Summary
このプロトコルは、胚から成人まで、あらゆる発達段階でのショウジョウバエの生存率を評価するように設計されています。この方法は、異なる種型または成長条件の生存率を決定し、比較するために使用することができる。
Abstract
ショウジョウバエメラノガスターでは、生存率アッセイは、特定の遺伝的背景の適合性を決定するために使用されます。アジェリックバリエーションは、開発のさまざまな段階で生存率の部分的または完全な損失をもたらす可能性があります。私たちの研究室は、胚から完全に成熟した成人にショウジョウバエの生存率を評価する方法を開発しました。この方法は、孵化した胚から始まり、発達中に異なる段階で存在する子孫の数を定量化することに依存する。胚を定量した後、L1/L2、子犬、成熟した成人を含む追加の段階がカウントされます。すべての段階を調べた後、カイ二乗試験などの統計分析を用いて、子孫の開始数(孵化胚)と後の段階との間に有意な差があるかどうかを判定し、観察された成人数で終わる。したがって、帰無仮説を拒絶または受け入れる(孵化した胚の数は、発達の段階を通じて記録された幼虫、子犬、および成人の数と等しくなる)。このアッセイの主な利点は、技術的なエラーによる損失を回避し、食品バイアルにそれらを転送するために胚のすすりを必要としないため、そのシンプルさと正確さです。ここで説明するプロトコルはL2/L3幼虫を直接調べるものではありませんが、これらを考慮して追加の手順を追加することができます。孵化した胚、L1、子犬、および成人の数を比較すると、さらなる研究のためにL2/L3段階で生存率が損なわれたかどうかを判断するのに役立ちます(着色食品の使用は幼虫の視覚的同定に役立ちます)。全体的に,この方法はショウジョウバエの研究者や教育者がフライライフサイクル中に生存率が損なわれる時期を判断するのに役立ちます。このアッセイを用いた株式の定期的な評価は、特に元の突然変異がフィットネスに影響を与える場合に、元の単離変異の表現型に影響を与える可能性のある二次変異の蓄積を防ぐことができます。このため、私たちの研究室は、Dm ime4対立の各コピーを複数保持し、他の分子解析に加えて、この方法で各ストックの純度を定期的にチェックします。
Introduction
寿命は遺伝的および非遺伝的要因の影響を受ける。室温での標準的なラボの成長条件では、私たちの研究室は、同一の条件下で成長した異なるDm ime4アレンゲレの間でフィットネスと生存率の有意な変動を観察しました(図1および補足図)。生存率研究は、集団遺伝学的研究1、2、3、4における特定の対立遺伝子の組み合わせまたは成長状態の影響を調査するために頻繁に行われる。しかし、非相補的な突然変異群内での生存率の詳細な分析は、科学文献では見つけるのが難しい。研究者がバランスストック5、6を収容する食品バイアル内のその対立遺伝子について少数の個人のホモ接合性を見つけた場合、対立遺伝子は通常「必須ではない」とラベル付けされます。しかし、これらのホモ接合性が予想されるメンデリアン比で生じるかどうかを評価するための正確なカイ二乗分析は、5、6と報告されていない。任意のショウジョウバエストックの最も寛容な温度は室温(22-23 °C)であり、適切な栄養素で、野生型ハエのライフサイクルは7、8を完了するのに約12日かかります。野生型ショウジョウバエの各発達段階の持続時間が7,8として知られているように、このレポートに記載されている方法は、研究中のショウジョウバエ株が各段階に適合しているかどうかを調べるために使用することができるテストされた遺伝的背景に適したコントロールと比較して。開発9の1つの特定の側面に焦点を当てた研究とは対照的に、このプロトコルは、異なる発達段階での生存率を評価する実用的な方法を提供する。
私たちの研究室では、このプロトコルは、Meiosis 4(Dm ime4)のショウジョウバエ誘導剤に欠乏している株式の生存率を評価するために使用されます。Dm ime4は、ショウジョウバエおよび他の多細胞生物におけるRNA代謝に重要な役割を持つRNAメチルトランスフェラーゼをコードする必須遺伝子10であり、5,6,10,11歳,12歳,13歳,14歳.CRISPR/Cas9(補足図)を介して生成されたDm ime4の新規アレルを迅速に評価するために、バランス株のバイアル内で産生された成人の子孫のみをカウントするエンドポイント生存率アッセイが行われました(図1)。使用された株式の一部は、以前のDm ime4レポート5、6に記載されていました。ホモ接性変異体は、カイ二乗分析によって決定されるサブメンデリアンレベルで出現した(図1および補足材料)。これらの予想より低い数は、敷設された胚の数が少ないか、孵化した胚が少ないか、L1/L2または子犬の生存率の喪失によるものかを評価するために、これらの発達段階のそれぞれでカウントを含むように追跡を拡大しました(図2、 図3、図4、図5、図6、図6、図7、図8、図9)。
ここでは、野生型(OreR)ハエを用いた方法について説明する。他の遺伝的背景またはショウジョウバエ種との使用のためにこの方法を経験的にテストするために、我々は参照としてOreRを使用し、実験生物に応じてタイムポイントを調整することをお勧めします。 このプロトコルはさらに評価され、異種Dm ime4変異株5,6(図4)から雄と処女野生型雌を交渡すことによって生成された子孫の生存率を評価した。
Protocol
1. メディアの準備
- メーカーの指示に従ってブドウ寒天を準備し(材料の表を参照)、35mmペトリ皿に半分に注ぎます(図5)。 約1時間固める。ブドウの寒天が固化した後、直ちに4°Cで使用または保存してください。
- 小さなプラスチックナイフ(不均一な表面に横たわるようなハエ)を使用して寒天板全体に傷を付け、プレートの中央に傷をつけずに残します(図5)。少量の酵母ペースト(新鮮に作られ、材料の表を参照)をプレートの中央に置きます(図5)。
2. 胚コレクションミニケージセットアップ
- 酵母ペーストを補うブドウ寒天プレートを含む胚コレクションケージ内に2匹の処女雌と1匹の若い雄を用いて十字架を設置する(図5)。
- 24時間後、寒天板の底部を見てケージを開けずに、ケージに置かれた胚のケージを検査します。 胚が敷設されている場合は、室内から寒天板を取り出し、顕微鏡観察のために湿気の多い室内に置きます(図6)。 数日間の敷設が採点された場合(例えば、不妊/長寿アッセイ)、繁殖親を維持し、記載されているように準備された新鮮なものでプレートを交換します。24時間未満の初期のコレクションは行うことができますが、処女の女性を使用する場合、彼らは彼らのパパケースから出てくる後48時間まで横たわいことに注意してください。
- 脱水を避け、湿気の多い部屋の中に入れ、ペトリ皿の蓋で胚を含む寒天プレートを覆います(図7)。解剖顕微鏡下で観察し、孵化した胚およびL1を記録する。 すべての胚が孵化してL1幼虫に発展するまで、蓋を交換し、湿度の高い部屋で室温で保管してください(図6)。
3. 胚と幼虫の数え
- 48時間後、解剖顕微鏡下のプレートを観察し、寒天ディスクを食物バイアルに移す前に最後に1回番号を記録する。 受精/生存可能な胚は、それまでにL1になるはずです。 転送前の潜伏期間は長くなりますが、プレートが水分を失い始め、寒天が食品バイアルへのクリーンな移動を損なう可能性があることに注意してください(図7)。 プレートが水和されたままで、数えき上げ中に胚の生存率が損なわれないようにするには、寒天面上に直接グースネックライトを使用することは避けてください(図7Eは適切な距離を示しています)。
- 数えた後、プレートをカバーし、転送する準備ができるまで湿気の多い部屋に保管します。調査結果を記録します。
4. ブドウ寒天ディスクを食品バイアルに移し、開発中の生存率を監視する
- 数字が記録されたら(孵化胚/L1/L2)、へらを使用してブドウ寒天ディスクを慎重にバイアルに移し、製造業者の指示に従って調製されたショウジョウバエ食品媒体を含む35mmディスクを収容できるほどの大きさのバイアルに移す(メーカーの指示に従って調製された)。試薬)。ブドウ寒天ディスクL1側を食べ物の下に置きます(図7)。 幼虫を持つ寒天ディスクを食物バイアルに移した後、空のペトリ皿を注意深く検査し、残された幼虫がないか調べます(図7E)。
- 毎日ほぼ同じ時間に食物バイアルを検査するスケジュールを設定し、L2/L3幼虫がバイアル内の食物に向かうのを観察することを確認します(図8)。
- 子犬と成人のショウジョウバエの数を記録します(図9)。これ以上の大人が観察されないまでカウントを続け、次の世代を数えるのを避けてください(最初の成人を観察した後9日を過ぎてもカウントしないでください)。
- 調査結果を観察し、記録します。使用されている変異株に応じて、胚の収集、カウント、および記録の時間枠を調整します。
- カイ二乗解析を実行します。帰無仮説は、成人の数が最初に記録され、食品バイアルに移された孵化胚とL1の数と等しくなることを100%の生存率を前提としています。
Representative Results
この方法は、正確かつ再現可能に、チク正方形分析に結合した場合、胚から出現した成人までの生存率を測定することができます。
最初の研究では、胚と幼虫を数えた後、ブドウ寒天はバイアルの側面に直立したバイアルの内側に置かれた。残念ながら、寒天がバイアルの側に置かれたとき、胚と幼虫の多くは成人に成熟しなかった。これは、ブドウ寒天ディスクが乾燥したためである可能性が高い(図3)。この配置は、結果を混乱させる可能性のある環境変数(寒天ディスクの水和)を導入しました。子孫の約39%は、成人のわずか61%が出現したので、胚から成人までの間で失われました。最大の損失は、L1幼虫(ブドウ寒天プレートの表面にカウントされる)と子犬(食物バイアルの壁にカウントされる)カウントの間に発生しました。しかし、ブドウ寒天を食品表面に直接接触してバイアルの内側に下向きに置くと、子孫の6%未満が失われました(図2)。ブドウ寒天ディスク全体がバイアル内のインスタント食品の水分と接触したままであったので、寒天は水分補給されたままでした(図7、図8)。これらの結果は、バイアル内の寒天の位置が信頼できるデータを得て、環境変数の寄与を最小限に抑えるために重要であることを示しています。この方法の有効性を支持するさらなるデータは、初期法の検証で使用される野生型の子孫と、バランスのとれたDm ime4変異株から男性に対してバージン野生型の雌を交渡することによって生成される子孫を比較することによって収集された(補足図2, ime4Δnull/TM3sb)野生型由来の子孫の94%に比べて成人期に成熟した子孫の約91%(図4)。 この差は統計的に有意ではなかった。
ホモ接済性Dm ime4変異雄5も、この方法のさらなる検証を提供するために用いた。しかし、ホモ接性変異体は、胚が沈着する前に繁殖し、死ぬには病気だった。したがって、実験の1つの制限は、男性が追跡する開始胚集団を生成するのに十分な健康である必要があることです。
図 1: Dm ime4変異株は、サブメンデリアンレベルで出現します。触媒ドメインまたはAdo-Met結合ドメインの一部が変異した株式を示す(詳細は補足図1を参照)。一部の株式は、どちらかのドメインの一部を Ala (アラニンスキャン変異)に置き換え、他の株式はどちらかまたは両方のドメインを削除しました。観察されたホモ接合数の数と予想される数の比率はパーセンテージで表されます(ヘテロ接合兄弟対照と比較して、ソートスキームとカイ二乗分析の補足図3を参照)。カイ二乗分析は、観測値と期待値の差が統計的に有意であり、偶然によるものではないかどうかを判断するために行われました(p値< 0.01)。誤差余数は、平均値の標準誤差を表します(クロスごとに最低3回の試行)。 すべてのデータを含むスプレッドシートは、補足資料で見つけることができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: バイアル内部の寒天位置は、意図しない環境変数を導入する可能性があります。発達の異なる段階における個体数のヒストグラムは、ブドウ寒天椎胚側から食物バイアルまたは食物バイアルの側の寒天にカウントされた。寒天ディスク胚側をバイアルに置くことは、成人になるまで生存する初期胚の94%(SD±0.02)をもたらした。食物バイアルの側面に寒天を置くと、もともと数えられた胚の61%(SD±0.07)しか成人期に達し得た。すべてのデータを含むスプレッドシートは、補足資料で見つけることができます。各段階での期待される数は、食物バイアルに移る前にブドウ寒天ディスクにカウントされた胚/L1の初期数として設定される(帰無仮説:孵化胚の100%が発症する)。観察された数は、示された発達段階でカウントされた実際の個体数です。したがって、各段階は、ブドウ寒天プレート上にカウントされた孵化胚の初期数と比較される。カイ二乗分析は、観測値と予想値の差が統計的に有意であり、p値しきい値0.05を使用した単独での偶然によるものではないかどうかを判断するために行われました。この差は、食物バイアルの側に寒天で成長した胚では有意であったが、椎間板胚側で成長した胚には有意ではなかった。誤差バーは標準誤差を表します(クロスごとに最低3回の試行が示されます)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:胚/L1を運ぶブドウ寒天ディスクを食品バイアル内に配置することができる2つの方法を示す漫画。食物バイアル中の寒天の位置に基づいて、胚の総数と成人子孫の間に有意な差があった。この違いは、食物バイアル内のディスク配置の違いによって生じる環境変数(水和)に起因する:寒天の場合、幼虫と子犬の予想数と観察数の間に統計的に有意な差がある。円盤は、寒天ディスクが食物と接触した場合に、予想数と観測数に有意な差が生じなかったのに対して、バイアルの側面に配置された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: Dm ime4変異体バランスストックからの野生型男性と男性の発達の異なる段階における個体数を示すヒストグラム。バランスの取れた雄は、2.1に記載されているように、処女野生型の女性に渡った。 寒天は胚側を食物バイアルに移した。 野生型X野生型のブドウ寒天椎間でカウントされた元胚から出現した成人の平均比率は94%、SD±0.02、Dm ime4変異体/+X野生型の割合は91%、SD±0.01であった。統計分析は、図 2に記載されているように実行されました。いずれのグループにおいても相違は大きくなかった。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 実験的なセットアップ。(A) 胚コレクションミニケージとブドウ寒天ミニペトリ料理。プレートは、脱水を防ぐために湿気のあるチャンバー(水で飽和吸収性紙ディスク付きの標準的なペトリ皿)の中に配置されます。 各ブドウ寒天プレートの中央に少量の酵母ペーストを配置しました。 (B)胚採取板ホルダー蓋(赤色)を取り外し、調製プレートを上に置き、酵母側を上に置く。 (C) 十字架を胚ケージに移し、すぐにペトリ皿の蓋を置いてハエを中に入れます。 (D) カバーを素早く取り外し、胚ケージをひっくり返して、ブドウ寒天プレートに接触させます。 24-48時間インキュベートし、毎日検査します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: ブドウ寒天プレート上の胚発生(A)ブドウ寒天ミニペトリ皿に堆積した野生型胚は、解剖顕微鏡下で数えられる。可視化しない場合は湿気の多い室内にプレートを保管し、脱水を防ぐために直接光を避けてください。 (B)ブドウ寒天プレートは湿気のある室内に保管され、孵化した野生型胚が記録される。 この写真は、Aに示す胚から発達した3匹の野生型L1幼虫を示しています。 (C)図5に示す2つのプレートについて、記録された胚数(1日目)及びL1幼虫(2日目)の例。 帰無仮説の「期待数」は、食物バイアルへの移植時に孵化してL1幼虫となった胚の数によって決定される(下図)。 野生型のハエの場合、ほとんどすべての胚が孵化し、L1幼虫に成長する。 これは、他の遺伝的背景の場合はそうではない可能性があり、この方法は、生存率のこれらの違いを決定するために使用されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: 幼虫を移送する。 (A) L1カウントを記録した後、ブドウ寒天ディスクは、クリーン(エタノール拭き)へらを用いてペトリ皿から慎重に除去し、L1サイドダウンしてDに示すようにバイアル内の食品に接触させる。 (E) 空のペトリ皿は、残された幼虫を検出するために慎重に検査されます。 残された幼虫が生きていて、食物バイアルに移すことができる場合は、慎重かつ直ちに行います(F)。 残された幼虫が死んでいるか、転送できない場合は、この事実を記録して、後続の計算のために「期待される数」を修正します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8:L2幼虫は食べ物に自分の道を作る.ブドウ寒天ディスクと青い食べ物の間の隙間と溝を参照してください。 バイアルを毎日観察するスケジュールを設定します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 9:大人登場。(A) L3幼虫は、子犬になるために食べ物から出て行く。 (B) 成人は11日目に出現し始める。 バイアルを毎日観察するスケジュールを設定し、好ましくは1日の同じ時間に、慎重にあなたの観察を記録します。 すべての子犬が出現したときにカウントを停止し(空の子犬のケースをカウント)、15日目に実験を停止してハエの次世代を数えるのを避け、もし(黒/乾燥した子犬)場合は死んだ子犬を数えます。 ライフサイクルが長い変異体は、より長い期間を必要とし、経験的に決定する必要があります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図。これらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足資料。これらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
要約すると、この方法は、ショウジョウバエにおける生存率の正確かつ簡単な評価を提供する。プロトコル全体の完了には約 14 日かかります。この手順には、専門的な技術的なスキルは必要ありません。しかし、正確性と再現性を高めるには、適切なタイミング、日常的な観測のスケジュール、注意深い寒天の移動が重要です。
ブドウ寒天椎胚側を食物バイアルに配置することに加えて、この手順のもう一つの重要なステップは、胚採取ミニケージからブドウ寒天プレートを取り除いた後、遅くとも48時間以内に寒天ディスクを食品バイアルに移す。48時間後に寒天を転写すると、寒天ディスクの脱水に起因する可能性が高い胚および幼虫の損失をもたらした。L2/L3遷移をカウントするには、プレートを72時間インキュベートする必要があります。この段階が重要である場合は、ブドウ寒天プレートを厚く注ぎ、湿気の多い部屋は乾燥を防ぐために使用する必要があります。十字架は35のmm版を収容する胚のコレクションケージで設定された;しかし、この手順は、60 mm または 100 mm ペトリプレートを収容する例など、より大きな胚採取ケージを使用して実行することもできます。 食品ボトルは、それらのサイズを収容するのに十分な大きさでなければなりません。
このプロトコルに追加できる手順があります。前述のように、L2/L3遷移は、必要な時間と寒天の潜在的な脱水のためにプレート上で定量化することは困難です。さらに、幼虫は寒天の表面で非常に移動性になり、それらを正確に数えるのが難しくなります。L2/L3幼虫を数える前に寒天の表面に軽度の麻酔薬(リドカイン溶液)を数滴入れるか、冷蔵庫にプレートを置くか、より正確に数えるために彼らの動きを遅くするのに役立ちます。 これらの変更に対する注意点は、変数(冷たい感度、麻酔感度)を導入し、生存率の結果を混乱させる可能性があることである。 これらのステップがなくても、着色食品を使用することで、研究者は、彼らが子犬を開始するために食品バイアルの側に落ち着くように放浪L3s/準備を定量化することができます。この方法の制限は、胚コレクションケージ内の十字架を設定するために、表現型のためにCO2で麻酔されて生き残るために十字架で使用される大人を必要とすることです。Dm ime4ホモ接質変異体オスは、CO2治療から目を覚ます数時間後によく回復し、死亡する。 大人を仕分けのために固定する他の方法は、数分間冷蔵庫にバイアルを置き、その後、動きを遅くし、迅速かつ効率的にソートするために砕いた氷にバイアルを転送するなど、探索することができます。
アレーラの強さと生存率への影響を比較する以外に、この方法は、定義された医薬品化合物に対する感度または耐性をスクリーニングするために使用することができます。細胞培養15、16、17、18における化合物毒性をスクリーニングする他の方法とは異なり、この方法は全生物を使用し、発達効果の評価を分析しやすくする。要するに、このプロトコルとそれに加えて、腐血強度だけでなく、環境因子および化学化合物がショウジョウバエの生存率、生殖能力、生殖能力、寿命、および持続時間に及ぼす影響を測定することができます。発達サイクル。
Disclosures
利益相反はありません。
Acknowledgments
私たちの仕事は、CFHとNIH PA -12-149 TO CFHにNIH 1R15GM1131-01によって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
References
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