/smbit] וקטורים, ודא כי 5 התחל מכיל atg קודון רצף הסכמה חזקה של קוזק (gccgccacc).
- עבור pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] וקטורים, להבטיח כי 3 התחל מכיל לעצור codon.
הערה: כל וקטור מכיל את היזם HSV-TK כדי למזער שיוך לא ספציפי ולהפחית את הממצאים הניסיוניים, גם לכל וקטור יש קלטת ביטוי עבור עמידות אמפיצילין בחיידקים.
2. PCR
- להגדיר ולהפעיל את התגובות PCR כדי להגביר את ה-DNA להוסיף את הגן של העניין באמצעות התחל מעוצב משלב 1. חשוב להשתמש באמינות גבוהה DNA פולימראז כדי למזער מוטציות.
- השתמש בדיוק בסדר הבא כדי להכין 50 μL של תגובת ה-PCR. להוסיף 35.5 μL של מים מזוקקים, 5 μL של 10x פולימראז מאגר, 5 μL של התערובת dNTP (2.5 mM כל אחד), 1 μL של תבנית פלאמיד (200 ng/μL), 1.25 μL של קדימה והפוך תחל (10 μM) ו-1 μL של באיכות גבוהה פולימראז (5 U/
- שימוש בציקלטרזה הגדיר את תוכנית הגברה הבאה של הדנ א
- הספרות 95 ° c עבור 5 דקות.
- חזור על 25 פעמים את המחזור התרמי הבא: 95 ° צ' עבור 30 s, 60 ° c עבור 1 דקות, 72 ° צ' עבור 2 דקות לכל 1 kbp להיות הוגדל.
- הפעל הארכה אחרונה ב 72 ° c עבור 10 דקות.
- החזיקו את הדגימות ב -4 ° c בתוך הציקלטרנר התרמוטראני.
הערה: מומלץ מאוד להשתמש פולימראז באיכות גבוהה כדי למזער את מוטציות הנקודה במיוחד אלה המתרחשים במהלך הגברה של רצפים ארוכים. כמו אמפליקון הופך ארוך יותר, מידת הדיוק של השכפול של ה-DNA פוחתת. עבור תגובת ה-PCR, בחר את טמפרטורת הריפוי המבוססת על טמפרטורת ההיתוך של האזור שבו האוליגוס ישירות מhybridize עם תבנית ה-DNA ולא עם כל הרצף של המפתח.
- מוצרים לטיהור
- בודד את מוצר ה-PCR משאר תגובת ה-PCR באמצעות ערכה מיצרן של העדפה12. מוצר ה-PCR מוכן כעת לעיכול הגבלה.
3. העיכול
- עבור העיכול המוצר PCR להכין 50 μL של תגובת העיכול כדלקמן.
- באמצעות שפופרת 1.5 mL, להוסיף 12 μL של מים מזוקקים.
- הוסף 5 μL של מאגר 10x עם התאימות הטובה ביותר עם אנזימי הגבלה.
- משלב 2.4 להוסיף 30 μL של המוצר PCR
- לבסוף, הוסף 1.5 μL של כל אנזים הגבלה.
- לערבב בקצרה על ידי מערבולת ו-מודטה ב 37.5 ° c בלילה.
- עבור העיכול של המטופל הפלמיד להכין 50 μL של תגובת העיכול כדלקמן:
- באמצעות שפופרת 1.5 mL, להוסיף 23 μL של מים מזוקקים.
- הוסף 5 μL של מאגר 10x עם התאימות הטובה ביותר עם אנזימי הגבלה.
- להוסיף 15 μL של הנמען פלמיד (200 ng/μL).
- הוסף 1.5 μL של כל אנזים הגבלה.
- לערבב בקצרה על ידי מערבולת ו-מודטה ב 37.5 ° c בלילה.
הערה: חשוב להשתמש 3 μg של מרכז הניקוי של הנמען על מנת להשיג חומר מספיק לאחר בדיקת ה-DNA ג'ל טיהור. זה גם רלוונטי לעזוב את העיכול DNA לילה באמצעות שתי האנזימים כדי להשיג יעילות שיבוט גבוהה.
4. דנ א ג'ל לטיהור ושיבוט
- הכן 1% agarose ג'ל להפעיל את ה-DNA מתעכל באמצע ומוסיף ולהמשיך לחתוך את הלהקות המתאימות. לאחר להקות וקטור המקביל להוסיף כבר purified12, לקבוע את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרוסקופיה.
- בצע הארכה ל-DNA כדי להחדיר את ההכנסה לפלאמיד הנמען.
- להכין תגובות הנוגע בסביבות 100 ng של דנ א סה כ כולל 50 ng וקטור פלמיד.
- כוונן את היחס הבין-פלסטי לנמען של כ-1:3; ניתן לחשב אותו באמצעות מחשבון מוסף וקטורי13.
- כוונן פקדים שליליים במקביל. לדוגמה, הארכה של ה-DNA של הנמען ללא כל הוספה תספק מידע לגבי מידת הרקע של האדם הבלתי מתעכל או הליגמיד של הנמען.
5. טרנספורמציה של שיבוטים
- מניחים שפופרת של תאים DH5α המוסמכת מהמקפיא ב-80 ° c ומיד להעביר אותו על הקרח 20 דקות.
- לאחר מכן, לקחת 55 μL של DH5α תאים מוכשרים ולהוסיף 4 μL של תגובה לאחר ולערבב על ידי מצליף הצינור ולאחסן על קרח עבור 45 דקות.
- מניחים את הצינור באמבט מים שחומם בעבר ב 42 ° צ' עבור בדיוק 48 s ומיד לקבל את הצינורות חזרה על הקרח עבור 3 דקות נוספות.
- הוסף 600 μL של לוריא ציר (LB) בינוני שחומם בעבר 37.5 ° צ' ו דגירה עם רעד עבור 1 שעה ב 200 rpm.
- העבר 200 μL לצלחת אגר המכיל אמפיצילין 100 μg/mL ולהתפשט בעדינות על פני השטח עם הנוזל הוא נספג בעיקר.
- כדי לראות את המושבות. בבוקר הבא הנמען הפלמיד על לוחית ההכנסה צריך להיות באופן משמעותי יותר מושבות מאשר הנמען לבדו פלמיד לבד.
6. בידוד פלמיד המוגמר
- לבחור 3-10 מושבות חיידקי בודדים להעביר לתוך 1 מ ל של LB בינונית המכילה אמפיצילין (100 μg/mL) ו-דגירה עבור 6 h.
- קח 200 μL של השעיה בקטריאלי והעברה 5 מ ל ליברות בינונית המכילה את אותו ריכוז של אמפיצילין כמו בשלב 6.1 ו דגירה לילה ב 37.5 ° צ' עם טלטול ב 200 rpm.
- באמצעות מיני הכנה לטיהור ערכת ה-dna, לבצע מיני הכנה DNA משתמש באמצעות 5 מ ל של LB גדל לילה לאחר הוראות היצרן14.
- כדי לזהות הטיות מוצלחות, הגדר את תגובות ה-PCR באותו אופן כמו בסעיף 2 באמצעות ה-DNA המתקבל משלב 6.3 כתבנית עם אותו התחל כמו בסעיף 2 במהלך ה-PCR הראשון. שיבוטים חיוביים יפיק מוצרים PCR עם הגודל המתאים.
- לאחר טיהור גדול ה-DNA להכנה של שיבוטים חיוביים, התנהלות הגבלת העיכול של 500 ng של דנ א מטוהרים עם אנזימים המשמשים בשלב השיבוט ולהפעיל את המוצרים מתעכל על 1% agarose ג'ל. צריך להיות שתי להקות: אחד בגודל של הווקטור ואחד בגודל של הכנס החדש.
- בדוק את רצף הבנייה לפי רצף באמצעות התחל הבאה: קדימה 5 '-aaggtgacgcgaac-3 ' והפוך 5 '-gcatttttttcttagtt-3 '.
הערה: כאשר ה-DNA משוכפל באמצעות ה-PCR, תמיד יש את האפשרות של שגיאות במהלך הגברה גם כאשר באמצעות פולימאז באיכות גבוהה, ולכן חשוב מאוד לרצף את המבנים הסופיים.
7. מעבר וביטוי חלבונים
- ב בעבר פולי-L-ליזין מצופה לבן 96 היטב צלחת, לבצע זריעת תאים יום אחד לפני היפוך ב 2.5 x 104 תאים לכל טוב באמצעות בינונית שונה של הנשר של דולבקו שיושלם עם 10% סרום שור עוברי, 100 U/ML פניצילין G, and 100 μg/ סטרפטומיצין mL.
- השתמש רק 60 הבארות הפנימיות כדי למזער את הפוטנציאל עבור מעברי חום על פני הצלחת ואפקטים הקצה מן האידוי. הוסף 200 μL של מים מזוקקים סטרילי כדי 36 בארות מחוץ ו 150 μL ב החללים בין בארות ו-דגירה הלילה ב 37.5 ° צ' ו 5% של CO2.
- למחרת בבוקר לבצע החצייה באמצעות 100 ng של דנ א מוחלט (50 ng כל בניית).
- כוונן ארבע שילובים שונים פלביניים (קולטן: β-בפיגור) לפי איור 2b.
- עבור כל להשתמש בשילוב פלסטלינה 20 μL של שונה מדיה חיוניים מינימלי של הנשר באגירה עם HEPES באמצעות 0.3 μL של מגיב התקשורת הליפידית לטובה.
- הוסף 20 μL של העברה למעלה מגיב-DNA לתערובת היטב ולערבב את הצלחת במעגלים עבור 10 s.
- שינוי מדיום טרי לאחר 6 שעות דגירה ב 37.5 ° צ' ו 5% CO2.
- מודקת את הצלחת 24 שעות ב 37.5 ° צ' ו 5% CO2.
8. קולטן ניטור-β-arrestin1/2 אינטראקציות ב HEK293 תאים
- המדיום להוסיף ומוסיפים 100 μL של שינוי מדיה חיוניים מינימלי של הנשר באגירה עם HEPES לכל באר ולתת את הצלחת לייצב ב RT עבור 10 דקות.
- להכין את המצע הזועם על ידי שילוב 1 נפח של מצע 100x עם 19 כרכים של מאגר דילול LCS (דילול 20-קיפול)11, יצירת מלאי 5x לערבב עם מדיום תרבות התאים.
- הוסף 25 μL של 5x הזועם כל טוב ולערבב בעדינות עיגולים עבור 10 s.
- מדידת האור עבור 10 דקות עבור ייצוב אותות ב RT.
הערה: על-ידי שימוש באות בסיסית זו כדי לנרמל את התגובה של כל באר, היא תסייע להפחית את השונות שנגרמת כתוצאה מהבדלים במספר התאים המצופה בטוב, גם הבדלים ביעילות הדרך ועוד. לאחר חישוב, ממוצע התגובה המנורמלת משכפול בארות עבור טיפול תרופתי מסוים. - הכינו 13.5 x ליגנד פתרון ב שינוי מינימלי של הנשר מדיה חיוניים באגירה עם hepes.
- עבור ניסויים בטמפרטורת החדר עם 10 μl של 13.5 x ליגנד בנוסף, להוסיף את תרכובות באמצעות מרססים או פיפטה רב-ערוצי ולערבב את הצלחת ביד או באמצעות שייקר מסלולית (20 s ב 200 rpm).
- לניסויים ב 37.5 ° c עם 10 μl של 13.5 x ליגנד בנוסף, מרססים להשתמש כדי לחלק תרכובות ולערבב באמצעות מכשיר מסלולית שייקר. במקרה של לא שימוש מרססים, להסיר את הצלחת מן הלומטר, להוסיף את הליטרים ולערבב את הצלחת ביד או באמצעות שייקר מסלולית (20 s ב 200 rpm).
הערה: השימוש מרססים ו שייקר בתוך כלי הזיהוי כדי למזער תנודות בטמפרטורה הקשורים להסרת הצלחת מתוך לומימטר. ניתן להשתמש באפשרות זו באמצעות מדידת שחקן רגיל לשימוש עבור שיטת הפעולה. השתמש בזמן שילוב של 0.25 – 2 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך המוצג כאן, אינטראקציות בין הפרוטוקול GPCR ושני β בפיגור היו מנוטרים. Glucagon כמו קולטן פפטיד (GLP-1r) בנייה נעשו באמצעות התחל המכיל NheI ו EcoRI אתרי הגבלת אנזימים משוכפל לתוך וקטורים pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] תוך במקרה של β-הפיגור, שני וקטורים נוספים היו השתמשו ב-pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] באמצעות אתרי הגבלת אנזימים BgIII ו EcoRI במקרה של β-arrestin2 ו-NheI ו XhoI במקרה של β-arrestin1. תאים HEK293 היו מזוהמים באמצעות 50 ng של GLP-1r-LgBiT/SmBiT ו 50 ng של β-בפיגור עם LgBiT או SmBiT ב N-או C-טרמינל. ארבעה שילובי פלביניים שונים הוקרן (איור 3) והאחד עם האות הזורח הגבוה ביותר נבחר לניסויים נוספים (איור 4). על מנת לקבוע את ערכי EC50 עבור כל גיוס β בפיגור, מינון עקומות התגובה בוצעו באמצעות 10 μm, 1 μm, 100 nm, 10 ננומטר ו 1 ננומטר של glp-1 ליגנד ריכוז (איור 4c). התגובה עקומות מינון התקבלו מהתגובה המקסימלית של כל ריכוז ממחקרים קינטית (איור 4א, 4b).
איור 1. נוקלאוטיד רצפי האתרים הרב של הווקטורים המשמשים בעיצוב של GLP-1r-β-arrestin1/2 שיטת מבנה מבנית.
כדי לפתח את המערכת הקומפלמנטציה מבנית עבור GLP-1r-β-arrestin1/2 מערכת, היה צורך לתייג ב C-טרמינל GLP-1r עם LgBiT ו SmBiT באמצעות הגבלות אנזימים NheI ו EcoRI ב-pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] ו pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] וקטור. במקרה של β-arrestin1/2 הם גם תויגו עם LgBiT ו SmBiT ב C-ו N-מסוף באמצעות הגבלות אנזים BglII/EcoRI עבור β-arrestin2 ו NheI/XhoI עבור β-arrestin1 בארבעת וקטורים. כל וקטורים להשתמש ביזם HSV-TK כדי למזער שיוך לא ספציפי ולהפחית את הממצאים הניסיוניים וכל וקטור מכיל קלטת ביטוי עבור עמידות אמפיצילין בחיידקים. התמונה הותאמה מהפניה 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
. איור 2 ייצוג סכימטי של GPCR: β-arrestin1/2 שיטת השלמת מבנה מבנית.
(א) כיצד gpcr: β-arrestin1/2 שיטת הקומפלמנטציה מבנית פועלת בנוכחות ligand. (ב) ייצוג מבנית של שילובי פלביניים שונים עבור gpcr ו β בפיגור שתויגו עם lgbit או SmBiT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
. איור 3 הקרנת כיוון של GLP-1r/β.
על מנת לקבל את הרגישות הגבוהה ביותר 4 שילובים שונים פלביניים הביעו במהלך 24 שעות לאחר הזיהום. אותות זורח זוהו כמעט כל שילובי פלביניים שונים (a-c) למעט רק glp-1r אחד: β-בפיגור כיוון (d). התוצאות מתבטאות כממוצע ± S.E.M. של שני ניסויים שבוצעו בשכפול; כל כפילות הממוצע לפני חישוב S.E.M. החצים מציינים את הזמן שבו התאים טופלו GLP-1 ב 10 μM ריכוז סופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. האינטראקציות GLP-1r-β-arrestin1/2 הן באופן התלוי במינון.
ליגיון תלויי-מינון של β-arrestin2 (a) ו-β-arrestin1 הגיוס (ב). מינון התגובה עקומות מראה גיוס דיפרנציאלי בין β-arrestin1 ו β-arrestin2 על ידי GLP-1r (ג). התוצאות מתבטאות כממוצע ± S.E.M. של שני ניסויים שבוצעו בשכפול; כל כפילות הממוצע לפני חישוב S.E.M. החצים מציינים את הזמן שבו התאים טופלו GLP-1 בריכוזים המתאימים (10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 ננומטר ו 1 ננומטר, הריכוזים הסופיים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| וקטור | הגבלת אנזימים המשמשת | תחל |
| pBiT 1.1-C (TK/LgBiT)/pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] | SacI | 5 זה-XXXXXXXXGAGCTCC(Rev SI)-3. |
| מיכל שכטר | 5-המשך-3 | |
| קסהוי | 5-המשך-3 | |
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] | קסהו | 5 הדקות הנוספות (סי)-3 |
| SacI | 5 זה-XXXXXXXXGAGCTCAG(סי)-3 | |
| מיכל שכטר | . חמשמתוך שלוש |
. שולחן 1 רצפי התחל עבור אתרי אנזים הגבלה שונים ברצף קידוד של המקשר עבור pBiT 1.1 ו-pBiT 2.1 וקטורים.
SI = רצף של עניין; Rev SI = משלים הפוך של רצף הריבית. הטבלה הותאמה מהפניה 11.
| וקטור | רצף מקשר | הגבלת אנזימים המשמשת | ||
| pBiT 1.1-C (TK/LgBiT)/pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] | סי-מאלסלגליםסרגליגליםגליסשוש-שטיפה (lgbit/SmBiT) | SacI | ||
| סי-מססרגליסמגליםגלינגשוש-(Lgbit/SmBiT) | מיכל שכטר | |||
| סי-ובכן-שטיפה-גליגלישוש-(Lgbit/SmBiT) | קסהוי | |||
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] | (LgBiT/SmBiT)-גליסראגליגליגליםגליגליגליגליסר-סי | קסהוי | ||
| (LgBiT/SmBiT)-גליססרגליגליגליםגליסמגליגלגליגליםגלישוש-סי | SacI | |||
| (LgBiT/SmBiT)-גליססרגליגליגליםגליסמגליגליסמאנגליסגליסמאנגליםהאנגליסמניסמאנסביאנםגליסמאנשוש-סי | מיכל שכטר | |||
. שולחן 2 מקשר רצפי חומצות אמינו הקשורים עם SacI, EcoRI או XhoI אתרי הגבלה ב-pBiT 1.1 ו-pBiT 2.1 וקטורים.
שאריות אדומים צריכים להיות מקודדים. על ידי התחל של ה-PCR הטבלה הותאמה מהפניה 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות השיטה המוצגת כאן, אינטראקציות בין כל GPCR ו β-arrestin1/2 יכול להיות מנוטרים בזמן אמת מערכות החיים באמצעות זה GPCR-β-בפיגור מבניים שיטת השלמת. בהקשר זה, היינו מסוגלים לצפות הβ הדיפרנציאלי מפיגור הגיוס בין שני β-מפיגור של שניים על ידי GLP-1r (מחלקה פרוטו אופיינית B GPCR), ראינו גם דיסוציאציה של הקומפלקס קולטן-β-בפיגור כמה דקות לאחר שהגיע המקסימום . אות זורח
על מנת לקבל את הרגישות הטובה ביותר במערכת מבנית מבנה מבניים, זה הוקרן עם ארבעה מרחבי מרחבית שונים בין הקולטן ואת כל β בפיגור והאחד עם האות זורח הגבוהה ביותר שימש האחורי מחקרים כגון עקומות גירוי במינון (איור 4). בעזרת מתודולוגיה זו ניתן היה לאפיין את האינטראקציות של קולטן-β סטין באמצעות GPCR של ערך תרפויטי גבוה במחלות endocrinological כגון סוכרת15. באותו אופן אסטרטגיה זו ניתן להתאים בקלות לכל GPCR על ידי תיוג פשוט של GPCR של עניין עם LgBiT או SmBiT בטרמינל C ובאמצעות β-arrestin1/2 בנייה תיאר כאן וזה מתגלה כחלופה רבת עוצמה למתודולוגיות נוכחיות ללא הצורך של מורכב להגדיר איפה החופפים בין התורם והקבלה יכול להיות מכשול כמו במקרים מסוימים של ברט ו לדאוג. יתרון משמעותי נוסף הוא שווקטורים המשמשים במערכת זו מכילים היזמים ביטויים נמוכים בניסיון לחקות רמות ביטוי אנדוגני. עם תכונה זו, אנו יכולים לשלול את האפשרות של אסוציאציות שאינן ספציפיות בשל רמות ביטויים גבוהים של קולטן ו/או β-הפיגור. באיור 3 ואיור 4, יש הבדל ברור בβ הקולטן-הפיגור בין β-arrestin1 מול β-arrestin2 וגם יעילות גבוהה יותר ואינטנסיביות כלפי β-arrestin1 על β-arrestin2. ההקרנה לארבעה כיוונים שונים הוצע כדי להגביר את הרגישות של השיטה הופכת את המערכת רגישה מאוד גם ברמות ביטוי אנדוגניים.
מתודולוגיה זו מאוד ישר קדימה לביצוע. אולי הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא העיצוב הפריימר להגביר את קולטן הריבית. המשתמש חייב להיות זהיר מאוד בבחירת האנזים ההגבלה להשתמש על פי איור 1 ומבוסס על זה כדי להוסיף את הנוקלאוטידים המתאימים התחל (טבלה 1) כדי לקודד את חומצות אמינו אדום מודגש (שולחן2).
מגבלה אחת של מתודולוגיה זו יכולה להיות כי הפוריפין יהיה לבזות בתמיסה מימית או בסמוך ל-pH פיסיולוגיים, המוביל לירידה הדרגתית באינטנסיביות האור ללא תלות בכל שינוי GPCR-β-מפיגור של אינטראקציות16. כדי להתגבר על מגבלה זו, על המשתמש לכלול תמיד בקרת נורמליזציה (דגימות טיפול ברכב) כאשר ברציפות ניטור האור לפרקי זמן מורחבים. חשוב גם להשתמש ברמות נמוכות של סרום העוברי העובר במהלך הקיום מאז נוכחותה היא עשויה להגדיל את שיעור השפלה הזועם מאזן16. בעיה אחת שעלולה להתעורר במהלך התהליך הוא כי ערכים זורח עבור התקשורת GPCR-β-מפיגור יכול להיות לא העלאה משמעותית רשום לעומת ערכי קו הבסיס בכל ארבעת שילובים שונים פלביניים. זה יכול להיות בגלל הביטוי נמוך מ-HSV-TK יזם17. במקרה זה, חלופה אחת היא לשכפל את שיבוט של מסגרות קריאה פתוח בקידוד LgBiT ו SmBiT היתוך חלבונים לתוך וקטורים ביטוי באמצעות מקדם CMV. בעת שינוי ליזם חזק יותר, אופטימיזציה של כמות ה-DNA המועבר צריך להיעשות על מנת להשיג את התגובה הטובה ביותר של שיטת העבודה.
שימוש באותו מבנה קומפלמנטציה מבנית היינו מסוגלים להתבונן עם דיוק רב β-arrestin1/2 היחסי גיוס על ידי מחלקה אופיינית B GPCR. באמצעות שיטה זו, ניתן לאפיין באופן תרופתי תרופות הרומן של עניין מיוחד המיקוד GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מתוכנית המחקר (NRF-2015M3A9E7029172) של הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד המדע, התקשוב, ותכנון עתידי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J.
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
- Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
- New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
- Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
