Summary
פרוטוקול זה נועד להעריך את הכדאיות של דרוסופילה בכל שלב התפתחותי, מעובר למבוגר. ניתן להשתמש בשיטה כדי לקבוע ולהשוות בין הכדאיות של גנוסוגים שונים או תנאי גדילה.
Abstract
בדרוזופילה מלאנוסטר, משתמשים בכדאיות כדי לקבוע את הכושר של רקע גנטי מסוים. וריאציות Allelic יכול לגרום לאובדן חלקי או מלא של הכדאיות בשלבים שונים של התפתחות. המעבדה שלנו פיתחה שיטה להעריך את הכדאיות בדרוזופילה מעובר ועד למבוגר בוגר במלואו. השיטה מסתמכת על כימות מספר הצאצאים המצויים בשלבים שונים במהלך הפיתוח, החל מעוברים מקווקו. לאחר כימות העוברים, שלבים נוספים נספרים, כולל L1/L2, גלמים, ומבוגרים בוגרים. לאחר שנבדקו כל השלבים, ניתוח סטטיסטי כגון מבחן הצ מרובע משמש כדי לקבוע אם יש הבדל משמעותי בין מספר התחלתי של צאצאי (העוברים מקווקו) ושלבים מאוחרים יותר השיאה במספר הנצפה של מבוגרים, ובכך לדחות או לקבל את ההשערה הריקה (שמספר העוברים המקווקו יהיה שווה למספר הזחלים, הגלמים והמבוגרים הנרשמים בשלבי הפיתוח). היתרון העיקרי של השיקול הזה הוא הפשטות והדיוק שלה, כפי שהוא אינו דורש העובר לשטוף כדי להעביר אותם לבקבוקון המזון, הימנעות הפסדים משגיאות טכניות. למרות שהפרוטוקול המתואר כאן אינו מבצע בדיקה ישירה של הזחלים L2/L3, ניתן להוסיף שלבים נוספים לחשבון עבור אלה. השוואת מספר העוברים המקווקו, L1, הגלמים והמבוגרים יכולים לעזור לקבוע אם הכדאיות נחשפה במהלך השלבים L2/L3 למחקרים נוספים (השימוש במזון צבעוני מסייע לזיהוי ויזואלי של הזחלים). בסך הכל, שיטה זו יכולה לסייע לדרוזוהילה חוקרים ומחנכים לקבוע מתי הכדאיות נפגעת במהלך מחזור החיים לטוס. הערכה שגרתית של מניות באמצעות השיטה הזו יכולה למנוע הצטברות של מוטציות משניות שעלולות להשפיע על הפנוטיפ של המוטציה הבודדת המקורית, במיוחד אם המוטציות המקוריות משפיעות על הכושר. מסיבה זו, המעבדה שלנו שומרת עותקים מרובים של כל אחד שלנו מיט ime4 אללים ובודק באופן שגרתי את הטוהר של כל מניה עם שיטה זו בנוסף ניתוחים מולקולריים אחרים.
Introduction
תוחלת החיים מושפעת מגורמים גנטיים ושאינם גנטיים. בתנאי הצמיחה הסטנדרטית במעבדה בטמפרטורת החדר, המעבדה שלנו הבחין וריאציה משמעותית של כושר הכדאיות בין ime4 אללים שונים מיט הגדלים תחת תנאים זהים (איור 1 ומשלים דמויות). מחקרי הכדאיות נעשים לעתים קרובות כדי לחקור את ההשפעות של שילוב אלל מסוימים או תנאי גדילה במחקרים גנטיים באוכלוסייה1,2,3,4. עם זאת, ניתוח מפורט של הכדאיות בתוך קבוצה לא משלימה של מוטציות קשה למצוא בספרות המדעית. אלל הוא בדרך כלל מתויג "לא חיוני" אם החוקר מוצא כמה אנשים homozygous עבור זה אלל בתוך בקבוקון המזון הבתים מלאי מאוזנת5,6. עם זאת, ניתוחים מדויקים של צ'י-סקוור כדי להעריך אם ההומוזיטים האלה מתעוררות ביחס למנדון הצפוי לא מדווחים5,6. טמפרטורת מתירני ביותר עבור כל מלאי דרוסוילה היא טמפרטורת החדר (22-23 ° c) ו, עם חומרים מזינים מתאימים, מחזור החיים של הזבובים מסוג פראי לוקח כ 12 ימים כדי להשלים את7,8. כאשר משך כל שלב התפתחותי של מסוג פראי דרוסופילה מוכר7,8, השיטה המתוארת בדוח זה יכולה לשמש כדי לבחון אם המתח הדרוזוזה תחת המחקר מתאים בכל שלב בהשוואה לפקד המתאים לרקע הגנטי שנבדק. בניגוד למחקרים המתמקדים בהיבט מסוים אחד של פיתוח9, פרוטוקול זה מספק דרך מעשית להעריך את הכדאיות בשלבים התפתחותיים שונים.
במעבדה שלנו, פרוטוקול זה משמש כדי להעריך את הכדאיות של מניות כי הם חסרים עבור Drosophila ילה הסליל של Meiosis 4 (מיט ime4). מיט ime4 הוא גן חיוני10 כי מקודד rna מmethyltransferase עם תפקידים קריטיים RNA מטבוליזם ב drosophila ילה ואורגניזמים אחרים משני האחרים5,6,10, מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 . כדי להעריך במהירות את אללים הרומן של מיט ime4 שנוצר באמצעות crispr/Cas9 (דמויות משלימות), הכדאיות בנקודת קצה בוצעה כי רק הצאצא למבוגרים המיוצר בתוך בבקבוקונים של מניות מאוזנת (איור 1). חלק מהמניות המשמשות בשימוש תוארו בדוחות Dm ime4 הקודם5,6. מוטציות Homozygous הופיעו ברמות sub-Mendelian, כפי שנקבע על ידי ניתוחי צ'י מרובע (איור 1 וחומרים משלימים). כדי להעריך אם המספרים הנמוכים-מהצפוי האלה היו בגלל פחות עוברים שהונחו, או פחות עוברים מורחבים, או אובדן הכדאיות ב-L1/L2 או גלמים, הרחבנו את המעקב כדי לכלול ספירות בכל אחד מהשלבים ההתפתחותיים (איור 2, איור 3, איור 4, איור 5, איור 6, איור 7, ספרה 8ואיור 9.
כאן, אנו מתארים את השיטה באמצעות מסוג פראי (OreR) זבובים. כדי לבחון מדעית שיטה זו לשימוש עם רקעים גנטיים אחרים או מינים דרוזופילה, אנו ממליצים להשתמש ב-OreR כהפניה ולהתאים נקודות זמן לפי האורגניזם הניסיוני. הפרוטוקול הוערך עוד יותר כדי להעריך את הכדאיות של צאצאים שנוצרו על ידי חציית הבתולה פראי סוג הנקבות עם גברים מ heterozygous Dm ime4 מלאי מוטציה5,6 (איור 4).
Protocol
1. הכנת מדיה
- הכינו את הענבים על פי הוראות היצרן (ראו טבלת חומרים) ויוצקים לצלחת פטרי 35 מ"מ לחצי מלאה (איור 5). אפשר לגבש במשך כ-1 h. לאחר הענבים אגר מתקשה, להשתמש מיד או לאחסן ב 4 ° c.
- בעדינות לעשות שריטות על פני הצלחת אגר באמצעות סכין פלסטיק קטן (זבובים כמו לשכב על משטחים מחוספס) עוזב את אמצע הצלחת ללא שריטות (איור 5). מניחים כמות קטנה של ממרח שמרים (שנעשו טריים; ראו טבלת חומרים) במרכז הלוחית (איור 5).
2. אוסף העובר מיני כלוב הגדר
- הגדר צלב באמצעות שתי נקבות הבתולה וגבר צעיר אחד בתוך כלוב אוסף העובר המכיל את הצלחת אגר ענבים שיושלם עם ממרח שמרים (איור 5).
- לאחר 24 שעות, לבדוק את הכלובים עבור העוברים הונחו מבלי לפתוח את הכלוב על ידי התבוננות בתחתית לוחית אגר. אם העוברים הונחו, הסירו את הצלחת אגר מהחדר והניחו אותו בתוך תא לח להתבוננות מיקרוסקופית (איור 6). אם מספר ימים של הנחת הם הבקיע (למשל, פוריות/אריכות ימים assays), לשמור על ההורים הרבייה להחליף את הצלחת עם אחד טרי מוכן כמתואר. אוספים מוקדמים של פחות מ -24 שעות ניתן לעשות אבל, כאשר משתמשים בנקבות הבתולה, להיות מודעים כי הם לא לשכב עד 48 h לאחר המתעוררים מתוך מקרה הגולם שלהם.
- מכסים את הצלחת אגר המכיל עוברים עם מכסה צלחת פטרי כדי למנוע התייבשות ולמקם אותו מיד בתוך חדר לח (איור 7). צפו תחת מיקרוסקופ מבתר והקליטו עוברים מקווקו ו L1. להחליף מכסה ולאחסן בטמפרטורת החדר בתא לח עד שכל העוברים בקעו והתפתחו לתוך L1 הזחלים (איור 6).
3. ספירת עוברים וזחלים
- לאחר 48 h, להתבונן לוחיות תחת מיקרוסקופ מבתר ולהקליט את המספרים בפעם האחרונה לפני העברת דיסק אגר לבקבוקון מזון. עוברים מופרות/קיימא אמורים להיות L1 עד אז. תקופות דגירה ארוכה לפני המעבר אפשריים אך להיות מודעים לכך שלוחות עלולים להתחיל לאבד לחות האגר עלול לפצח להתפשר על העברה נקייה לבקבוקונים מזון (איור 7). כדי להבטיח את הצלחות להישאר רטוב הכדאיות העובר לא נפרץ בעת הספירה, להימנע באמצעות אור תכווננת ישיר על פני השטח אגר (איור 7E מראה מרחק מתאים).
- לאחר הספירה מכסים את הצלחת ומאחסנים אותו בתא לח עד שהוא מוכן להעברה. . ממצאים מקליטים
4. העברת דיסק הענבים אגר לבקבוקון מזון כדי לפקח על הכדאיות במהלך הפיתוח
- לאחר הקלטת מספרים (עוברים מקווקו/L1/L2), השתמש מרית כדי להעביר בזהירות את הדיסק הענבים אגר לבקבוקון גדול מספיק כדי להכיל דיסק 35 mm המכיל את מדיית מזון Drosophila שהוכנו על פי הוראות היצרן (עיין רשימה של ריאגנטים). מניחים את הדיסק ענב אגר L1-בצד למטה על האוכל (איור 7). לאחר העברת דיסק אגר עם הזחלים לבקבוקון המזון, בזהירות לבדוק את צלחת פטרי ריקה עבור כל הזחלים שנותרו מאחור (איור 7E).
- הגדר לוח זמנים כדי לבדוק בבחנות מזון מדי יום, בערך באותו זמן בכל יום, כדי להבטיח הזחלים L2/L3 הם נצפו עושה את דרכם אל המזון בבקבוקון (איור 8).
- הקלט את מספר הגלמים ומבוגרים דרוסופילה (איור 9). להמשיך לספור עד לא יותר מבוגרים הם נצפו ולהימנע לספור את הדור הבא (לא לספור את 9 הימים האחרונים לאחר התבוננות המבוגרים הראשונים).
- להתבונן ולתעד את הממצאים. כוונן את מסגרת הזמן של אוסף העובר, ספירה והקלטה בהתאם למניות המוטציות הנמצאות בשימוש.
- בצע ניתוח מרובע של הצ. ההשערה הריקה מניחה 100% יכולת הכדאיות, כך שמספר המבוגרים יהיה שווה למספר העוברים המקווקו והL1 במקור והועברו לבקבוקונים המזון
Representative Results
שיטה זו מדויקת ומאפשר לאחד למדוד את הכדאיות מעוברים למבוגרים התפתחה כאשר מצמידים לניתוחי צ ' מרובע.
במחקרים ראשוניים, לאחר ספירת עוברי הזחלים, הענבים אגר הוצב בתוך המבחנה זקופה בצד הבקבוקון. למרבה הצער, כאשר אגר הוצב בצד של הבקבוקון רבים של העוברים והזחלים לא בוגרת למבוגרים. זה היה קרוב לוודאי בגלל דיסק הענבים אגר ייבוש (איור 3). מיקום זה הציג משתנה סביבתי (לחות של הדיסק אגר) זה יכול לבלבל את התוצאות. כ-39% מצאצאי הצאצאים אבדו בין עוברים למבוגר, בעוד 61% מהמבוגרים הופיעו. ההפסדים הגדולים ביותר התרחשו בין הזחלים הL1 (על פני השטח של צלחות הענבים אגר) והגלמים (שנספרו על קירות של מבחנות מזון) ספירות. עם זאת, כאשר הענבים אגר הוצב בתוך הבקבוקון במגע ישיר עם משטח המזון, פחות מ 6% הצאצאים אבדו (איור 2). אגר נשאר רטוב כמו הדיסק הענבים כולו אגר נשאר במגע עם הלחות של המזון המיידי בתוך הבקבוקון (איור 7, איור 8). תוצאות אלה עולה כי המיקום של אגר בתוך הבקבוקון חשוב להשגת נתונים אמינים ולמזער את התרומה של משתנים סביבתיים. נתונים נוספים כדי לתמוך באפקטיביות של השיטה נאסף על ידי השוואת הצאצאים סוג פראי בשימוש באימות השיטה הראשונית וצאצאים המיוצר על ידי חציית הבתולה פראי-סוג הנקבות לזכרים מן מיט מאוזנת ime4 מוטציה ( איור משלים 2, IME4ΔNULL/TM3sb). כ 91% מצאצאי הצאצאים הבשיל לבגרות לעומת 94% מצאצאי הצאצא מסוג wildtype (איור 4). הבדל זה לא היה משמעותי מבחינה סטטיסטית.
Homozygous Dm ime4 מוטנטים גברים5 שימשו גם כדי לספק אימות נוסף של השיטה. עם זאת, המוטנטים הhomozygous היו חולים מדי כדי להתרבות ומת לפני שהופקדו העוברים. לכן, מגבלה אחת של הניסוי היא כי הזכרים צריכים להיות בריאים מספיק כדי לייצר אוכלוסיית העובר המתחיל לעקוב.
איור 1 : Dm ime4 המניות מצוץ ברמות משנה תת. מניות שבהן מופיעות מוטציה בחלקים מהתחום הקטליטי או בתחום הכריכה של Ado-Met (עיין באיור המשלים 1 לפרטים). מניות מסוימות היו חלקים של כל אחד התחומים הוחלפו Ala (אלנין-סורק מוטגנזה), בעוד מניות אחרות היו או או שניהם נמחק. היחס של מספר נצפה של הומוזיטים למספרים הצפויים מיוצג באחוזים (בהשוואה לבקרי heterozygous אחים, עיין באיור המשלים 3 לערכת מיון וניתוח כיכר צ'י). מנתח כיכר Chi בוצעו כדי לקבוע אם ההבדל בין נצפתה לצפוי היה משמעותי מבחינה סטטיסטית ולא בשל הסיכוי בלבד (p-ערכים < 0.01). קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע (מינימום שלושה מבחנים לכל צלב מצוין). גיליון אלקטרוני עם כל הנתונים ניתן למצוא חומרים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : מיקום אגר בתוך הבקבוקון יכול להציג משתנים סביבתיים לא מכוונים. היסטוגרמה של מספר האנשים בשלבים שונים של הפיתוח שנספרו של ענבים אגר העובר למטה בבקבוקון מזון או אגר בצד של בקבוקון המזון. הצבת דיסק העובר אגר-בצד למטה במבחנה הביא 94% (SD ± 0.02) של עוברים הראשונית ששרדו עד הבגרות. הצבת אגר בצד של בקבוקון המזון הביא רק 61% (SD ± 0.07) של העוברים שנספרו במקור להגיע לבגרות. גיליון אלקטרוני עם כל הנתונים ניתן למצוא חומרים משלימים. המספרים הצפויים בכל שלב מוגדרים כמספר ההתחלתי של עוברים/L1 הנספרים על דיסק הענבים אגר לפני העברה לבקבוקון מזון (השערת Null: 100% מעוברים מקווקו מתפתחים). המספרים הנצפים הם המספר הממשי של אנשים שנספרו עבור השלב ההתפתחותי שצוין. לפיכך, כל שלב מושווה למספר הראשוני של העוברים המקווקו שנספרו על צלחת הענב אגר. מנתח כיכר Chi בוצעו כדי לקבוע אם ההבדל בין נצפתה לצפוי היה משמעותי מבחינה סטטיסטית ולא בשל סיכוי לבד באמצעות סף ערך p של 0.05. ההבדל היה משמעותי עבור עוברים גדל עם אגר בצד של בקבוקון המזון, אבל לא עבור אלה שגדלו העובר הדיסק בצד למטה. סרגלי שגיאות מייצגים שגיאה סטנדרטית (מינימום שלושה מבחנים לכל צלב שצוין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : קריקטורה המציגה שתי דרכים ענבים אגר דיסקים נושאת עוברים/L1s ניתן להציב בתוך בקבוקון המזון. היה הבדל משמעותי בין המספר הכולל של עוברים וצאצאים מבוגרים על בסיס מיקומו של אגר בבקבוקון המזון. ההבדל נובע ממשתנה סביבתי (לחות) נוצר על ידי ההפרש במיקום הדיסק בתוך בקבוקון המזון: יש הבדל משמעותי סטטיסטית בין מספרים צפויים ונצפה בזחלים והגלמים ספירות כאשר אגר הדיסק הוצב בצד של המבחנה לעומת הבדל משמעותי לא צפוי לעומת מספרים נצפו כאשר דיסק אגר היה במגע עם האוכל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : היסטוגרמה מראה את מספר האנשים בשלבים שונים של התפתחות מן הזכרים פראי לעומת הזכרים מתוך מניות מיט מאוזנת ime4 מוטציה. זכרים מאוזנים הצטלבו לנשים מסוג פראי בתולה כמתואר בשנת 2.1. אגר הועבר לצד העובר. לתוך בובחנות מזון היחס הממוצע של מבוגרים המתעוררים העוברים המקורי שנספרו תקליטורי ענבים אגר מן פראי סוג X פראי-סוג היה 94%, SD ± 0.02, בעוד יחס של מיט ime4 מוטציה/+ X פראי סוג היה 91%, SD ± 0.01. ניתוח סטטיסטי בוצע כמתואר באיור 2; הבדלים לא היו משמעותיים עבור כל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : התקנה ניסויית. (א) אוסף העובר מיני כלובים ומנות מיני פטרי מהמטבח הענבים-אגר. הלוחות ממוקמים בתוך תא לח (צלחת פטרי סטנדרטית עם דיסק נייר סופג רווי מים) כדי למנוע התייבשות. כמות קטנה של משחת שמרים הונחה במרכזו של כל לוחית גפנים-אגר. (ב) ניתוק מכסה לוחית האיסוף של העובר (אדום) ומניחים צלחת מוכנה, צד שמרים. (ג) להעביר את הצלב לכלוב העובר ומיד מניחים מכסה צלחת פטרי כדי להחזיק זבובים בפנים. (ד) להסיר במהירות מכסה ולהפוך את כלוב העובר כך פתיחת אנשי קשר הענבים-אגר צלחת. , מודגרת ל24-48 h. בוחן מדי יום אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : התפתחות העובר על לוחיות הענבים-אגר. (א) העוברים על המנות הקטנות שהופקדו על מנות פטרי מסוג הענבים-אגר נספרים תחת מיקרוסקופ מבתר. שמרו לוחות בתוך תא לח כאשר לא מדמיין ולהימנע אור ישיר כדי למנוע התייבשות. (ב) ענבים-לוחות אגר נשמרים בתא לח ועוברי בר מקווקו מוקלטים. תמונה זו מציגה שלושה L1 הזחלים מסוג שפותחו מעוברים המוצג A. (ג) דוגמה למספרים מוקלטים של עוברים (יום 1) והזחלים L1 (יום 2) עבור שתי הלוחיות המוצגות באיור 5. "המספר הצפוי" עבור השערת האפס נקבע לפי מספר העוברים שבקע והפכו לזחלים L1 בזמן ההעברה לבקבוקון המזון (שולחן למטה). עבור זבובים מסוג ווילטיפ, כמעט כל העוברים לבקוע ולהתפתח הזחלים L1. זה לא יכול להיות המקרה עבור רקעים גנטיים אחרים ושיטה זו משמשת כדי לקבוע את ההבדלים האלה הכדאיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7 : הזחלים מעבירים. (א) לאחר ההקלטה L1 ספירות, הדיסקים הענבים-אגר מוסרים בקפידה מן הצלחת פטרי באמצעות נקי (אתנול-ניגב) מרית (ב,ג) ו הועברו L1 צד למטה כדי ליצור קשר עם המזון בבקבוקונים כפי שמוצג D. (ה) צלחת פטרי ריקה נבדק בקפידה כדי לזהות את כל הזחלים שנותרו מאחור. אם larvaee השאיר מאחור הם חיים וניתן להעביר את בקבוקון המזון, לעשות זאת בזהירות ומיד (F). אם הזחלים שנותרו מאחור מתים או לא ניתן להעביר, לתעד את העובדה הזאת כדי לתקן את "המספר הצפוי" לחישובים הבאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8 : הזחלים L2 לעשות את דרכם לתוך המזון. ראו מגרעות וחריצים בין דיסק הענבים לבין המזון הכחול. הגדר לוח זמנים כדי להתבונן בבקבוקונים מדי יום, רצוי באותו זמן ביום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9 : הופעת מבוגרים. (א) הזחלים L3 לעשות את דרכם מתוך המזון כדי להפוך לגלמים. (ב) מבוגרים מתחילים לצאת ביום 11. הגדר לוח זמנים כדי להתבונן בבקבוקונים מדי יום, רצוי באותו זמן ביום ולהקליט בקפידה את התצפיות שלך. להפסיק לספור כשכל הגלמים הופיעו (סופרים מקרים של גלמים ריקים) ולהימנע מספירת הדור הבא של זבובים על ידי עצירת הניסוי ביום 15 ולספור גלמים מתים אם בכלל (שחור/מיובש הגלמים). מוטציות עם מחזורי חיים ממושך עשויים להזדקק לפרקי זמן ארוכים יותר, אשר צריכים להיקבע בהתאם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
דמויות משלימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.
חומרים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.
Discussion
לסיכום, שיטה זו מספקת הערכה מדויקת ופשוטה של הכדאיות בדרוסופילה. הפרוטוקול כולו לוקח בערך 14 ימים להשלים. ההליך אינו דורש מיומנויות טכניות מומחה; עם זאת, העיתוי הנכון, לוח זמנים של תצפיות יומיות, וזהיר העברת אגר חשוב לדיוק ולשגות.
בנוסף למיקום של העובר דיסק ענבים-אגר-בצד למטה בבקבוקון המזון, צעד מכריע נוסף בהליך הוא העברת דיסק אגר לבקבוקון מזון לא יאוחר 48 h לאחר הסרת הצלחת אגר ענבים מן העובר אוסף מיני כלובים. העברת אגר לאחר 48 h הביא העובר ואובדן הזחלים, כנראה עקב התייבשות של הדיסק אגר. כדי לספור מעברים מסוג L2/L3, הצלחת צריכה לעבור את המספר 72 h. אם השלב הזה הוא קריטי, יש לשפוך לוחות ענבים, ולהשתמש בחדר לח למניעת התייבשות. הצלבים הוגדרו בכלובים איסוף העובר המתאימים 35 מ"מ לוחות; עם זאת, ניתן לבצע הליך זה באמצעות כלובים גדולים לאיסוף העובר גם, כגון אחד המכיל 60 מ"מ או 100 מ"מ צלחות פטרי. בקבוקי המזון חייבים להיות גדולים מספיק כדי להכיל את הגדלים האלה.
ישנם צעדים שניתן להוסיף לפרוטוקול זה. כפי שהוזכר לעיל, מעברים L2/L3 מאתגרים לכמת על צלחות בשל הזמן הנדרש ואת התייבשות פוטנציאליים של אגר. בנוסף, הזחלים הופכים ניידים מאוד על פני השטח של אגר, התחזות אתגר לספור אותם במדויק. הצבת צלחות במקרר במשך 30 דקות או הוספת כמה טיפות של הרדמה קלה (פתרון לידוקאין) על פני השטח של אגר לפני ספירת הזחלים L2/L3 יכול לעזור להאט את תנועותיו כדי לספור אותם באופן מדויק יותר. אזהרה לשינויים אלה היא שהם יכולים להחדיר משתנים (רגישות קרה, רגישות הרדמה) ולבלבל את תוצאות הכדאיות. גם בלי הצעדים האלה, באמצעות מזון צבעוני, החוקרים יכולים לכמת את הנדידה L3s/הגלמים בזמן שהם מתפשרים בצד של מבחנות המזון כדי ליזום התגלמות. מגבלה לשיטה זו היא כי היא דורשת את המבוגרים המשמשים את הצלבים כדי לשרוד להיות מורדם עם CO2 לפנוטיפים כדי להגדיר את הצלבים בכלובים איסוף העובר. מיט ime4 homozygous מוטציה זכרים לא להתאושש היטב ולמות כמה שעות לאחר התעוררות מ-CO2 טיפול. שיטות אחרות לשתק מבוגרים לצורך מיון ניתן לחקור, כגון הצבת מבחנות במקרר כמה דקות ולאחר מכן להעביר מבחנות לקרח כתוש כדי להאט את התנועה ולמיין במהירות וביעילות.
מלבד השוואת החוזקות allelic ואת ההשפעות שלהם על הכדאיות, שיטה זו יכולה לשמש כדי למסך רגישות או עמידות לתרכובות התרופות המוגדרות. שלא כמו שיטות אחרות הרעילות מורכבות המסך בתרבות התא15,16,17,18, שיטה זו משתמשת באורגניזמים שלמים, מה שהופך את הערכת ההשפעות של התפתחות קל יותר לנתח. בסיכום, שימוש בפרוטוקול זה ושינויים בו, תאפשר למדוד allelic עוצמות, כמו גם את ההשפעות של גורמים סביבתיים ותרכובות כימיות על הכדאיות של בדרוזוהילה , פוריות, פוריות, תוחלת החיים, ומשך מחזור התפתחותי.
Disclosures
. אין ניגודי אינטרסים
Acknowledgments
העבודה שלנו ממומנת על ידי NIH 1R15GM1131-01 כדי CFH ו NIH PA-12-149 כדי CFH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
References
- Hartung, E. W. Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster. Science. 107 (2777), 296-297 (1948).
- Moree, R., King, J. R. Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster. Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).
- Da Costa, M. V. Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).
- Garcia-Dorado, A., Caballero, A. The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data. Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).
- Lence, T., et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).
- Haussmann, I. U., et al. m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).
- Stockwer, H., Gallant, P. Getting started: An overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Hales, K. G., et al. Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Gardner, M., et al. Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster. Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).
- Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).
- Zhong, S., et al. MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor. The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).
- Wang, Y., et al. N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).
- Hsu, P. J., Shi, H., He, C. Epitranscriptomics influence on development and disease. Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).
- Kan, L., et al. The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila. Nature Communications. 8, 1-16 (2017).
- Senkowski, W., et al. Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).
- Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform. International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).
- Weltin, A., et al. Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
