Summary
该协议旨在评估果蝇在从胚胎到成人的每个发育阶段的生存能力。该方法可用于确定和比较不同基因型或生长条件的可行性。
Abstract
在果蝇黑色素仪中，可行性测定用于确定某些遗传背景的适应性。等位变异可能导致不同发展阶段的局部或完全丧失生存能力。我们的实验室已经开发出一种评估从胚胎到完全成熟成人的果蝇生存能力的方法。该方法依赖于量化发育过程中不同阶段的后代数量，从孵化胚胎开始。胚胎被量化后，其他阶段被计算在内，包括L1/L2、pupae和成熟成人。检查完所有阶段后，使用统计分析（如气方测试）来确定后代（孵化胚胎）的起始数量与后期阶段之间是否存在显著差异，最终达到观察到的成人数量，从而拒绝或接受零假设（孵化胚胎的数量等于整个发育阶段记录的幼虫、幼虫和成人的数量）。这种测定的主要优点是简单和准确，因为它不需要胚胎冲洗将它们转移到食物小瓶，避免技术错误的损失。尽管此处描述的协议不直接检查 L2/L3 幼虫，但可以添加其他步骤来说明这些。比较孵化的胚胎数量，L1，pupae和成人可以帮助确定在L2/L3阶段是否对生存能力有危害，以便进一步研究（使用有色食物有助于对幼虫进行视觉识别）。总体而言，这种方法可以帮助果蝇研究人员和教育工作者确定在飞行生命周期中生存能力何时受到损害。使用这种测定对种群进行常规评估可以防止累积二次突变，这些突变可能会影响最初分离的突变体表型，特别是如果原始突变影响健康。因此，我们的实验室维护每个Dm ime4等位子的多个副本，并定期使用此方法检查每种股票的纯度，以及进行其他分子分析。
Introduction
寿命受遗传因素和非遗传因素影响。在室温下的标准实验室生长条件下，我们的实验室观察到在相同条件下生长的不同Dm ime4等位体之间的适应性和生存能力显著变化（图1和补充图）。可生存性研究经常进行，以调查在人口遗传研究中某些等位基因组合或生长条件的影响1，2，3，4。然而，在科学文献中很难找到对非互补突变组生存能力的详细分析。如果研究人员发现在容纳平衡库存5，6的食物小瓶中的等位基因，一个等位基因通常被贴上"非必要"的标签。然而，准确的Chi-square分析，以评估这些同源物是否出现在预期孟德尔比没有报告5，6。任何果蝇种群最宽松的温度是室温（22-23 °C），在适当的营养成分下，野生苍蝇的生命周期大约需要12天才能完成7，8。由于野生型果蝇的每个发育阶段的持续时间已知为7，8，本报告中描述的方法可用于检查正在研究中的果蝇菌株在每个阶段是否合适与适合基因背景测试的对照控制进行比较。与侧重于开发9一个具体方面的研究不同，该协议提供了一种评估不同发展阶段生存能力的实用方法。
在我们的实验室中，此协议用于评估缺血的血吸虫诱导素 4 （Dm ime4） 的可存活性。Dm ime4是编码RNA甲基转移酶的基本基因10，在果蝇和其他多细胞生物体中的RNA代谢中起关键作用， 5，6，1011,12,13,14.为了快速评估通过CRISPR/Cas9（补充数字）生成的Dm ime4的新颖等位基因，进行了一个终点可行性测定，只计算在平衡库存小瓶内产生的成年后代（图1）。一些使用的股票在以前的Dm ime4报告5，6中描述。同源突变体在亚孟德尔亚水平上出现，由气方分析确定（图1和补充材料）。为了评估这些低于预期的数量是由于胚胎被植入的更少，或者孵化的胚胎数量减少，还是L1/L2或pupae的生存能力丧失，我们扩大了跟踪范围，以包括这些发育阶段的计数（图2。 图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9。
在这里，我们描述使用野生型 （OreR） 苍蝇的方法。为了对这种方法进行经验测试，以便与其他遗传背景或果蝇物种一起使用，我们建议使用OreR作为参考，并根据实验生物体调整时间点。 该协议被进一步评估，以评估通过跨越原始野生型雌性与雄性从 Dm ime4突变种群 5 ， 6 （图 4 ）产生的后代的可行性。
Protocol
1. 媒体准备
- 根据制造商的说明准备葡萄琼脂（参见材料表），倒入35毫米培养皿至半满（图5）。 允许凝固约 1 小时。葡萄琼脂凝固后，立即使用或储存在4°C。
- 用小塑料刀轻轻划过琼脂板（苍蝇喜欢躺在不平整的表面上），使板的中间没有划痕（图5）。将少量酵母糊（新鲜;参见材料表）放在盘子的中心（图5）。
2. 胚胎收集迷你笼子设置
- 在胚胎收集笼内用两名处女和一名年轻雄性组成一个十字架，里面装有葡萄琼脂板，辅以酵母膏（图5）。
- 24小时后，通过观察琼脂板的底部，检查笼子内是否有放置的胚胎，而不打开笼子。 如果胚胎已经放置，从造型室中取出琼脂板，并将其放入潮湿室中进行显微观察（图6）。 如果对几天的铺设评分（例如，生育/长寿测定），保持繁殖父母，并更换板与描述的新鲜。早期收集不到24小时可以做，但当使用处女，请注意，他们不会躺在直到48小时后，从他们的pupa案件。
- 用培养皿盖盖住含有胚胎的琼脂板，避免脱水，并立即将其放入潮湿的室内（图7）。在解剖显微镜下观察并记录孵化的胚胎和L1。 更换盖子，在室温下储存在潮湿的室内，直到所有胚胎孵化并发育成L1幼虫（图6）。
3. 计算胚胎和幼虫
- 48小时后，在解剖显微镜下观察板，并在将琼脂盘转移到食物小瓶之前最后一次记录数字。 到那时，受精/存活的胚胎应变成L1。 转移前有更长的孵育期是可能的，但请注意，板可能开始失去水分，琼脂可能会破裂，损害清洁转移到食物小瓶（图7）。 为了确保板保持水分和胚胎的生存能力不损害，在计数时，避免使用直接鹅颈光在琼脂表面（图7E显示适当的距离）。
- 计数后，盖上板并将其存放在潮湿室中，直到准备转移。记录调查结果。
4. 将葡萄Agar光盘转移到食物瓶中，以监测开发过程中的生存能力
- 一旦记录数字（孵化胚胎/L1/L2），使用铲子小心地将葡萄琼脂盘转移到足够大的瓶中，以容纳根据制造商说明制备的含有果蝇食物介质的35毫米光盘（参见试剂）。将葡萄琼脂盘L1侧放在食物上（图7）。 将带幼虫的琼脂盘转移到食物小瓶后，仔细检查空的培养皿，是否有留下的幼虫（图7E）。
- 制定时间表，每天检查食品小瓶，每天大致相同的时间，以确保观察到L2/L3幼虫在小瓶中到达食物（图8）。
- 记录果蝇和成年果蝇的数量 （图 9）。继续计数，直到不再有成年人被观察，并避免计数下一代（不要计数超过9天后观察第一个成人）。
- 观察并记录结果。根据所使用的突变体调整胚胎收集、计数和记录的时间范围。
- 执行齐方分析。零假设假设100%的生存能力，使成人的数量将等于孵化胚胎的数量和L1最初记录并转移到食物小瓶
Representative Results
该方法准确且可重复地允许一个人在结合到chi平方分析时，从胚胎到成年的存活性。
在初步研究中，在计算胚胎和幼虫后，葡萄琼脂被直立放置在小瓶的一侧。不幸的是，当琼脂被放置在小瓶的一侧时，许多胚胎和幼虫没有成熟成人。这可能是由于葡萄琼脂盘干燥（图3）。这种放置引入了一个环境变量（琼脂盘的水化），这可能会混淆结果。大约39%的后代在胚胎之间丢失到成人，因为只有61%的成年人出现。最大的损失发生在L1幼虫（在葡萄琼脂板表面计数）和pupae（在食物瓶壁上计数）之间。然而，当葡萄琼脂被放置在小瓶内直接接触食物表面时，不到6%的后代丢失（图2）。当整个葡萄琼脂盘与小瓶内的即时食物的水分接触时，琼脂保持水分（图7，图8）。这些结果表明，小瓶内琼脂的位置对于获得可靠的数据并尽量减少环境变量的贡献非常重要。通过比较初始方法验证中使用的野生型后代和通过跨越原始野生型雌性从平衡Dm ime4突变种群中生成的后代，收集了支持该方法有效性的进一步数据（补充图2 ，ime4_null/TM3sb）。大约91%的后代成熟到成年，而94%的后代来自野生型（图4）。 这种差异在统计上并不显著。
同源Dm ime4突变雄性5也被用来提供进一步的验证方法。然而，同源突变体病重，无法繁殖，在胚胎沉积前死亡。因此，实验的一个限制是，雄性需要足够健康才能繁殖，才能产生一个起始胚胎群来跟踪。
图 1：Dm ime4突变库存在低于孟德尔水平出现。显示催化域或 Ado-Met 绑定域部分发生突变的库存（详情请参阅补充图1）。一些股票有部分的两个域被阿拉（阿兰宁扫描诱变）取代，而其他股票已删除或两个域删除。观测到的同源数与预期数的比率以百分比表示（与杂性兄弟对照相比，请参阅补充图 3进行排序方案和 chi 平方分析）。执行 Chi 平方分析以确定观测到和预期之间的差异是否具有统计显著性，而不是仅由于偶然性（p 值 < 0.01）。误差条表示平均值的标准误差（每个指示的交叉至少三次试验）。 包含所有数据的电子表格可以在补充材料中找到。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：小瓶内的 Agar 位置可能会引入意外的环境变量。不同发育阶段个体数量的直方图从葡萄琼脂盘胚胎侧到食物小瓶或食物瓶侧面的琼脂中计数。将琼脂盘胚胎侧放在小瓶中，导致94%（SD = 0.02）的初始胚胎存活至成年。将琼脂放在食物瓶的一侧，只导致61%（SD = 0.07）的最初计数胚胎成年。包含所有数据的电子表格可以在补充材料中找到。每个阶段的预期数量被设置为在转移到食物小瓶之前在葡萄琼脂盘上计数的胚胎/L1的初始数量（空假说：100%的孵化胚胎发育）。观察到的数字是为所指明的发展阶段计算的实际人数。因此，每个阶段与葡萄琼脂板上的孵化胚胎的初始数量进行比较。执行 Chi 平方分析以确定观测到和预期之间的差异是否具有统计显著性，而不是由于使用 0.05 的 p 值阈值仅由于偶然性。对于在食物小瓶一侧用琼脂生长的胚胎，差异是显著的，但对于在盘内胚胎侧下生长的胚胎则不显著。误差条表示标准错误（每个指示的交叉至少三次试验）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：卡通显示两种方式葡萄琼脂盘携带胚胎/L1可以放置在食物小瓶内。根据琼脂在食物小瓶中的位置，胚胎总数和成年后代之间存在显著差异。差异源于食物瓶内盘放置差异造成的环境变量（水化）：当琼脂计数时，幼虫和幼虫中的预期数和观测值之间存在统计显著性差异圆盘被放置在小瓶的一侧，在琼脂盘与食物接触时，预期数与观察到的数字没有显著差异。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：直方图显示从野生型雄性到Dm ime4突变平衡股的个体数量，从野生型雄性与雄性处于不同发展阶段。平衡雄叉到处女野生型雌性如 2 . 1 所述。 阿加被移植胚胎侧下到食物小瓶。 从野生X型野生型葡萄琼脂盘中从原始胚胎中产生的成年人的平均比率为94%，SD = 0.02，而Dm ime4突变/+ X野生型的平均比率为91%，SD = 0.01。如图2所示，进行了统计分析。差异对两个组都不显著。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：实验设置。（A） 胚胎收集迷你笼子和葡萄-琼脂迷你培养皿。板被放置在一个潮湿的室（标准培养皿与吸收纸盘饱和水）以防止脱水。 少量的酵母膏被放置在每个葡萄琼盘的中心。 （B） 取下胚胎收集板支架盖（红色），并放置一个准备好的板，酵母侧向上。 （C） 将十字架转移到胚胎笼中，并立即放置一个培养皿盖，将苍蝇放在里面。 （D） 快速取下盖子并翻转胚胎笼，以便打开接触葡萄琼脂板。 孵育24-48小时，每天检查。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6：葡萄琼脂板上的胚胎发育。（A） 沉积在葡萄-琼脂小培养皿上的野生型胚胎在解剖显微镜下计数。在未可视化时，将板放在潮湿室内，避免直射光线，以防止脱水。 （B） 葡萄-琼脂板保存在潮湿的室内，并记录孵化的野生型胚胎。 这张照片显示了三个野生型L1幼虫，从A所示的胚胎中发展。 （C）图5所示的两个板块的胚胎（第1天）和L1幼虫（第2天）的记录数量的例子。 零假说的"预期数量"由在转移到食物小瓶时孵化并成为L1幼虫的胚胎数量决定（下表）。 对于野生型苍蝇，几乎所有的胚胎孵化和发育成L1幼虫。 这可能不是其他遗传背景的情况，这种方法用于确定这些差异的可行性。请点击此处查看此图的较大版本。
图 7：转移幼虫。 （A） 在记录L1计数后，使用干净的（乙醇擦拭）铲（B、C）小心地从培养皿中取出葡萄-琼脂盘，并向下转移L1，以接触小瓶中的食物，如D所示。 （E） 对空的培养皿进行仔细检查，以检测任何留下的幼虫。 如果留下的幼虫还活着，可以转移到食物小瓶，这样做仔细，并立即（F）。 如果留下的幼虫已经死亡或无法转移，请记录这一事实，以更正后续计算的"预期数量"。请点击此处查看此图的较大版本。
图 8：L2幼虫进入食物。看到葡萄-琼脂盘和蓝色食物之间的缝隙和凹槽。 设定一个时间表，每天观察小瓶，最好是在一天中的同一时间。请点击此处查看此图的较大版本。
图 9：成人出现。（A） L3幼虫从食物中出来，变成幼虫. （B） 成人从第11天开始出现. 设定一个时间表，每天观察小瓶，最好是在一天中的同一时间，并仔细记录您的观察。 停止计数时，所有的pupae出现（计数空的pupae案件），并避免计数的下一代苍蝇停止实验在第15天，并计数死pupae（黑色/干pupae）。 生命周期较长的突变体可能需要较长的时间，这需要根据经验来确定。请点击此处查看此图的较大版本。
补充数字。请点击此处下载这些文件。
补充材料。请点击此处下载这些文件。
Discussion
总之，这种方法提供了一个准确和简单的评估在果蝇的生存能力。整个协议大约需要 14 天才能完成。该程序不需要专家技术技能;然而，正确的时间，日常观察的时间表，和仔细的琼脂转移是重要的准确性和可重复性。
除了将葡萄-琼脂盘的胚胎侧下放置在食物小瓶中外，手术的另一个关键步骤是将琼脂盘从胚胎收集小笼中取出葡萄琼脂板后，不迟于48小时转移到食物小瓶中。在48小时后转移琼脂导致胚胎和幼虫损失，可能是由于琼脂盘脱水。要计算 L2/L3 过渡，板需要孵育 72 小时。如果这个阶段是关键，葡萄琼脂板应浇得更厚，并且必须使用潮湿的室来防止干燥。十字架被设置在胚胎收集笼，容纳35毫米板;然而，这个程序也可以使用更大的胚胎收集笼，如一个可容纳60毫米或100毫米Petri板。 然后，食品瓶必须足够大，以适应这些尺寸。
可以向此协议添加一些步骤。如上所述，L2/L3 过渡在板上难以量化，因为需要时间和琼脂的潜在脱水。此外，幼虫在琼脂表面变得高度移动，对准确计数构成挑战。在计算L2/L3幼虫之前，在冰箱中放置盘子30分钟，或在琼脂表面加入几滴温和的麻醉剂（利多卡因溶液），可以帮助减缓它们的移动，从而更准确地计数它们。 这些修改的一个警告是，它们可以引入变量（冷灵敏度，麻醉敏感性），并混淆可行性结果。 即使没有这些步骤，通过使用有色食物，研究人员可以量化游荡的L3s/prepae，因为他们定居在食物小瓶的一侧，以启动小狗。这种方法的一个限制是，它要求在十字架中使用的成年人生存与CO2麻醉，以在胚胎收集笼中设置十字架。Dm ime4同源突变雄性在从 CO2治疗中醒来几小时后恢复不好，死亡。 可以探索其他固定成人分拣的方法，例如将小瓶放入冰箱几分钟，然后将小瓶转移到碎冰中，以减缓移动，快速高效地分类。
除了比较等位优势及其对生存能力的影响外，该方法还可用于筛选对已定义药物化合物的灵敏度或抗性。与其他方法，筛选复合毒性在细胞培养15，16，17，18，这种方法使用整个生物体，使评估发育效果更容易分析。总之，使用该协议及其修改，将允许测量等位强度以及环境因素和化合物对果蝇的生存能力、肥力、生育力、寿命和持续时间的影响。发展周期。
Disclosures
不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们的工作由NIH 1R15GM1131-01资助CFH和NIH PA-12-149到CFH。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
References
- Hartung, E. W. Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster. Science. 107 (2777), 296-297 (1948).
- Moree, R., King, J. R. Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster. Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).
- Da Costa, M. V. Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).
- Garcia-Dorado, A., Caballero, A. The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data. Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).
- Lence, T., et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).
- Haussmann, I. U., et al. m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).
- Stockwer, H., Gallant, P. Getting started: An overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Hales, K. G., et al. Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Gardner, M., et al. Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster. Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).
- Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).
- Zhong, S., et al. MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor. The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).
- Wang, Y., et al. N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).
- Hsu, P. J., Shi, H., He, C. Epitranscriptomics influence on development and disease. Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).
- Kan, L., et al. The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila. Nature Communications. 8, 1-16 (2017).
- Senkowski, W., et al. Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).
- Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform. International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).
- Weltin, A., et al. Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
