Summary
GPCR-β-arrestin interaktioner er et spirende felt i GPCR Drug Discovery. Nøjagtige, præcise og nemme at opsætte metoder er nødvendige for at overvåge sådanne interaktioner i levende systemer. Vi viser en strukturel komplementation assay til at overvåge GPCR-β-arrestin interaktioner i realtid levende celler, og det kan udvides til enhver GPCR.
Abstract
Interaktioner mellem G-protein koblede receptorer (GPCRs) og β-arrestins er vitale processer med fysiologiske konsekvenser af stor betydning. I øjeblikket, karakterisering af nye lægemidler mod deres interaktion med β-arrestins og andre cytosolisk proteiner er yderst værdifuld inden for GPCR Drug Discovery især under studiet af GPCR partisk agonisme. Her viser vi anvendelsen af en ny strukturel komplementation assay til præcist at overvåge receptor-β-arrestin interaktioner i realtid levende systemer. Denne metode er enkel, præcis og kan nemt udvides til enhver GPCR af interesse, og det har også den fordel, at det overvinder uspecifikke interaktioner på grund af tilstedeværelsen af en lav ekspressions promotor til stede i hvert vektorsystem. Denne strukturelle komplementerings analyse giver nøglefunktioner, der muliggør en nøjagtig og præcis monitorering af receptor-β-arrestin-interaktioner, hvilket gør den velegnet i studiet af partisk agonisme af ethvert GPCR-system samt GPCR c-Terminus ' fosforylering koder ' skrevet af forskellige GPCR-kinaser (GRKs) og post-translationelle modifikationer af arrestins, der stabiliserer eller destabiliserer receptor-β-arrestin-komplekset.
Introduction
Gpcrs repræsenterer målet på næsten 35% af de nuværende stoffer på markedet1,2 og en klar forståelse af deres farmakologi er afgørende i udviklingen af nye terapeutiske stoffer3. Et af de vigtigste aspekter i GPCR Drug Discovery, især under udviklingen af partiske agonister er karakteriseringen af nye ligander mod receptor-β-arrestin interaktioner4 og β-arrestin interaktioner med andre cytosolisk proteiner såsom som clathrin5.
Det er blevet dokumenteret, at β-arrestin afhængig signalering spiller en central rolle i neurologiske lidelser såsom bipolar lidelse, svær depression, og skizofreni6 og også alvorlige bivirkninger i nogle medikamenter såsom morfin7.
Nuværende metoder, der anvendes til at overvåge disse interaktioner normalt ikke repræsenterer faktiske endogene niveauer af proteiner i studiet, i nogle tilfælde viser de svage signal, foto blegning og afhængigt af GPCR det kan være teknisk udfordrende at oprette8. Denne nye strukturelle komplementation analyse bruger lav ekspression promotorer vektorer for at efterligne endogene fysiologiske niveauer og giver høj følsomhed i forhold til de nuværende metoder9. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, det var muligt at nemt karakterisere Galanin receptor-β-arrestin1/2 og også β-arrestin2-clathrin interaktioner10. Denne metode kan anvendes bredt til enhver GPCR af særlig interesse, hvor β-arrestins spiller en vigtig fysiologisk funktion, eller deres signalering er relevant i nogle sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. strategi for primer-design
- Design primere til at introducere gener af interesse i pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vektorer.
- Vælg mindst en af disse tre steder som en af de to unikke restriktionsenzymer, der er nødvendige for retningsbestemt kloning på grund af tilstedeværelsen af et in-frame stop codon, der opdeler det multicloning site som vist i figur 111.
- Inkorporer nukleotidsekvensen i primere som vist i tabel 1 for at kode link rester vist med rødt i tabel 211.
- For pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] vektorer, skal du sørge for, at 5 ́ primer indeholder en ATG codon og en potent Kozak konsensus sekvens (GCCGCCACC).
- For pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vektorer, Sørg for, at 3 ́ primer indeholder et stop codon.
Bemærk: hver vektor indeholder HSV-TK Promoter for at minimere uspecifik Association og reducere eksperimentelle artefakter, også hver vektor har en udtryks kassette til ampicillin resistens i bakterier.
2. PCR
- Opsæt og Kør PCR-reaktioner for at forstærke inser's DNA fra det interessante gen ved hjælp af primere designet fra trin 1. Det er vigtigt at bruge en high-fidelity DNA Polymerase at minimere mutationer.
- Brug nøjagtigt følgende rækkefølge til at tilberede 50 μL PCR-reaktion. Tilsæt 35,5 μL destilleret vand, 5 μL 10x Polymerasebuffer, 5 μL dNTP-blanding (2,5 mM hver), 1 μL plasmid-skabelon (200 ng/μL), 1,25 μL fremadgående og omvendte primere (10 μM) og 1 μL high-fidelity polymerase (5 e/μL).
- Ved hjælp af en termo cycler oprette følgende DNA amplifikation program.
- Med en temperatur på 95 °C i 5 min.
- Gentag 25 gange følgende termiske cyklus: 95 °C i 30 s, 60 °C i 1 min, 72 °C i 2 min pr. 1 KBP, der skal forstærkes.
- Kør en endelig forlængelse ved 72 °C i 10 min.
- Hold prøverne ved 4 °C i termocycleren.
Bemærk: det anbefales stærkt at bruge en high-fidelity polymerase for at minimere punktmutationer især dem, der opstår under amplificeringen af lange sekvenser. Som amplikonen bliver længere, graden af nøjagtighed i replikation af DNA falder. For PCR-reaktionen vælges udglødnings temperaturen baseret på Smeltetemperaturen i regionen, hvor oligoerne direkte hybridiserer med DNA-skabelonen og ikke med alle rækkefølgen af primer.
- PCR produkt rensning
- Isoler PCR-produktet fra resten af PCR-reaktionen ved hjælp af et sæt fra en fabrikant af præference12. PCR-produktet er nu klar til begrænsning af fordøjelsen.
3. DNA-fordøjelse
- For PCR-produktet, Forbered fordøjelsen 50 μL fordøjelses reaktion som følger.
- Ved hjælp af et 1,5 mL rør tilsættes 12 μL destilleret vand.
- Tilsæt 5 μL 10x buffer med den bedste kompatibilitet med begge restriktionsenzymer.
- Fra trin 2,4 tilsættes 30 μL PCR-produkt
- Tilsæt endelig 1,5 μL af hvert restriktionsenzym.
- Bland kort ved vortex og Inkuber ved 37,5 °C natten over.
- For recipient plasmid fordøjelsen forberede 50 μL fordøjelses reaktion som følger:
- Ved hjælp af et 1,5 mL rør tilsættes 23 μL destilleret vand.
- Tilsæt 5 μL 10x buffer med den bedste kompatibilitet med begge restriktionsenzymer.
- Tilsæt 15 μL af recipient plasmid (200 ng/μL).
- Tilsæt 1,5 μL af hvert restriktionsenzym.
- Bland kort ved vortex og Inkuber ved 37,5 °C natten over.
Bemærk: det er vigtigt at bruge 3 μg recipient plasmid for at opnå tilstrækkeligt materiale efter DNA agantet gel rensning. Det er også relevant at forlade DNA digestions natten ved hjælp af begge enzymer for at opnå høj kloning effektivitet.
4. DNA agopstået gel rensning og kloning
- Forbered en 1% agopstået gel til at køre den fordøjet DNA plasmid og skær og Fortsæt med at skære de tilsvarende bånd. Når de tilsvarende vektor-og skærremme er blevet purified12, bestemmes DNA-koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
- Udfør DNA-ligering for at smelte skæret til recipient plasmid.
- Forbered ligering reaktioner på omkring 100 ng af total DNA, herunder 50 ng af plasmid vektor.
- Opsætning af modtager plasmid-INSERT-forhold på ca. 1:3; Det kan beregnes ved hjælp af en vektor-INSERT lommeregner13.
- Konfigurer negative kontrolelementer parallelt. For eksempel, en ligering af modtageren plasmid DNA uden nogen Indsæt vil give oplysninger om, hvor meget baggrund af ufordøjet eller selv ligerende recipient plasmid er til stede.
5. omdannelse af kloner
- Anbring et rør af DH5α kompetente celler fra fryseren ved-80 °C, og overfør det straks til is i 20 minutter.
- Efter dette tidspunkt skal du tage 55 μL af DH5α kompetente celler og tilføje 4 μL ligationsreaktion og blande ved at fslikke røret og opbevare på is i 45 min.
- Placer røret i et vandbad tidligere varmet ved 42 °C for præcis 48 s og straks få rørene tilbage på isen for yderligere 3 min.
- Tilsæt 600 μL Luria bouillon (LB) medium, som tidligere var varmet ved 37,5 °C, og Inkuber med omrystning i 1 time ved 200 rpm.
- Overfør 200 μL til en agarplade, der indeholder ampicillin 100 μg/mL og forsigtigt spredes over overfladen med væsken absorberes for det meste.
- Incubate pladerne natten over for at se kolonierne næste morgen. Recipient plasmid på skærpladen skal have betydeligt flere kolonier end recipient plasmid alene pladen.
6. isolering af det færdige plasmid
- Pluk 3-10 individuelle bakterielle kolonier og Overfør til 1 mL LB-medium indeholdende ampicillin (100 μg/mL) og Inkuber i 6 timer.
- Tag 200 μL bakteriel suspension og Overfør til 5 mL LB-medium, der indeholder den samme koncentration af ampicillin som i trin 6,1, og Inkuber natten over ved 37,5 °C med omrystning ved 200 rpm.
- Brug en miniprep DNA-kit rensning til at udføre miniprep DNA-rensninger ved hjælp af 5 mL LB dyrket natten efter producentens anvisninger14.
- For at identificere vellykkede ligationer skal du opsætte PCR-reaktioner på samme måde som i afsnit 2 ved hjælp af DNA opnået fra trin 6,3 som en skabelon med de samme primere som i afsnit 2 under den første PCR. Positive kloner vil producere PCR-produkter med den tilsvarende størrelse.
- Efter store prep DNA rensning af de positive kloner, foretage en diagnostisk begrænsning fordøjelsen af 500 ng af renset DNA med de enzymer, der anvendes under klonings trinnet og køre de fordøjet produkter på en 1% agopstået gel. Der bør være to bands: en størrelsen af vektoren og en størrelsen af den nye INSERT.
- Bekræft konstruktions sekvensen ved sekvensering ved hjælp af følgende Primers: Forward 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' og reverse 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '.
Bemærk: når DNA replikeres ved hjælp af PCR, er der altid mulighed for fejl under amplificeringen, selv når du bruger en high-fidelity polymerase, derfor er meget vigtigt at sekvens de endelige konstruktioner.
7. transfection og protein ekspression
- I en tidligere poly-L-lysin-belagt hvid 96 brønd plade, udføre celle såning en dag før transfektering ved 2,5 x 104 celler per brønd ved hjælp af dulbecco's modificerede eagle's medium suppleret med 10% af føtal kvæg serum, 100 U/ml penicillin G, og 100 μg/ mL streptomycin.
- Brug kun de 60 indvendige brønde til at minimere potentialet for termiske gradienter på tværs af pladen og kanteffekter fra fordampning. Tilsæt 200 μL sterilt destilleret vand til 36 uden for brøndene og 150 μL i rummene mellem brønde og Inkuber natten over ved 37,5 °C og 5% af CO2.
- Den følgende morgen udfører transfektering med 100 ng af total DNA (50 ng hver konstruktion).
- Der oprettes fire forskellige plasmid-kombinationer (receptor: β-arrestin) i henhold til figur 2b.
- For hver plasmid kombination brug 20 μl modificeret eagle's minimum essentielle medier Buffered med Hepes ved hjælp af 0,3 μl lipidisk transfektering reagens per brønd.
- Tilsæt 20 μl lipidisk transfektering reagens-DNA-blanding til hver brønd og bland pladen i cirkler for 10 s.
- Skift frisk medium efter 6 timers inkubation ved 37,5 °C og 5% CO2.
- Pladen inkubates i 24 timer ved 37,5 °C og 5% CO2.
8. overvågning af receptor-β-arrestin1/2 interaktioner i HEK293 celler
- Aspirér medium og tilsæt 100 μL modificeret Eagle's minimum Essential Media Buffered med HEPES til hver brønd og lad pladen stabilisere ved RT i 10 min.
- Forbered furimazin substrat ved at kombinere 1 volumen af 100x substrat med 19 volumener af LCS fortyndings buffer (en 20-fold fortynding)11, hvilket skaber en 5x bestand at blande med cellekulturmedium.
- Tilsæt 25 μL 5x furimazin til hver brønd og bland forsigtigt i cirkler for 10 s.
- Mål luminescens i 10 minutter for signal stabilisering ved RT.
Bemærk: ved at bruge dette udgangssignal til at normalisere responsen på hver brønd vil det bidrage til at reducere variabilitet forårsaget af forskelle i antallet af celler, der er belagt pr. brønd, også forskelle i transfektering effektivitet osv. Når beregnet, gennemsnit den normaliserede respons fra replikere brønde for en given narkotikabehandling. - Forbered 13,5 x ligand løsning i modificeret Eagle's minimum Essential Media Buffered med HEPES.
- Ved forsøg ved stuetemperatur med 10 μL 13,5 x ligand tilsættes forbindelserne med injektorer eller en multikanalpipette, og pladen blandes i hånden eller ved hjælp af en orbital shaker (20 s ved 200 rpm).
- Til forsøg ved 37,5 °C med 10 μL 13,5 x ligand-tilsætning anvendes injektorer til at dispensere forbindelser og blandes ved hjælp af instrumentets orbital shaker. Hvis du ikke bruger injektorer, Fjern pladen fra luminometeret, tilsæt ligander og bland pladen i hånden eller ved hjælp af en orbital shaker (20 s ved 200 rpm).
Bemærk: Brug injektorer og en shaker i detekterings instrumentet til at minimere temperaturudsving i forbindelse med fjernelse af pladen fra luminometeret. Standard-stationære-luminometre kan anvendes til denne analyse. Brug en integrations tidspunkt på 0,25 – 2 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, blev interaktioner mellem en prototypiske GPCR og to β-arrestin isoformer overvåget. Glucagon som peptidreceptor (GLP-1r) konstruktioner blev fremstillet ved hjælp af primere indeholdende NheI og EcoRI enzym restriktionssteder og klonet i vektorer pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], mens der i tilfælde af β-arrestins blev to yderligere vektorer brugte pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] ved brug af enzym begrænsnings lokaliteter BgIII og EcoRI for β-arrestin2 og NheI og XhoI i tilfælde af β-arrestin1. HEK293 celler blev transficeret ved hjælp af 50 ng af GLP-1r-lgbit/smbit og 50 ng af β-arrestin mærket med lgbit eller smbit på N-eller C-terminalen. Fire forskellige plasmid-kombinationer blev screenet (figur 3), og den med det højeste luminescerende signal blev valgt til yderligere eksperimenter (figur 4). For at bestemme EC50-værdierne for hver β-arrestin isoform-rekruttering blev dosisrespons kurver udført med 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM og 1 nM af GLP-1-ligand-koncentrationen (figur 4c). Dosisrespons kurver blev opnået fra den maksimale respons for hver koncentration fra de kinetiske undersøgelser (figur 4a, 4b).
Figur 1. Nukleotidsekvenser af de multi-steder af vektorer, der anvendes i konstruktionen af GLP-1r-β-arrestin1/2 strukturel komplementerings analyse.
For at udvikle den strukturelle komplementerings analyse for GLP-1r-β-arrestin1/2-systemet var det nødvendigt at mærke på C-terminalen GLP-1r med LgBiT og SmBiT ved hjælp af enzym restriktionerne NheI og EcoRI ved pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] Vektor. I tilfælde af β-arrestin1/2 blev de også mærket med LgBiT og SmBiT ved C-og N-terminalen ved hjælp af enzym restriktionerne BglII/EcoRI for β-arrestin2 og NheI/XhoI for β-arrestin1 ved de fire vektorer. Alle vektorer bruger HSV-TK Promoter til at minimere uspecifik Association og reducere eksperimentelle artefakter og hver vektor indeholder en udtryks kassette til ampicillin resistens i bakterier. Billede, som er tilpasset fra reference 11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk gengivelse af GPCR: β-arrestin1/2 strukturel komplementerings analyse.
a) hvordan GPCR: β-arrestin1/2 strukturel komplementerings analyse virker i nærværelse af ligand. b) strukturel repræsentation af de forskellige plasmid-kombinationer for GPCR og β-arrestin isoformer mærket med lgbit eller smbit. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. GLP-1r/β-arrestins orienterings screening.
For at opnå den højeste følsomhed blev der udtrykt 4 forskellige plasmid-kombinationer under 24 timer efter transfection. Der blev påvist luminescerende signaler i næsten alle forskellige plasmid-kombinationer (a-c), bortset fra kun én GLP-1r: β-arrestin-orientering (d). Resultaterne udtrykkes som middelværdien ± S.E.M. af to eksperimenter udført i duplikat; hvert duplikateksemplar blev gennemsnitligt før beregningen af S.E.M. Pilene angiver det tidspunkt, hvor cellerne blev behandlet med GLP-1 ved 10 μM slutkoncentration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. GLP-1r-β-arrestin1/2-interaktioner er dosisafhængige måde.
Dosisafhængig ligand forholdet mellem β-arrestin2 (a) og β-arrestin1 rekruttering (b). Dosisrespons kurver, der viser differentiel rekruttering mellem β-arrestin1 og β-arrestin2 af GLP-1r (c). Resultaterne udtrykkes som middelværdien ± S.E.M. af to eksperimenter udført i duplikat; hvert duplikateksemplar blev gennemsnitligt før beregningen af S.E.M. Pilene angiver det tidspunkt, hvor cellerne blev behandlet med GLP-1 ved de tilsvarende koncentrationer (10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM og 1 nM, endelige koncentrationer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Vektor | Anvendt enzym restriktion | Primer sekvens |
| pBiT 1.1-C [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] | Saci | 5 ́-XXXXXXXXGAGCTCC(rev SI)-3 ́ |
| EcoRI | 5 ́-XXXXXXXXGAATTCCC(rev SI)-3 ́ | |
| XhoI | 5 ́-XXXXXXXXCTCGAGCC(rev SI)-3 ́ | |
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] | Xho | 5 ́-XXXXXXXXCTCGAGCGGT (SI)-3 ́ |
| Saci | 5 ́-XXXXXXXXGAGCTCAG(SI)-3 ́ | |
| EcoRI | 5 ́-XXXXXXXXGAATTCA(SI)-3 ́ |
Tabel 1. Sekvenser af primere for de forskellige restriktionsenzymsteder i kodnings sekvensen af linker til pbit 1.1 og pbit 2.1 vektorer.
SI = sekvens af interesse; Rev SI = omvendt komplementær rækkefølge af interesse. Tabel, som er tilpasset fra reference 11.
| Vektor | Linker sekvens | Anvendt enzym restriktion | ||
| pBiT 1.1-C [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] | SI-Glyalaglnglyasnserglyserserglyglyglyglyserglyglyglysersergly-(lgbit/smbit) | Saci | ||
| SI-Glyasnserglyserserglyglyglyglyserglyglyglysersergly-(Lgbit/smbit) | EcoRI | |||
| SI-Glyserserglyglyglyglyserglyglyglysersergly-(lgbit/smbit) | XhoI | |||
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] | (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSergly-si | XhoI | ||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyAlaGLN-si | Saci | |||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyAlaGlnGlyAsnSer-SI | EcoRI | |||
Tabel 2. Linker aminosyre sekvenser relateret med SacI, EcoRI eller XhoI restriktion sites i pBiT 1.1 og pBiT 2.1 vektorer.
Røde rester skal kodes af PCR Primers. Tabel, som er tilpasset fra reference 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, kan interaktioner mellem GPCR og β-arrestin1/2 overvåges i realtids levende systemer ved hjælp af denne GPCR-β-arrestin strukturel komplementerings analyse. I denne henseende var vi i stand til at observere differentialet β-arrestin rekruttering mellem de to β-arrestin isoformer af GLP-1r (en prototypiske klasse B GPCR), vi også observeret en dissociation af receptor-β-arrestin kompleks et par minutter efter at have nået den maksimale lysende signal.
For at opnå den bedste følsomhed i det strukturelle komplerings analyse system blev det screenet med fire forskellige rumlige retninger mellem receptoren og hver β-arrestin isoform, og den med det højeste lysende signal blev anvendt til posterior undersøgelser såsom stimulerings kurver for dosisrespons (figur 4). Ved hjælp af denne metode var det muligt at karakterisere receptor-β-arrestin interaktioner ved hjælp af en GPCR af høj terapeutisk værdi i Endokrinologiske sygdomme som diabetes mellitus15. På samme måde kan denne strategi let tilpasses til enhver GPCR ved simpel tagging af GPCR af interesse med LgBiT eller SmBiT på C-terminalen og ved hjælp af β-arrestin1/2 konstruktioner beskrevet her, og det viser sig som et stærkt alternativ til de nuværende metoder uden nødvendigheden af et kompleks, hvor overlapningen mellem donor og acceptor kan være en hindring, som i nogle tilfælde af BRET og FRET. En anden betydelig fordel er, at de vektorer, der anvendes i dette system indeholder lav ekspression initiativtagere i et forsøg på at efterligne endogene udtryk niveauer. Med denne funktion kan vi udelukke muligheden for ikke-specifikke foreninger på grund af høje ekspressionsniveauer af receptoren og/eller β-arrestin. I figur 3 og figur 4er der en klar forskel i receptor-β-arrestin komplekset mellem β-arrestin1 versus β-arrestin2 og også en højere effekt og intensitet mod β-arrestin1 over β-arrestin2. Screeningen i fire forskellige retninger blev foreslået for at øge følsomheden af analysen gør systemet meget følsom selv på endogene ekspressionsniveauer.
Denne metode er meget ligetil at udføre. Måske det mest kritiske skridt i denne protokol er primer design til at forstærke receptoren af interesse. Brugeren skal være meget omhyggelig med at vælge, hvad restriktions enzymet skal bruge i henhold til figur 1 , og baseret på dette for at tilføje de tilsvarende nukleotider til primere (tabel 1) for at indkode de røde Fremhævede aminosyrer (tabel 2).
En begrænsning af denne metode kan være, at furimazin nedbrydes i en vandig opløsning ved eller nær fysiologisk pH, hvilket fører til et gradvist fald i luminescens intensitet uafhængigt af enhver ændring i GPCR-β-arrestin-interaktioner16. For at overvinde denne begrænsning skal brugeren altid inkludere en normalisering kontrol (køretøj behandlede prøver), når løbende overvågning luminescens for forlængede perioder. Det er også vigtigt at bruge lave niveauer af føtal kvægserum under analysen, da dens tilstedeværelse det kan øge hastigheden af furimazin nedbrydning16. Et problem, der kan opstå under analysen er, at for luminescerende værdier for en kendt GPCR-β-arrestin interaktion kan ikke være nogen signifikant stigning er registreret sammenlignet med baselineværdier i alle fire forskellige plasmid kombinationer. Dette kan skyldes det lave udtryk fra HSV-TK Promoter17. I så fald er et alternativ at under klone de åbne læse rammer, der koder LgBiT og SmBiT fusion proteiner i udtryks vektorer ved hjælp af CMV Promoter. Når du skifter til en stærkere promotor, skal der foretages optimering af mængden af transficeret DNA for at opnå den bedste analyse respons.
Ved hjælp af denne strukturelle komplementerings analyse var vi i stand til med stor nøjagtighed at observere β-arrestin1/2 rekrutterings interaktioner af en prototypiske klasse B GPCR. Ved hjælp af denne metode er det muligt at farmakologisk karakterisere nye lægemidler af særlig interesse rettet mod GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra forskningsprogrammet (NRF-2015M3A9E7029172) fra det nationale forskningsinstitut i Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT og fremtidig planlægning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J.
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
- Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
- New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
- Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
