Summary
Этот протокол предназначен для оценки жизнеспособности дрозофилы на каждом этапе развития, от эмбриона до взрослого. Метод может быть использован для определения и сравнения жизнеспособности различных генотипов или условий роста.
Abstract
В Drosophila melanogaster, жизнеспособность анализы используются для определения пригодности определенных генетических фонов. Аллельные вариации могут привести к частичной или полной потере жизнеспособности на разных стадиях развития. Наша лаборатория разработала метод оценки жизнеспособности дрозофилы от эмбриона до полностью зрелого взрослого. Метод опирается на количественную оценку количества потомства, присутствующее на различных стадиях развития, начиная с вылупившихся эмбрионов. После того, как эмбрионы были количественно, подсчитываются дополнительные этапы, в том числе L1/L2, куски и зрелые взрослые. После того, как все этапы были изучены, статистический анализ, такой как тест чи-квадрат используется, чтобы определить, есть ли существенная разница между начальным числом потомства (зародышевые эмбрионы) и более поздними стадиями, кульминацией которых является наблюдаемое число взрослых, таким образом, отвергая или принимая нулевую гипотезу (что количество вылупившихся эмбрионов будет равно количеству личинок, кусков и взрослых, зарегистрированных на этапах развития). Основным преимуществом этого исследования является его простота и точность, так как он не требует промывки эмбриона, чтобы перевести их в пищевой флакон, избегая потерь от технических ошибок. Хотя описанный здесь протокол непосредственно не исследует личинки L2/L3, для их учета могут быть добавлены дополнительные шаги. Сравнение количества вылупившихся эмбрионов, L1, куски и взрослых может помочь определить, была ли жизнеспособность нарушена во время этапов L2/L3 для дальнейших исследований (использование цветной пищи помогает с визуальной идентификацией личинок). В целом, этот метод может помочь drosophila исследователей и преподавателей определить, когда жизнеспособность скомпрометирована во время жизненного цикла летать. Регулярная оценка запасов с помощью этого асссе может предотвратить накопление вторичных мутаций, которые могут повлиять на фенотип первоначально изолированного мутанта, особенно если оригинальные мутации влияют на фитнес. По этой причине, наша лаборатория поддерживает несколько копий каждого из наших аллелей Dm ime4 и регулярно проверяет чистоту каждого запаса с помощью этого метода в дополнение к другим молекулярным анализам.
Introduction
Продолжительность жизни зависит от генетических и негенетических факторов. В стандартных условиях роста лаборатории при комнатной температуре, наша лаборатория наблюдается значительное изменение пригодности и жизнеспособности между различными Dm ime4 аллели, выращенные в одинаковых условиях(Рисунок 1 и дополнительные цифры). Исследования жизнеспособности часто проводятся для исследования последствий определенной комбинации аллелей или состояния роста в популяционныхгенетических исследованиях1,2,3. Однако детальный анализ жизнеспособности в недополнятируемой группе мутаций трудно найти в научной литературе. Аллель, как правило, помечены как "несущественные", если исследователь находит несколько человек homozygous для этого аллеля в пищевой флакон, что дома сбалансированный запас5,6. Тем не менее, точные анализы Чи-квадрат, чтобы оценить, являются ли эти гомозиготы возникают при ожидаемых мендельских соотношений не сообщается5,6. Наиболее разрешительной температурой для любого запаса Дрозофилы является комнатная температура (22-23 градусов по Цельсию) и, при соответствующих питательных веществах, жизненный цикл мух дикого типа занимает около двенадцати дней, чтобы завершить7,8. Как продолжительность каждой стадии развития дикого типа Drosophila известно7,8, метод, описанный в настоящем докладе может быть использован для изучения ли штамм Drosophila в стадии исследования подходит на каждом этапе по сравнению с контролем, подходящим для генетического фона. В отличие от исследований, которые сосредоточены на одном конкретном аспекте развития9, этот протокол предоставляет практический способ оценки жизнеспособности на различных стадиях развития.
В нашей лаборатории, этот протокол используется для оценки жизнеспособности запасов, которые являются недостаточными для Drosophila индуктор Meiosis 4 (Dm ime4). Dm ime4 является важным геном10, который кодирует метилтрансферазу РНК с критическими ролями в метаболизме РНК в Дрозофиле и других многоклеточных организмах5,6,10, 11 Год , 12 Лет , 13 Год , 14 Год . Для быстрой оценки новых аллелей Dm ime4, генерируемых через CRISPR/Cas9 (Дополнительныецифры),был проведен конечный вывод о жизнеспособности, который учитывал только потомство взрослого, произведенное в флаконах сбалансированных запасов (рисунок1). Некоторые из используемых запасов были описаны в предыдущих отчетах Dm ime4 5,6. Гомозиговые мутанты появились на субмендельских уровнях, о пределе анализа чи-квадрата(рисунок 1 и дополнительные материалы). Чтобы оценить, были ли эти более низкие, чем ожидалось, цифры были вызваны меньшим количеством закладыванных эмбрионов или меньшим количеством вылупившихся эмбрионов или потерей жизнеспособности в L1/L2 или куколках, мы расширили отслеживание, включив в него количество на каждом из этих стадий развития (Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, и рисунок 9).
Здесь мы описываем метод с использованием диких типов (OreR) мух. Для эмпирического тестирования этого метода для использования с другими генетическими фонами или видами Drosophila, мы рекомендуем использовать OreR в качестве эталона и корректировать временные точки в зависимости от экспериментального организма. Протокол был дополнительно оценен для оценки жизнеспособности потомства, порожденного скрещиванием девственных диких самок с самцами из гетерозиготного запаса мутантов Dm ime4 5,6 (Рисунок4).
Protocol
1. Подготовка средств массовой информации
- Подготовка виноградного агара в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицаматериалов) и залить в 35 мм Петри блюдо наполовину полный (рисунок5). Дайте затвердеть примерно 1 ч. После того, как виноградный агар затвердевет, немедленно используйте или храните при 4 градусах Цельсия.
- Аккуратно сделайте царапины по всей агаровой пластине с помощью небольшого пластикового ножа (мухи любят лежать на неровных поверхностях), оставляя середину пластины без царапин(рисунок5). Поместите небольшое количество дрожжевой пасты (сделанной свежей; см. Таблица Материалов) в центре пластины (рисунок5).
2. Эмбрион Коллекция Мини-Клетка Настройка
- Назначь крест с помощью двух девственных самок и одного молодого мужчины внутри клетки коллекции эмбрионов, содержащей виноградную агарную пластину, дополненную дрожжевой пастой(рисунок5).
- После 24 ч осмотрите клетки на наличие уложенных эмбрионов, не открывая клетку, глядя на дно агарной пластины. Если эмбрионы были заложены, удалите агар пластины из камеры и поместите его в влажную камеру для микроскопического наблюдения(рисунок 6). Если несколько дней прокладки засчитаны (например, анализы плодородности/долголетия), то держите размножения родителей и заменяйте плиту свежим подготовленным как описано. Ранние коллекции менее 24 ч может быть сделано, но, при использовании девственных женщин, имейте в виду, что они не будут лежать до 48 ч после выхода из их куколка случае.
- Обложка агар пластины, содержащие эмбрионы с крышкой чашки Петри, чтобы избежать обезвоживания и поместите его сразу же внутри влажной камеры (Рисунок 7). Наблюдайте под рассекающим сярпод микроскопом и записывайте вылупившихся эмбрионов и L1. Замените крышку и храните при комнатной температуре во влажной камере до тех пор, пока все эмбрионы не вылупились и не превратились в личинки L1(рисунок 6).
3. Подсчет эмбрионов и личинок
- После 48 ч наблюдайте за пластинами под рассекающим микроскопом и записывайте цифры в последний раз перед переносом агар-диска на пищевой флакон. Оплодотворенные/жизнеспособные эмбрионы должны стать L1 к тому времени. Более длительные инкубационные периоды до передачи возможны, но имейте в виду, что пластины могут начать терять влагу и агар может взломать компрометирующую чистую передачу пищевых флаконов(рисунок 7). Для обеспечения того, чтобы пластины оставались гидратированными и жизнеспособность эмбриона не была нарушена при подсчете, избегайте использования прямого гусиного света над поверхностью агара(рисунок 7E показывает соответствующее расстояние).
- После подсчета, накрыть тарелку и хранить его во влажной камере до готовности к передаче. Запись результатов.
4. Передача виноградного агар-диска в пищевой виваль для мониторинга жизнеспособности во время разработки
- После того, как номера записаны (зародившиеся эмбрионы /L1/L2), используйте шпатель, чтобы тщательно перенести диск виноградного агара на флакон, достаточно большой, чтобы вместить 35-мм диск, содержащий дрозофилы пищевых носителей, подготовленных в соответствии с инструкциями производителя (обратитесь к списку реагентов). Поместите виноградный агар-диск L1-стороной вниз на пищу(рисунок 7). После переноса агар-диска с личинками в пищевой флакон, тщательно осмотрите пустую чашку Петри на наличие личинок(рисунок 7E).
- Настройка графика для проверки пищевых флаконов ежедневно, примерно в то же время каждый день, чтобы обеспечить L2/L3 личинки наблюдаются пробираясь к пище во флаконе (Рисунок 8).
- Запись числа куски и взрослых Drosophila(рисунок 9). Продолжайте считать, пока больше не наблюдается взрослых и не считать следующее поколение (не считать последние 9 дней после наблюдения первых взрослых).
- Наблюдайте и записывайте находки. Отрегулируйте временные рамки сбора эмбрионов, подсчета и записи соответственно используемого запаса мутантов.
- Выполните анализ квадратного чи. Нулевая гипотеза предполагает 100% жизнеспособность, так что число взрослых будет равна количеству вылупившихся эмбрионов и L1 первоначально зарегистрированных и переданных в пищевые флаконы
Representative Results
Этот метод точно и воспроизвою позволяет оценить жизнеспособность от эмбрионов к вытекаемым взрослым, когда в сочетании с чи квадратный анализ.
В первоначальных исследованиях, после подсчета эмбрионов и личинок, виноградный агар был помещен в флакон вертикально на стороне флакона. К сожалению, когда агар был помещен на стороне флакона многие эмбрионы и личинки не созрели для взрослых. Это, вероятно, из-за высыхания виноградного агар-диска(рисунок 3). Это размещение ввело экологическую переменную (гидратацию агар-диска), которая может свести с контроля результаты. Приблизительно 39% потомства было потеряно между зародышем к взрослому по мере того как только 61% взрослого вытекли. Наибольшие потери произошли между личинками L1 (считая на поверхности виноградных агарпластин) и кукулаками (на счету на стенах пищевых флаконов) . Однако, когда виноградный агар был помещен лицом вниз внутри флакона в непосредственном контакте с пищевой поверхностью, менее 6% потомства было потеряно(рисунок 2). Агар остался гидратированных, как весь виноградный агар диск остался в контакте с влагой мгновенной пищи внутри флакона(Рисунок 7, Рисунок 8). Эти результаты показывают, что положение агара внутри флакона имеет важное значение для получения достоверных данных и минимизации вклада экологических переменных. Дополнительные данные в поддержку эффективности метода были собраны путем сравнения потомства дикого типа, используемого в первоначальной проверке метода, и потомства, полученных путем скрещивания девственных самков дикого типа с самцами из сбалансированного запаса мутантов Dm ime4 ( Дополнительная рисунок 2, ime4 null/TM3sb). Приблизительно 91% потомства созрели до совершеннолетия по сравнению с 94% потомства из дикого типа(рисунок 4). Это различие не было статистически значимым.
Homozygous Dm ime4 мутантных мужчин5 были также использованы для обеспечения дальнейшей проверки метода. Однако гомозиготные мутанты были слишком больны, чтобы размножаться, и умерли до того, как эмбрионы были отложены. Таким образом, одним из ограничений эксперимента является то, что мужчины должны быть достаточно здоровыми, чтобы воспроизвести для создания стартовой популяции эмбриона для отслеживания.
Рисунок 1 : Dm ime4 мутант запасов возникают на суб-Менделиан уровнях. Показаны запасы, в которых были мутированы части каталитического домена или связывающего домена Ado-Met (обратитесь к дополнительной рисунку 1 для получения подробной информации). Некоторые акции были части любого домена заменены Ала (аланин сканирование мутагенеза), в то время как другие акции были либо или оба домена удалены. Соотношение наблюдаемого количества гомозиготов к ожидаемым числам представлено в процентах (по сравнению с гетерозиготным контролем братьев и сестер, относятся к дополнительной рисунку 3 для схемы сортировки и квадратного анализа чи). Анализ ыквадратного анализа был проведен, чтобы определить, является ли разница между наблюдаемым и ожидаемым статистически значимым, а не только случайностью (p-values zlt; 0.01). Ошибки баров представляют собой стандартную ошибку среднего (минимум три испытания на крест указано). Электронную таблицу со всеми данными можно найти в дополнительных материалах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Положение агара внутри флакона может ввести непреднамеренные экологические переменные. Гистограмма количества особей на разных стадиях развития подсчитывается из виноградного агар-диска, зародив абонемента вниз в пищевой флакон или агар на стороне пищевого флакона. Размещение эмбриона агар-диска вниз во флаконе привело к 94% (SD - 0,02) первоначальных эмбрионов, выживших до совершеннолетия. Размещение агара на стороне пищевой флакон привело лишь к 61% (SD - 0,07) первоначально подсчитанных эмбрионов, достигших совершеннолетия. Электронную таблицу со всеми данными можно найти в дополнительных материалах. Ожидаемые цифры на каждом этапе устанавливаются как начальное число эмбрионов / L1 рассчитывали на виноградный агар-диск до передачи в пищевой флакон (Нулл гипотеза: 100% вылупившихся эмбрионов развиваться). Наблюдаемые цифры представляют фактическое число лиц, подсчитанных на этапе развития. Таким образом, каждая стадия сравнивается с первоначальным числом вылупившихся эмбрионов, подсчитанных на виноградной агаровой пластине. Анализ ы квадрата Чи был проведен, чтобы определить, является ли разница между наблюдаемым и ожидаемым статистически значимым и не из-за случайности только с использованием порога p-значения 0.05. Разница была значительной для эмбрионов, выращенных с агаром на стороне пищевой флакон, но не для тех, кто вырос в стороне эмбриона диска вниз. Ошибки баров представляют собой стандартную ошибку (минимум три испытания на крест указано). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Мультфильм, показывающий два способа виноградных агар-дисков, несущих эмбрионы / L1s могут быть помещены внутри пищевой флакон. Существовала значительная разница между общим числом эмбрионов и потомством взрослого в зависимости от положения агара в пищевой флакон. Разница обусловлена экологической переменной (гидратации), созданной разницей в размещении дисков внутри пищевого флакона: существует статистически значимая разница между ожидаемыми и наблюдаемыми числами в личинках и кухонках, когда агар считается диск был помещен на стороне флакона по сравнению с никакой существенной разницы в ожидаемых по сравнению с наблюдаемыми числами, когда агар-диск был в контакте с пищей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Гистограмма, показывающая количество особей на разных стадиях развития от диких мужчин по сравнению с самцами из сбалансированного запаса мутантов Dm ime4. Сбалансированные самцы перешли к девственникам диких самок, как описано в 2.1. Агарбыл был перенесен эмбриона вниз в пищевые флаконы. Среднее соотношение взрослых, возникающих из оригинальных эмбрионов, подсчитанных в виноградных агарных дисках дикого типа X, составило 94%, SD - 0,02, в то время как для Dm ime4 мутанта/х дикого типа - 91%, SD - 0,01. Статистический анализ был проведен, как описано для рисунка2; различия не были значительными ни для одной из групп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Экспериментальная установка. (A) Коллекция эмбрионов мини-клетки и виноград-агар мини-Петри блюда. Плиты помещаются внутри влажной камеры (стандартная чашка Петри с абсорбирующим бумажным диском, насыщенным водой) для предотвращения обезвоживания. Небольшое количество дрожжевой пасты было помещено в центре каждой виноградно-агаровой пластины. (B) Отсоедините крышку держателя пластины коллекции эмбриона (красный) и поместите подготовленную пластину, дрожжи вверх. (C) Перенесите крест в клетку эмбриона и немедленно поместите крышку чашки Петри, чтобы держать мух внутри. (D) Быстро удалить крышку и перевернуть клетку эмбриона так открытия контактов виноградно-агар пластины. Инкубировать 24-48 ч, ежедневно осматривая. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Развитие эмбрионов на виноградно-агарных пластинах. (A) Эмбрионы дикого типа, отложенные на блюдами из винограда-агара мини-Петри, подсчитываются под рассекающимся микроскопом. Держите пластины внутри влажной камеры, когда не визуализации и избежать прямого света, чтобы предотвратить обезвоживание. (B) Виноградные агарпластины хранятся во влажной камере и вылупившихся эмбрионов дикого типа регистрируются. На этой фотографии показаны три личинки l1 дикого типа, которые развились из эмбрионов, показанных в А. (C) Пример зарегистрированных чисел эмбрионов (день 1) и L1 личинок (день 2) для двух пластин, показанных на рисунке 5. "Ожидаемое число" для нулевой гипотезы определяется количеством эмбрионов, которые вылупились и стали l1 личинок во время передачи в пищевой флакон (таблица ниже). Для диких мух почти все эмбрионы вылупляются и превращаются в личинки L1. Это не может быть в случае других генетических фонов, и этот метод используется для определения этих различий в жизнеспособности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7 : Передача личинок. (A) После записи L1 рассчитывает, виноградно-агар диски тщательно удаляются из чашки Петри с помощью чистой (этанол-протерт) шпатель (B,C) и переданы L1 бок о бок, чтобы связаться с пищей во флаконах, как показано в D. (E) Пустое блюдо Петри тщательно проверяется, чтобы обнаружить любые личинки, оставшиеся позади. Если личинки, оставшиеся живы, живы и могут быть переданыв пищевой флакон, сделайте это осторожно и немедленно (F ). Если личинки, оставшиеся мертвы или не могут быть переданы, запишите этот факт, чтобы исправить "ожидаемое число" для последующих расчетов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8 : Личинки L2 пробираться впищу. Увидеть щели и канавки между виноградно-агар-диск и голубой пищи. Назначьте расписание для ежедневного наблюдения за флаконами, желательно в одно и то же время суток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9 : Появление взрослых. (A) L3 личинок сделать свой путь из пищи, чтобы стать кукулаками. (B) Взрослые начинают появляться на 11-й день. Назначьте расписание для ежедневного наблюдения за флаконами, желательно в одно и то же время суток, и тщательно запишите свои наблюдения. Остановить подсчет, когда все куколки появились (считать пустые случаи куколки) и избежать подсчета следующего поколения мух, остановив эксперимент на 15 день и рассчитывать мертвых кукол, если таковые имеются (черный / сушеные куколки). Мутанты с более длительным жизненным циклом могут потребоваться более длительные периоды времени, которые должны быть определены эмпирически. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительные цифры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.
Дополнительные материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.
Discussion
Таким образом, этот метод обеспечивает точную и простую оценку жизнеспособности в Drosophila. Полный протокол занимает около 14 дней. Процедура не требует экспертных технических навыков; однако, надлежащее время, график ежедневных наблюдений, и тщательный перенос агара имеет важное значение для точности и воспроизводимости.
В дополнение к размещению виноградно-агар-диска эмбриона стороне вниз в пищевой флакон, еще одним важным шагом в процедуре является передача агар-диск агар агар ана в пищевой флакон не позднее 48 ч после удаления виноградной агар пластины из эмбриона сбора мини-клетки. Передача агара после 48 ч привела к потере эмбриона и личинок, вероятно, из-за обезвоживания агар-диска. Чтобы подсчитать l2/L3 переходы, пластина должна инкубировать для 72 ч. Если этот этап имеет решающее значение, виноградные агар пластины должны быть налиты толще и влажная камера должна быть использована для предотвращения высыхания. Кресты были установлены в клетках коллекции эмбрионов, которые вмещают 35-мм пластины; однако, эта процедура может быть выполнена с помощью больших клеток коллекции эмбрионов, а также, такие, как тот, который вмещает 60 мм или 100 мм Петри пластин. Пищевые бутылки должны быть достаточно большими, чтобы вместить эти размеры.
Есть шаги, которые могут быть добавлены в этот протокол. Как уже упоминалось выше, L2/L3 переходы являются сложными для количественной оценки на пластинах из-за времени, необходимого и потенциального обезвоживания агара. Кроме того, личинки становятся очень мобильными на поверхности агара, что создает проблему для их точного подсчета. Размещение пластин в холодильнике в течение 30 минут или добавление нескольких капель мягкого анестетика (раствор лидокаина) на поверхности агара до подсчета личинок L2/L3 может помочь замедлить их движения, чтобы посчитать их более точно. Предостережение к этим изменениям является то, что они могут ввести переменные (холодная чувствительность, чувствительность обезболительного) и заставить засомниться результаты жизнеспособности. Даже без этих шагов, с помощью цветной пищи, исследователи могут количественно блуждающих L3s / prepupae, как они оседают на стороне пищевых флаконов, чтобы инициировать освящение. Ограничение мелопков этого метода заключается в том, что он требует, чтобы взрослые, используемые в крестах, чтобы выжить, будучи под анестетом с CO2 для фенотипирования, чтобы создать кресты в клетках коллекции эмбрионов. Dm ime4 гомозиготных мутантных самцов не выздоравливают хорошо и умирают через несколько часов после пробуждения от лечения CO2. Другие методы обездвиживания взрослых для сортировки могут быть изучены, такие как размещение флаконов в холодильнике в течение нескольких минут, а затем передать флаконы дробленый лед, чтобы замедлить движение и сортировать быстро и эффективно.
Помимо сравнения аллельных сильных сторон и их влияния на жизнеспособность, этот метод может быть использован для проверки чувствительности или устойчивости к определенным фармацевтическим соединениям. В отличие от других методов, которые экран соединения токсичности в клеточной культуре15,16,17,18, этот метод использует целые организмы, что делает оценку развития эффекты легче анализировать. В целом, используя этот протокол и изменения в ней, позволит измерить все сторонние сильные стороны, а также влияние факторов окружающей среды и химических соединений на жизнеспособность Дрозофилы, плодовитость, плодовитость, продолжительность жизни и продолжительность цикл развития.
Disclosures
Конфликта интересов нет.
Acknowledgments
Наша работа финансируется NIH 1R15GM1131-01 в CFH и NIH PA -12-149 TO CFH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
References
- Hartung, E. W. Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster. Science. 107 (2777), 296-297 (1948).
- Moree, R., King, J. R. Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster. Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).
- Da Costa, M. V. Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).
- Garcia-Dorado, A., Caballero, A. The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data. Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).
- Lence, T., et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).
- Haussmann, I. U., et al. m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).
- Stockwer, H., Gallant, P. Getting started: An overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Hales, K. G., et al. Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Gardner, M., et al. Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster. Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).
- Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).
- Zhong, S., et al. MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor. The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).
- Wang, Y., et al. N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).
- Hsu, P. J., Shi, H., He, C. Epitranscriptomics influence on development and disease. Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).
- Kan, L., et al. The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila. Nature Communications. 8, 1-16 (2017).
- Senkowski, W., et al. Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).
- Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform. International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).
- Weltin, A., et al. Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
