Summary
GPCR----Arrestin-Wechselwirkungen sind ein aufstrebendes Feld in GPCR-Medikamentenentdeckung. Genaue, präzise und einfach einzurichtende Methoden sind notwendig, um solche Wechselwirkungen in lebenden Systemen zu überwachen. Wir zeigen einen strukturellen Komplementierungstest zur Überwachung der GPCR----Arrestin-Interaktionen in Echtzeit lebenden Zellen und können auf jede GPCR erweitert werden.
Abstract
Wechselwirkungen zwischen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und A-Arrestinen sind lebenswichtige Prozesse mit physiologischen Implikationen von großer Bedeutung. Derzeit ist die Charakterisierung neuartiger Medikamente in Bezug auf ihre Wechselwirkungen mit '-Arrestinen und anderen zytosolischen Proteinen im Bereich der GPCR-Medikamentenentdeckung besonders während der Untersuchung des GPCR-voreingenommenen Agonismus äußerst wertvoll. Hier zeigen wir die Anwendung eines neuartigen strukturellen Komplementierungs-Assays zur genauen Überwachung von Rezeptor----Arrestin-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen. Diese Methode ist einfach, genau und kann leicht auf jede GPCR von Interesse erweitert werden und hat auch den Vorteil, dass sie unspezifische Wechselwirkungen aufgrund des Vorhandenseins eines Low-Expression-Promotors in jedem Vektorsystem überwindet. Dieser strukturelle Komplementierungstest bietet Schlüsselmerkmale, die eine genaue und präzise Überwachung der Rezeptor---Arrestin-Wechselwirkungen ermöglichen, wodurch er für die Untersuchung des voreingenommenen Agonismus eines BELIEBIGEN GPCR-Systems sowie der GPCR-c-terminus-Phosphorylierung geeignet ist. Codes' geschrieben von verschiedenen GPCR-Kinasen (GRKs) und post-translationale Modifikationen von Arrestinen, die den Rezeptor---Arrestin-Komplex stabilisieren oder destabilisieren.
Introduction
GPCRs stellen das Ziel von fast 35% der aktuellen Medikamente auf dem Markt1,2 dar, und ein klares Verständnis ihrer Pharmakologie ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Medikamente3. Einer der Schlüsselaspekte bei der Entdeckung von GPCR-Medikamenten, insbesondere bei der Entwicklung von voreingenommenen Agonisten, ist die Charakterisierung neuartiger Liganden hin zu Rezeptor---Arrestin-Wechselwirkungen4 und wie clathrin5.
Es wurde dokumentiert, dass die abhängige Signalisierung von '-arrestin eine Schlüsselrolle bei neurologischen Störungen wie bipolarer Störung, schwerer Depression und Schizophrenie6 sowie schweren Nebenwirkungen in einigen Medikamenten wie Morphin7spielt.
Aktuelle Methoden zur Überwachung dieser Wechselwirkungen stellen in der Regel keine tatsächlichen endogenen Werte der Proteine in der Studie dar, in einigen Fällen zeigen sie schwaches Signal, Photobleichung und je nach GPCR könnte es technisch schwierig sein,8einzurichten. Dieser neuartige strukturelle Komplementierungstest verwendet Vektoren mit niedrigem Ausdruckspromotor, um endogene physiologische Werte nachzuahmen und bietet eine hohe Empfindlichkeit im Vergleich zu aktuellen Methoden9. Mit diesem Ansatz war es möglich, Galanin-Rezeptor---Arrestin1/2 und auch die Wechselwirkungenvon10 -, arrestin2-clathrin, leicht zu charakterisieren. Diese Methode kann weit verbreitet für jede GPCR von besonderem Interesse verwendet werden, wo die '-Arrestine eine wichtige physiologische Funktion spielen oder ihre Signalisierung bei einigen Krankheiten relevant ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Primer Design-Strategie
- Designprimer zur Einführung von Genen von Interesse in pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] und pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.
- Wählen Sie mindestens einen dieser drei Standorte als eines der beiden einzigartigen Restriktionsenzyme aus, die für das richtungsweisende Klonen aufgrund des Vorhandenseins eines In-Frame-Stop-Codons benötigt werden, das die Multiklonierungsstelle teilt, wie in Abbildung 111dargestellt.
- Integrieren Sie die Nukleotidsequenz in die Primer, wie in Tabelle 1 dargestellt, um die in Tabelle 211rot dargestellten Linkerrückstände zu kodieren.
- Stellen Sie bei pBiT1.1-C [TK/LgBiT] und pBiT2.1-C [TK/SmBiT] Vektoren sicher, dass der 5-Primr ein ATG-Codon und eine potente Kozak-Konsenssequenz (GCCGCCACC) enthält.
- Stellen Sie bei pBiT1.1-N [TK/LgBiT] und pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vektoren sicher, dass die 3-Grundierung ein Stop-Codon enthält.
HINWEIS: Jeder Vektor enthält den HSV-TK-Promoter, um unspezifische Assoziationen zu minimieren und experimentelle Artefakte zu reduzieren, auch hat jeder Vektor eine Expressionskassette für ampicillin Resistenz in Bakterien.
2. PCR
- Einrichten und Ausführen von PCR-Reaktionen zur Verstärkung der Insert-DNA des gens von Interesse mit den Primern, die aus Schritt 1 entwickelt wurden. Es ist wichtig, eine hochtreue DNA-Polymerase zu verwenden, um Mutationen zu minimieren.
- Verwenden Sie genau die folgende Reihenfolge, um 50 l PCR-Reaktion vorzubereiten. Fügen Sie 35,5 l destilliertes Wasser, 5 l 10x Polymerase-Puffer, 5 l dNTP-Mischung (je 2,5 mM), 1 l Plasmidschablone (200 ng/l), 1,25 l Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung (10 m) und 1 l Hochtreuepolymerase (5 U/L) hinzu.
- Richten Sie mit einem Thermocycler das folgende DNA-Amplifikationsprogramm ein.
- Denatur bei 95 °C für 5 min.
- Wiederholen Sie 25 Mal den folgenden thermischen Zyklus: 95 °C für 30 s, 60 °C für 1 min, 72 °C für 2 min pro 1 kbp zu verstärken.
- Führen Sie eine Endverlängerung bei 72 °C für 10 min.
- Halten Sie die Proben bei 4 °C im Thermocycler.
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, eine Hochtreuepolymerase zu verwenden, um Punktmutationen zu minimieren, insbesondere solche, die während der Amplifikation langer Sequenzen auftreten. Wenn das Amplikon länger wird, nimmt der Grad der Genauigkeit bei der Replikation der DNA ab. Für die PCR-Reaktion wählen Sie die Glühtemperatur basierend auf der Schmelztemperatur der Region, in der die Oligos direkt mit der DNA-Vorlage und nicht mit der gesamten Sequenz des Primers hybridisieren.
- PCR-Produktreinigung
- Isolieren Sie das PCR-Produkt vom Rest der PCR-Reaktion mit einem Kit eines Herstellers von Präferenz12. Das PCR-Produkt ist nun bereit für die Restriktionsverdauung.
3. DNA-Verdauung
- Für das PCR-Produkt Verdauung bereiten 50 l der Verdauungsreaktion wie folgt.
- Mit einem 1,5 ml-Rohr 12 l destilliertes Wasser hinzufügen.
- Fügen Sie 5 l 10x Puffer mit der besten Kompatibilität mit beiden Restriktionsenzymen hinzu.
- Ab Schritt 2.4 30 L PCR-Produkt hinzufügen
- Fügen Sie schließlich 1,5 l jedes Restriktionsenzyms hinzu.
- Kurz durch Wirbel mischen und bei 37,5 °C über Nacht inkubieren.
- Für den Empfänger Plasmid Verdauung bereiten 50 L der Verdauungsreaktion wie folgt:
- Mit einem 1,5 ml-Rohr 23 l destilliertes Wasser hinzufügen.
- Fügen Sie 5 l 10x Puffer mit der besten Kompatibilität mit beiden Restriktionsenzymen hinzu.
- Fügen Sie 15 l des Empfänger-Plasmids (200 ng/L) hinzu.
- Fügen Sie 1,5 l jedes Restriktionsenzyms hinzu.
- Kurz durch Wirbel mischen und bei 37,5 °C über Nacht inkubieren.
HINWEIS: Es ist wichtig, 3 g Empfängerplasmid zu verwenden, um nach der Reinigung des DNA-Agarose-Gels ausreichend Material zu erhalten. Es ist auch relevant, DNA-Verdauungen über Nacht mit beiden Enzymen zu verlassen, um eine hohe Kloneffizienz zu erhalten.
4. DNA-Agarose-Gel-Reinigung und Klonen
- Bereiten Sie ein 1% Agarose-Gel vor, um das verdaute DNA-Plasmid und die Einsätze auszuführen, und schneiden Sie die entsprechenden Bänder. Sobald die entsprechenden Vektor- und Insert-Bänder gereinigt sind12, bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
- Führen Sie eine DNA-Ligation durch, um den Einsatz mit dem Empfängerplasmid zu verschmelzen.
- Bereiten Sie Ligationsreaktionen von etwa 100 ng der gesamten DNA einschließlich 50 ng Desplasmidvektor.
- Einrichten des Empfänger-Plasmid-Insert-Verhältnisses von ca. 1:3; es kann mit einem Vektor-Insert-Rechner berechnet werden13.
- Richten Sie negative Steuerelemente parallel ein. Zum Beispiel wird eine Ligation der Empfänger-Plasmid-DNA ohne Insert Informationen darüber liefern, wie viel Hintergrund des unverdauten oder selbstligatierenden Empfängerplasmids vorhanden ist.
5. Transformation von Klonen
- Legen Sie eine Röhre von DH5- kompetenten Zellen aus dem Gefrierschrank bei -80 °C und übertragen Sie sie sofort für 20 min auf Eis.
- Nehmen Sie danach 55 l DH5-fähige Zellen und fügen Sie 4 l Ligationsreaktion hinzu und mischen Sie sie, indem Sie das Rohr flicken und 45 min auf Eis lagern.
- Legen Sie das Rohr in ein Wasserbad, das zuvor bei 42 °C für genau 48 s erwärmt wurde, und bringen Sie die Rohre sofort für weitere 3 min wieder auf Eis.
- Luria Broth (LB) Medium zuvor bei 37,5 °C erwärmt und 1 Stunde bei 200 Rpm mit Schütteln bebrüten.
- Übertragen Sie 200 l in eine Agarplatte, die Ampicillin 100 g/ml enthält, und wird mit der Flüssigkeit vorsichtig über die Oberfläche verteilt.
- Inkubieren Sie die Platten über Nacht, um die Kolonien am nächsten Morgen zu sehen. Das Empfängerplasmid auf der Insert-Platte sollte deutlich mehr Kolonien haben als das Empfängerplasmid allein.
6. Isolierung des fertigen Plasmids
- 3-10 einzelne Bakterienkolonien pflücken und in 1 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 g/ml) übertragen und 6 h brüten.
- Nehmen Sie 200 l bakterielle Suspension und übertragen Sie auf 5 ml MEDIUM mit der gleichen Konzentration von Ampicillin wie in Schritt 6.1 und inkubieren Sie über Nacht bei 37,5 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute.
- Mit einem Miniprep DNA-Kit Reinigung, führen Miniprep DNA-Reinigungen mit 5 ml über Nacht nach den Anweisungen des Herstellers14.
- Um erfolgreiche Ligationen zu identifizieren, richten Sie PCR-Reaktionen auf die gleiche Weise ein wie in Abschnitt 2 unter Verwendung der DNA aus Schritt 6.3 als Vorlage mit den gleichen Primern wie in Abschnitt 2 während der ersten PCR. Positive Klone produzieren PCR-Produkte mit der entsprechenden Größe.
- Führen Sie nach großer Vorbereitungs-DNA-Reinigung der positiven Klone eine diagnostische Restriktionsverdauung von 500 ng gereinigter DNA mit den während des Klonschritts verwendeten Enzymen durch und führen Sie die verdauten Produkte auf einem 1% Agarose-Gel aus. Es sollte zwei Bänder geben: eines von der Größe des Vektors und eines die Größe des neuen Inserts.
- Überprüfen Sie die Konstruktsequenz durch Sequenzierung mit den folgenden Primern: Forward 5'- aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3' und reverse 5'-gcatttttttcactgcattctagtt-3'.
HINWEIS: Wenn DNA mit PCR repliziert wird, gibt es immer die Möglichkeit von Fehlern während der Amplifikation auch bei Verwendung einer High-Fidelity-Polymerase, daher ist es sehr wichtig, die endgültigen Konstrukte zu sequenzieren.
7. Transfektion und Proteinexpression
- In einer zuvor poly-L-Lysin-beschichteten weißen 96-Well-Platte führen Sie die Zellaussaat einen Tag vor der Transfektion bei 2,5 x 104 Zellen pro Brunnen mit dem modifizierten Eagle-Medium von Dulbecco durch, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin G und 100 mL Streptomycin.
- Verwenden Sie nur die 60 Innenbrunnen, um das Potenzial für thermische Gradienten über die Platte und Kanteneffekte durch Verdunstung zu minimieren. Fügen Sie den 36 Außenbrunnen 200 l steriles destilliertes Wasser hinzu und 150 l in die Räume zwischen den Brunnenund brüten über Nacht bei 37,5 °C und 5 % CO2.
- Am nächsten Morgen transfekieren Sie mit 100 ng Gesamt-DNA (50 ng pro Konstrukt).
- Richten Sie vier verschiedene Plasmidkombinationen (Rezeptor: -arrestin) gemäß Abbildung 2bein.
- Verwenden Sie für jede Plasmid-Kombination 20 l modifizierte Eagle es Minimum Essential Media, gepuffert mit HEPES, wobei 0,3 l lipidisches Transfektionsreagenz pro Bohrgut verwendet werden.
- Fügen Sie jedem Brunnen 20 l lipidioniertereagenz-DNA-Mischung hinzu und mischen Sie die Platte in Kreisen für 10 s.
- Frisches Medium nach 6-Stunden-Inkubation bei 37,5 °C und 5%CO2wechseln.
- Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37,5 °C und 5%CO2.
8. Überwachung von Rezeptor---Arrestin1-Arrestin1-2-Wechselwirkungen in HEK293-Zellen
- Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie jedem Bohrkörper 100 l modifizierte Eagle es Minimum Essential Media mit HEPES hinzu und lassen Sie die Platte 10 min bei RT stabilisieren.
- Bereiten Sie das Furimazin-Substrat vor, indem Sie 1 Volumen von 100x Substrat mit 19 Bänden LCS-Verdünnungspuffer (eine 20-fache Verdünnung)11kombinieren und so einen 5-fachen Vorrat für die Mischung mit Zellkulturmedium erzeugen.
- Fügen Sie 25 l 5x Furimazin zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie vorsichtig in Kreisen für 10 s.
- Messen Sie die Lumineszenz für 10 min für die Signalstabilisierung bei RT.
ANMERKUNG: Durch die Verwendung dieses Basissignals zur Normalisierung der Reaktion jedes Brunnens wird es dazu beitragen, die Variabilität zu reduzieren, die durch Unterschiede in der Anzahl der pro Bohrkörper plattierten Zellen, auch Unterschiede in der Transfektionseffizienz usw. verursacht wird. Einmal berechnet, durchschnittlich die normalisierte Reaktion von Replizieren Brunnen für eine bestimmte medikamentöse Behandlung. - Bereiten Sie 13,5x Ligand-Lösung in modifizierten Eagle es Minimum Essential Media mit HEPES gepuffert.
- Für Experimente bei Raumtemperatur mit 10 l 13,5x Ligandzugabe die Verbindungen mit Injektoren oder einer Mehrkanalpipette hinzufügen und die Platte von Hand oder mit einem Orbital-Shaker (20 s bei 200 Umdrehungen pro Minute) mischen.
- Für Experimente bei 37,5 °C mit 10 l 13,5-facher Ligand-Zugabe verwenden Sie Injektoren, um Verbindungen zu verteilen und mit dem Instrumenten-Orbital-Shaker zu mischen. Bei Nichtbenutzung von Injektoren die Platte aus dem Leuchtkraftmesser entfernen, die Liganden hinzufügen und die Platte von Hand oder mit einem Orbital-Shaker (20 s bei 200 Rpm) mischen.
HINWEIS: Verwenden Sie Injektoren und einen Shaker innerhalb des Detektionsinstruments, um Temperaturschwankungen im Zusammenhang mit dem Entfernen der Platte aus dem Luminometer zu minimieren. Für diesen Test können Standard-Tischleuchter verwendet werden. Verwenden Sie eine Integrationszeit von 0,25–2 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurden Wechselwirkungen zwischen einem prototypischen GPCR und zwei '-Arrestin-Isoformen überwacht. Glucagon-ähnliche Peptidrezeptorkonstrukte (GLP-1r) wurden mit Primern hergestellt, die NheI- und EcoRI-Enzymrestriktionsstellen enthalten, und in die Vektoren pBiT1.1-C [TK/LgBiT] und pBiT2.1-C [TK/SmBiT] geklont, während bei pBiT1.1-N [TK/LgBiT] und pBiT2.1-N [TK/SmBiT] unter Verwendung der Enzymrestriktionsstellen BgIII und EcoRI im Fall von '-arrestin2 und NheI und XhoI im Falle von '-arrestin1. HEK293-Zellen wurden mit 50 ng GLP-1r-LgBiT/SmBiT und 50 ng von mit LgBiT oder SmBiT getaggtem N- oder C-Terminal transfiziert. Vier verschiedene Plasmidkombinationen wurden gescreent (Abbildung 3) und die mit dem höchsten Leuchtsignal wurde für weitere Experimente ausgewählt (Abbildung 4). Um die EC50-Werte für jede Isoformrekrutierung von S-Arrestin zu bestimmen, wurden Dosisansprechkurven mit 10 M, 1 M, 100 nM, 10 nM und 1 nM GLP-1-Ligandkonzentration durchgeführt (Abbildung 4c). Dosis-Wirkungs-Kurven wurden aus der maximalen Reaktion jeder Konzentration aus den kinetischen Studien ermittelt (Abbildung 4a, 4b).
Abbildung 1. Nukleotidsequenzen der Multiklonationsstellen der Vektoren, die bei der Konstruktion des Strukturkomplementierungs-Assays GLP-1r----arrestin1/2 verwendet werden.
Um den strukturellen Komplementierungstest für das GLP-1r---arrestin1/2-System zu entwickeln, war es notwendig, am C-Terminal den GLP-1r mit LgBiT und SmBiT unter Verwendung der Enzymbeschränkungen NheI und EcoRI an den pBiT1.1-C [TK/LgBiT] und pBiT2.1-C [TK/SmBiT] Vektor. Im Falle von '-arrestin1'2 wurden sie auch mit dem LgBiT und SmBiT am C- und N-Terminal mit den Enzymbeschränkungen BglII/EcoRI für '-arrestin2 und NheI/XhoI für '-arrestin1 an den vier Vektoren getaggt. Alle Vektoren verwenden den HSV-TK-Promoter, um unspezifische Assoziationen zu minimieren und experimentelle Artefakte zu reduzieren, und jeder Vektor enthält eine Expressionskassette für die Ampicillinresistenz in Bakterien. Bild angepasst von Referenz 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Schematische Darstellung des GPCR:-arrestin1/2 struktureller Komplementierungstest.
(a) Wie der GPCR:-arrestin1/2 strukturelleKomplementierungstest in Gegenwart von Liganden funktioniert. (b) Strukturelle Darstellung der verschiedenen Plasmidkombinationen für die MIT LgBiT oder SmBiT markierten ISOformen gpCR und -arrestin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. GLP-1r/-arrestins Orientierungsscreening.
Um die höchste Empfindlichkeit zu erhalten, wurden 4 verschiedene Plasmidkombinationen während 24 h nach der Transfektion exprimiert. Lumineszierende Signale wurden in fast allen verschiedenen Plasmidkombinationen (a-c) mit Ausnahme von nur einem GLP-1r: - -arrestin-Orientierung (d) nachgewiesen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert von zwei in doppelter Ausführung durchgeführten Experimenten ausgedrückt; jedes Duplikat wurde vor der Berechnung der S.E.M. gemittelt. Die Pfeile geben den Zeitpunkt an, zu dem die Zellen mit GLP-1 bei einer Endkonzentration von 10 m behandelt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. GLP-1r---arrestin1/2 Wechselwirkungen sind dosisabhängig.
Dosisabhängige Liganden-Beziehung von a-arrestin2 (a) und der Rekrutierung von S-Arrestin1 (b). Dosis-Ansprech-Kurven, die eine unterschiedliche Rekrutierung zwischen s-arrestin1 und -arrestin2 durch GLP-1r zeigen (c). Die Ergebnisse werden als Mittelwert von zwei in doppelter Ausführung durchgeführten Experimenten ausgedrückt; jedes Duplikat wurde vor der Berechnung der S.E.M. gemittelt. Die Pfeile geben den Zeitpunkt an, zu dem die Zellen mit GLP-1 in den entsprechenden Konzentrationen (10 M, 1 M, 100 nM, 10 nM und 1 nM, Endkonzentrationen) behandelt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Vektor | Enzymeinschränkung verwendet | Primer-Sequenz |
| pBiT1.1-C [TK/LgBiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] | SacI | 5 x XXXXXXXXGAGCTCC(Rev SI)-3 |
| Ecori | 5 x XXXXXXXXGAATTCCC(Rev SI)-3 | |
| XhoI | 5 x XXXXXXXXCTCGAGCC(Rev SI)-3 | |
| pBiT1.1-N [TK/LgBiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] | Xho | 5 x XXXXXXXXCTCGAGCGGT (SI)-3 |
| SacI | 5 x XXXXXXXXGAGCTCAG(SI)-3 | |
| Ecori | 5 x XXXXXXXXGAATTCA(SI)-3 |
Tabelle 1. Sequenzen von Primern für die verschiedenen Restriktionsenzymstellen in der Kodierungssequenz des Linkers für die Vektoren pBiT1.1 und pBiT2.1.
SI = Reihenfolge des Interesses; Rev SI = umgekehrtkomplementär der Interessensfolge. Tabelle angepasst nach Referenz 11.
| Vektor | Linker-Sequenz | Enzymeinschränkung verwendet | ||
| pBiT1.1-C [TK/LgBiT] / pBiT2.1-C [TK/SmBiT] | SI-GlyAlaGlnGlyAsnSerGlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGly-(LgBiT/SmBiT) | SacI | ||
| SI-GlyAsnSerGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSerGly-(LgBiT/SmBiT) | Ecori | |||
| SI-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyG | XhoI | |||
| pBiT1.1-N [TK/LgBiT] / pBiT2.1-N [TK/SmBiT] | (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGly -SI | XhoI | ||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyAlaGln-SI | SacI | |||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyAlaGlnGlyAsnSer-SI | Ecori | |||
Tabelle 2. Linker Aminosäuresequenzen im Zusammenhang mit SacI, EcoRI oder XhoI Restriktionsstellen in den pBiT1.1 und pBiT2.1 Vektoren.
Rote Rückstände müssen durch PCR-Primer kodiert werden. Tabelle angepasst nach Referenz 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mit der hier vorgestellten Methode können Die Wechselwirkungen zwischen jedem GPCR und dem '-arrestin1'2 in Echtzeit-Lebendenmitsystemen mit diesem GPCR---Arrestin-Strukturkomplementierungstest überwacht werden. In diesem Zusammenhang konnten wir die unterschiedliche Rekrutierung von -Arrestin-Rekrutierungen zwischen den beiden -arrestin-Isoformen durch die GLP-1r (A prototypische Klasse B GPCR) beobachten, wir beobachteten auch eine Dissoziation des Rezeptor---Arrestin-Komplexes wenige Minuten nach Erreichen des Lumineszenzsignal.
Um die beste Empfindlichkeit im strukturell komplementären Assaysystem zu haben, wurde es mit vier unterschiedlichen räumlichen Ausrichtungen zwischen dem Rezeptor und jedem Studien wie Dosis-Wirkungs-Stimulationskurven (Abbildung 4). Mit dieser Methode war es möglich, Rezeptor----Arrestin-Wechselwirkungen mit einem GPCR von hohem therapeutischen Wert bei endokrinologischen Erkrankungen wie Diabetes mellitus15zu charakterisieren. Auf die gleiche Weise kann diese Strategie leicht an jede GPCR angepasst werden, indem der GPCR von Interesse mit LgBiT oder SmBiT am C-Terminal und mit den hier beschriebenen '-arrestin1'2-Konstrukten getagt wird und es sich als leistungsstarke Alternative zu aktuellen Methoden ohne die Notwendigkeit eines komplexen Aufbaus, bei dem die Überschneidung zwischen Spender und Akzeptor ein Hindernis darstellen kann, wie in einigen Fällen von BRET und FRET. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist, dass die in diesem System verwendeten Vektoren Niederexpression-Promotoren enthalten, um endogene Expressionsniveaus nachzuahmen. Mit dieser Funktion können wir die Möglichkeit unspezifischer Assoziationen aufgrund hoher Expressionskonzentrationen des Rezeptors und/oder des -s-Arrestins ausschließen. In Abbildung 3 und Abbildung 4gibt es einen deutlichen Unterschied im Rezeptor---Arrestin-Komplex zwischen dem -Arrestin1 und dem ,-Arrestin2" und auch einer höheren Wirksamkeit und Intensität gegenüber dem ,-Arrestin1 gegenüber dem ,-Arrestin2. Das Screening in vier verschiedene Ausrichtungen wurde vorgeschlagen, um die Empfindlichkeit des Assays zu erhöhen, was das System auch bei endogenen Expressionsniveaus hochempfindlich macht.
Diese Methode ist sehr geradlinig durchzuführen. Der vielleicht wichtigste Schritt innerhalb dieses Protokolls ist das Primer-Design, um den Rezeptor von Interesse zu verstärken. Der Benutzer muss sehr vorsichtig bei der Auswahl des gemäß Abbildung 1 zu verwendenden Restriktionsenzyms sein und auf dieser Grundlage die entsprechenden Nukleotide zu den Primern hinzufügen (Tabelle 1), um die rot hervorgehobenen Aminosäuren zu kodieren ( Tabelle2).
Eine Einschränkung dieser Methode kann sein, dass das Furimazin in einer wässrigen Lösung bei oder in der Nähe des physiologischen pH-Werts abgebaut wird, was zu einer allmählichen Abnahme der Lumineszenzintensität unabhängig von jeder Veränderung der GPCR----Arrestin-Wechselwirkungen16führt. Um diese Einschränkung zu überwinden, sollte der Benutzer immer eine Normalisierungskontrolle (fahrzeugbehandelte Proben) bei der kontinuierlichen Überwachung der Lumineszenz über längere Zeiträume einschließen. Es ist auch wichtig, niedrige Niveaus des fetalen Rinderserumwährend während des Tests zu verwenden, da seine Anwesenheit könnte es die Rate der Furimazin Abbauerhöhen 16. Ein Problem, das während des Testes auftreten kann, ist, dass für Leuchtwerte für eine bekannte GPCR----Arrestin-Wechselwirkung kein signifikanter Anstieg im Vergleich zu den Basislinienwerten in allen vier verschiedenen Plasmidkombinationen registriert wird. Das liegt an der geringen Ausprägelage des HSV-TK-Promoters17. In diesem Fall besteht eine Alternative darin, die Open Reading Frames, die LgBiT- und SmBiT-Fusionsproteine kodieren, mit dem CMV-Promotor in Expressionsvektoren zu unterklonen. Beim Wechsel zu einem stärkeren Promotor sollte die Optimierung der Menge der transfizierten DNA durchgeführt werden, um die beste Assay-Antwort zu erhalten.
Mit diesem strukturell ergänzten Assay konnten wir mit großer Genauigkeit die Rekrutierungsinteraktionen von '-arrestin1'2 durch einen prototypischen GPCR der Klasse B beobachten. Mit dieser Methode ist es möglich, neuartige Arzneimittel von besonderem Interesse, die auf GPCRs abzielen, pharmakologisch zu charakterisieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Forschungsprogramms (NRF- 2015M3A9E7029172) der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung finanziert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J.
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
- Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
- New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
- Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
