Summary
抗体标记、光学清除和高级光显微镜相结合,可对完整的结构或器官进行三维分析。本文介绍的是将厚肾切片的免疫标记、光学清除与乙酰辛纳酯和共聚焦成像相结合的简单方法,可实现三维肾脏结构的可视化和定量。
Abstract
光学清除技术通过在样本中平衡折射率,从而使组织透明,以便进行后续的三维(3-D)成像。他们在所有研究领域都备受关注,因为有可能分析跨越宏观距离的微观多细胞结构。鉴于肾小管、血管、神经和肾小球向多个方向延伸,而迄今为止,传统二维技术仅部分捕获了这些小球,组织清除也开辟了肾脏研究的许多新领域。光学清除方法列表正在迅速增加,但该领域的初学者仍然难以为给定的研究问题选择最佳方法。这里提供了一个简单的方法,结合抗体标记厚小鼠肾片;光学清除,具有廉价、无毒和即用化学乙基辛酸酯;和共聚焦成像。该协议描述了如何注入肾脏并使用抗原检索步骤来增加抗体结合,而无需专门的设备。其应用在肾脏内不同的多细胞结构成像中,并解决了组织中抗体渗透不良的问题。我们还讨论了成像内源性荧光道和获取非常大的样本的潜在困难以及如何克服它们。这个简单的协议提供了一个易于设置和全面的工具,以研究三维组织。
Introduction
研究整个器官或大型多细胞结构的兴趣日益浓厚,因此发展了光学清除方法,涉及三维透明组织的成像。直到最近,估计整个结构的细胞数、长度或体积的最佳方法是立体学或详尽的序列切片,它基于组织的系统采样,以便随后在两个维度1中进行分析。2,3.然而,这些方法非常耗时,需要高水平的培训和专业知识4。光学清除方法克服了这些问题,通过平衡整个样品的折射率,使组织半透明为3-D成像5,6,7。
已开发几种光学清除方法,主要分为两类:溶剂型和水基法。水基方法可进一步分为简单浸没8、9、超水化10、11和水凝胶嵌入12、13。溶剂型方法使组织脱水,去除脂质,并将折射率标准化至1.55左右。大多数溶剂型方法的局限性是淬火常用报告蛋白的内源性荧光,如GFP、溶剂毒性、某些成像室或物镜中使用的溶解胶的能力,以及组织在脱水14,15,16,17,18,19,20,21。然而,溶剂型方法简单、高效,可在许多不同的组织类型中工作。
基于水性的方法依赖于组织浸入水溶液中,其折射率在1.38-1.528、11、12、22、23、24之间.这些方法是为了保持内源荧光报告器蛋白的排放和防止脱水引起的收缩而开发的,但大多数基于水性清除方法的局限性包括延长协议持续时间、组织扩张和蛋白质修饰(即在高保湿协议中,如ScaleA2)7、11、23、25中,尿素对蛋白质进行部分变性。ScaleS通过结合尿素与山梨醇来解决组织扩张问题,通过脱水尿素引起的组织扩张来平衡,并保存了电子显微镜10评估的组织超微结构。组织收缩或扩张影响结构的绝对大小、物体之间的距离或每个体积的细胞密度;因此,在组织清理时测量大小变化可能有助于解释获得的结果7,26。
通常,光学清除协议由多个步骤组成,包括预处理、渗透、免疫标记(如果需要)、折射率匹配以及使用高级光显微镜成像(例如,双光子、共聚焦或光片荧光显微镜)。大多数的清除方法已经开发可视化神经元组织,和新兴的研究已经验证了其在其他器官的应用5。这个综合工具已经证明,允许可靠和高效的肾脏结构分析,包括肾功能质27,28,免疫渗透28,血管28,和管状段29,它是一种理想的方法,以更好地了解肾小球功能和管状重塑在健康和疾病。
这里总结的是一种溶剂型方法,结合了肾小管的免疫染色;光学清除与廉价,无毒,和现成的化学乙基锡化酯(ECi);和共聚焦显微镜成像,允许完整的小管可视化和定量。这种方法很简单,将肾切片的抗原回收与商业抗体的染色相结合,不需要专门的设备,这使得大多数实验室都能使用。
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Protocol
注:此处描述的所有实验程序均获得美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 以及德国 Aachen 相关地方当局的批准。
1. 逆行腹部主动脉灌注和小鼠肾脏固定
- 准备解决方案的前一天或晚上,并储存在冰箱过夜。使用前加热至室温 (RT) 的解决方案。
-
在 1x 磷酸盐缓冲盐 (PBS) 中制作一批 3% 的甲醛 (PFA)。每只鼠标需要大约 50-100 mL PFA。
- 使 1 L 的 PFA:重量为 30 g PFA,并在烟机中加入 800 mL 的蒸馏水。搅拌并加热至50-60°C。不要加热超过 70°C。
注意:PFA 是有毒的。在烟罩中准备 PFA。 - 缓慢添加几滴 2N NaOH。等待几分钟,直到 PFA 进入解决方案或添加更多滴。一些小块不会溶解。
- 从热中取出溶液。添加 50 mL 的 20x PBS。冰冷到RT。
- 使用 HCl 将 pHH 调节到 7.3-7.4,将蒸馏水加到 1 L。
- 使用 0.22 μm 过滤器过滤 1x PBS 和 3% PFA,去除所有未溶解颗粒。
- 使 1 L 的 PFA:重量为 30 g PFA,并在烟机中加入 800 mL 的蒸馏水。搅拌并加热至50-60°C。不要加热超过 70°C。
- 将 1,000 个单位的肝素添加到 1 L 的 1x PBS 中。将含有肝素和3%PFA的1xPBS转移到单独的50 mL塑料注射器中。
注:如果可用,压力控制泵设置为 80-100 mmHg 或静水压力(滴灌方法,灌注溶液的高度:160-200 厘米以上动物)可用于肾脏灌注。 - 连接 PBS、PFA 和钝化的 21 G 蝴蝶针到三向止路。确保整个系统中没有气泡。
- 标记一个 15 mL 锥形管,并在其中分配 10 mL 的 PFA。
- 使用120毫克/千克体重氯胺酮和16毫克/千克体重的木兰素对雄性或雌性C57BL/6小鼠12-24周年龄进行深度麻醉。在进行手术之前,必须通过捏合反射(例如,脚趾捏反射)来检查动物完全没有反应能力。
- 一旦动物到达麻醉的手术平面,将其放在解剖显微镜下的背部。手术打开腹部与中线腹部切口使用手术剪刀和暴露腹部主盘。
- 用弯曲的节位将腹部主动脉夹在分支上方,以弯曲的节位。然后用微丝精将腹部主动脉紧紧在肾动脉下方。用范纳斯剪刀在两个夹子之间的腹部主塔上做一个小切口(1毫米)。将蝴蝶针慢慢插入切口,小心不要撕开腹部主盘。
- 使用 5-0 丝缝合线将右肾动脉缝合,如果灌注和固定只需要一个肾脏,则取出右肾进行其他分析。
- 取出微丝化,用vannas剪刀将门静脉转断,并立即注入含有肝素的50 mL的PBS,然后切换并注入50 mL的3%PFA。
注:需要通过腹部大方大方打开肾小管的高灌注压力,以便更好的抗体通过组织扩散。通过心脏灌注可能不会打开肾小管。 - 仔细收集注入的肾脏,避免刺穿或挤压组织。
- 取出胶囊,将肾脏切成1毫米厚的日冕切片。使用切片矩阵 (材料表) 来标准化切片厚度.
注:或者,考虑使用振动。 - 将肾切片与准备好的PFA浸入标记的15 mL锥形管中。
- 将 10 mL 的 PFA 分给另一个标有 15 mL 的圆锥形管。在移动到下一个鼠标之前,用 PBS 冲洗三向止动孔和蝴蝶针。
- 在RT保护下进行夜间固定后,防止光线照射。
2. 组织制备和免疫染色
- 固定后,用1x洗涤缓冲液(材料表)在RT的水平摇臂上清洗肾片两次,1小时。
- 执行抗原检索。在 500 mL 烧杯中将 300 mL 的 1x 抗原解合溶液 (T能材料)加热至 92-98 °C。将切片包裹在可渗透的嵌入盒中,在92-98°C下搅拌1小时。将烧杯从热中取出,使其冷却至 RT。
注:一些供应商测试其抗体的免疫组织化学应用,并在数据表中包括建议的抗原检索方法。因此,某些表型可能需要更基本的缓冲液(例如 pH 9)。 - 将切片转移到 10 mL 的 1x 洗涤缓冲液中,带 0.1% Triton X-100,在 RT 上过夜。用 10 mL 的新鲜 1x 洗涤缓冲液将切片洗涤 2x,第二天为 1 小时。
- 在500μL的正常抗体稀释剂(材料表)中稀释原抗体。从浓度为 1:50-1:100 开始。在37°C下,在稀释的原抗体中轻轻摇动肾片4d。
注:由于每种抗体都有独特的特性,抗体孵育和抗体稀释期间的温度需要针对单个探针进行优化。对于二级抗体控制,在没有原抗体的情况下,在稀释剂中孵育肾脏组织。代替商业抗体稀释剂,1x PBS与0.1%Triton X-100和0.01%钠阿齐德可以使用。 - 在 RT 过夜,在 10 mL 的 1x 洗涤缓冲液中清洗肾片,8 小时后更换一次洗涤缓冲液。
- 在500μL的正常抗体稀释剂中稀释二级抗体(例如,Alexa Flu-结合二级抗体为1:100)。在37°C下,在稀释的二级抗体中孵育肾片4天。从此步骤开始,保护肾片免受光线照射。
- 在RT处用10 mL的1x洗涤缓冲液清洗肾片,8小时后更换一次洗涤缓冲液。
3. 组织清理
- 将肾片转移到5 mL的高档100%乙醇(材料表)2小时在RT与温和的摇动(一个改变新鲜乙醇后1小时)。此步骤用于组织脱水。
注:下一步需要高等级乙醇来实现高组织半透明性。甲醇或四氢草是具有高降脂电位的替代脱水试剂。 - 将肾切片浸入 2 mL 的 ECi (材料表) 与轻柔的摇动在RT (与一个改变到新鲜的ECi后2小时)过夜.
注:ECi的冻结/熔点为6-8°C。因此,请勿将样品存放在冰箱中。浸泡在通风良好的烟罩中,避免直接接触衣服和皮肤(ECi是食品药品管理局批准的无毒化合物,但气味强烈)。使用常规的 Eppendorf 管或玻璃容器(无聚苯乙烯容器)。 - 在ECi浸入和肾切片准备好成像后,可以实现组织半透明。
4. 共聚焦成像和图像分析
注:对于成像,只要折射率匹配解决方案与物镜兼容,就可以使用其他显微镜技术。该协议使用倒置共聚焦显微镜。
- 将 600-1,000 μL 的 ECi 添加到玻璃底部盘 (材料表) 中。
注:避免使用常规细胞培养皿,因为ECi是一种有机溶剂,可以溶解塑料餐具。同样,ECi 可能会攻击物镜上的塑料部件/绝缘环。有关兼容成像皿30和自制三维打印室28的概述,请参阅相应的报告。 - 将半透明肾片转移到盘中。在肾片上放置一个圆形盖玻片,对玻璃底部施加轻压。用石蜡薄膜密封盘子 (材料表) 以避免 ECi 泄漏.
注:整个器官或几毫米厚的组织切片可能需要在组织周围使用边框(牙科水泥或硅胶弹性体;参见材料表),才能为样品制作一个 ECi 池。 - 将盘子放在显微镜成像平台上。
- 取几个 z 堆栈并执行拼接。从 5 μm 的 z 步长大小开始。
注:考虑使用长工作距离(>5 mm)和高数值孔径(>0.9)目标对非常厚的组织切片或器官进行成像。成像后,将组织转移回乙醇,并储存在洗涤缓冲液或PBS与0.02%钠阿齐德。 - 使用软件(材料表)使用三维渲染分析图像。
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Representative Results
肾脏是复杂的器官,由43种不同的细胞类型组成31。这些细胞大多形成大型多细胞结构,如球红蛋白和管状物,其功能高度依赖于相互作用。经典的二维组织学技术部分地捕捉了这些大型结构,并可能错过完整结构中的焦移31。因此,使用光学清除技术进行三维分析有助于了解它们在健康和疾病中的作用。
大多数溶剂型光学清除技术至少会部分淬火内源荧光报告蛋白信号。在脱水和用ECi进行光学清除时观察到YFP标记的帕瓦巴平的淬火(图1)。然而,其他强荧光蛋白可能抵抗信号淬火,而pH到基本水平(pH8-11)的调节可以稳定内源性荧光蛋白14、20、28、30。此外,如果需要荧光蛋白排放保存,就应考虑以水为基础的方法。在目前的报告中,证明这种基于溶剂的清除方案与抗体标记兼容;虽然,它仍然是具有挑战性的实现深层免疫标签的组织,特别是在密集的细胞丰富的器官,如肾脏。
然后进行肾脏的逆行腹部主动脉灌注,以去除血细胞并打开小管(图2A,B)。这种方法可降低自荧光,提高抗体扩散。抗体浓度取决于组织的大小和抗原的丰度。因此,表面信号可能与抗体渗透不良或抗体量不足有关(图3A,B,另见电影1)。对于大样本或极其丰富的标记物,可能需要在 1-2 天后增加抗体浓度和补充抗体。如果感兴趣的抗原在肾血管中表达,应考虑在血管内传递抗体(图3C)。然而,由于分子大小,针对小管上皮细胞的表膜中蛋白质的抗体不会穿过球状过滤屏障,从而在血管和肾小球体内引起非特异性信号(图3D)。
该协议可应用于肾切片或整个肾脏 (图 4A,B)。为了测试抗体特异性,只对二次抗体进行对照(图4C)。组织可以用抗体标记,以检测特定的细胞群(例如增殖细胞,图4D)或使用段特异性抗体(图4E)可视化整个小管段。此外,多种抗体的组合为三维中不同蛋白质的共位化提供了机会(例如,在不同刺激下小管重塑中检测段特异性管状的管状增生)(图4F,G;另请参阅电影 2。
图1:内源荧光报告蛋白信号的淬火。(A) 从帕夫巴平YFP®转基因小鼠中提取的内源荧光报告蛋白可检测为5μm薄PFA固定冷冻肾部分。箭头标记一些荧光标记的帕弗巴平-细胞位于远端复杂小管的早期。(B) 在肾脏组织的光学清除后,没有明显的荧光信号。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:肾脏灌注质量评价。(A) 周期性酸希夫 (PAS) 染色石蜡嵌入组织 (5 μm 薄部分) 显示很少的管状与稍微打开的流明 (通常近端小管具有刷边框; 参见箭头)。(B) 所有小管在良好的肾脏灌注后都打开。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:排除全装免疫标签的故障。(A,B)厚厚的肾片上沾有一种抗体,用于对抗氯化钠共运剂-2(NKCC2),这种抗体在Henle循环的厚上升肢体中表达。信号在组织表面可检测到(箭头在 (B)中)。然而,抗体没有渗透到组织[见箭头在(B)]。(C) 血管内抗体注射靶向血管中表达的蛋白质(例如CD31)允许快速和均匀的血管染色。具有强烈信号的圆形结构是Glomeruli。(D) 然而,针对小管上皮膜中表达的蛋白质的抗体(例如,磷酸化钠-氯化钠共运剂(磷-NCC),在远端卷曲管中表达)不会穿过球状过滤屏障,从而在血管中造成非特定信号(参见箭头指向动脉和其他容器)和glomeruli(参见箭头)。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:免疫标记光学清除肾组织的代表性结果。(A,B)该协议允许整个肾脏的光学清除。(C) 代表z-堆栈,显示没有非特异性结合的二次抗体作为对照,无需事先孵育。(D) 具有代表性的 z-stack 的三维可视化显示增殖的溴modeoxyuridine (BrdU)–肾髓母细胞。(E) 使用针对水孢素-2 (AQP2) 的抗体来可视化髓收集管道。(F,G)分析和定量在AQP2 + 髓收集管道内的BrdU+细胞。有关 (F,G),请参阅影片 2。这个数字已由萨里塔斯等人29修改。请点击此处查看此图的较大版本。
影片 1(与图 3相关):NKCC2 的三维可视化=Henle 循环的粗升边。影片展示了在光学清除的肾脏切片中抗体渗透不良。请点击此处下载视频。
影片 2(与图 4相关):BrdU+细胞和 AQP2+髓量收集管在光学清除的肾片中的三维可视化。显示 BrdU+细胞(红色)和 AQP2=髓收集管道(绿色)。Imaris 斑点和表面算法用于确定 BrdU+细胞外(绿松石点)或内部(粉红色斑点) AQP2+小管(绿色表面)。这部电影最初出现在萨里塔斯等人。29.请点击此处下载视频。
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Discussion
光学清除技术在各种器官的三维可视化和微解剖学定量方面得到了广泛的关注。在这里,溶剂型清除方法(ECi)与免疫标签相结合,用于肾切片中整个小管的三维成像。此方法简单、便宜且快速。然而,其他研究问题最好用其他结算协议5来回答。同样重要的是要记住,溶剂型方法导致组织收缩在可变程度,主要是由于脱水步骤14,18。大多数溶剂型方法(例如,ECi 14)也至少部分淬火了报告机的内源性荧光,如GFP或tdTomato;因此,FDISCO32、 CLARITY12或 CUBIC11可以作为替代协议。然而,ECi的淬火效果是可变的,取决于每个报告器鼠标28的个体构造。此外,使用1)荧光抗体对抗GFP和其他记者从或2)改性溶剂基协议,保留内源荧光信号30,32也可以是一种替代方法,在这种情况下。值得一提的是,几个组已经测试了基于水性的协议24,33,34的相容性,以三维方式可视化RNA,而溶剂型清除方法尚未经过测试。因此,在考虑RNA分析时,应优先考虑基于水的清除方法,如CLARITY33的修改版本。
感兴趣的细胞或基因产物可以用具有内源性荧光蛋白表达的转基因小鼠进行可视化,但基因工程小鼠线的生成既耗时又昂贵。因此,抗体标记更实用,也提供了更大的灵活性,尽管大组织的免疫标签具有挑战性。与最初的ECi协议14相比,我们的方法结合了改进的ECi光学清除方法和免疫标记,它使用抗原检索步骤。热诱导抗原检索将变性蛋白质,但有助于恢复在PFA固定35期间抗原性损失,并改善抗体结合。
此协议中有几个关键步骤。首先,重要的是做好肾脏的灌注。含有红血球的血红蛋白限制了成像深度7,开放流明的扩大小管可增强抗体渗透。小管的开口还可以更好地区分上皮膜中表达的蛋白质与相反侧的其他表达的蛋白质。然而,人工扩张的管状可能对小管结构和掩蔽肾脏的特定病理生理反应(例如,受伤的近小管扩张),但不是健康的小管36。其次,抗体在37°C而不是4°C或RT下孵育,提高抗体渗透率27。然而,每个抗体都有独特的特性;因此,抗体孵育期间的温度需要针对单个探针进行优化。第三,使用AlexaFluor-647(远红光谱)二级抗体有助于提高信噪比,特别是因为肾脏在蓝绿光谱37中释放出大量的自荧光。
逆轨注射14或灌注肾38与荧光酸结合抗体对血管中表达的蛋白质是标记肾血管的优雅和快速的方法。然而,小管膜中的蛋白质仍然无法通过血管内注射,因为抗体不能通过肾小球过滤屏障,其截止分子量过滤蛋白质的范围在60-65 kDa范围内。因此,使用小型抗体片段和工程变体,如 Fab 片段 (+55 kDa)、抗体 (+50 kDa)、串联 scFv (+28 kDa) 或核酸贴片 (#6-30 kDa),具有保留的抗体分子识别特性,可提供有机会进入小管的膜38,39。此外,将小抗体片段与电场40或压力13结合,或使用硫酸钠(SDS)的清除方案去除脂质24、41、42可实现组织快速有效的抗体渗透。
几个小组证明,用清除试剂灌注不仅缩短了协议时间,而且增加了组织透明度19,24,43,44。因此,应考虑用脱水和折射指数匹配的肾脏灌注腹部主动脉或肾动脉,以实现更好更快的组织清除。然而,我们没有给整个肾脏注入清除试剂,并且由于几个原因使用了切片肾脏。首先,通过从一个肾脏中标记多个肾片的抗体标记,可以直观地显示不同的抗原。其次,与整个肾脏相比,对肾片进行免疫标记所需的时间和抗体更少。第三,对大型样品进行三维成像可生成高达数 TB 的数据集,这对大多数工作站来说可能难以管理。因此,来自组织切片或较大文件子集的数据更便于执行复杂的操作,如自动计数或距离测量。
在此协议中,共聚焦显微镜用于使用单细胞分辨率进行成像,这在共定位研究中特别相关。然而,共聚焦成像需要激光扫描,因为它的成像速度仅适用于小块清除的组织。为了对多细胞结构(如长管段甚至整个器官)进行三维形态分析,需要更快的显微镜技术,如光片荧光显微镜(LSFM)。当细胞分辨率不是必要的时,LSFM 允许快速成像。例如,最近通过结合全安装免疫标记、基于CLARITY12和LSFM29的光学清除来评估远端复杂小管的长度。不幸的是,商业LSFM价格昂贵,并不总是与溶剂型清算协议兼容。事实上,CLARITY被选作这项研究,因为我们特定的LSFM与CLARITY定制的目标与ECi29不兼容。然而,克林伯格等人证明,ECi原则上与LSFM14兼容。
最后,演示了一种基于ECi的简单光学清除方法,该方法可用于任何使用厚度从±100μm到几毫米的固定组织切片的研究项目。它还允许以前需要几乎详尽完成工作的可行分析,并消除了与形态二维分析相关的必要假设和推论。全装免疫标签、光学清除和高级光显微镜相结合,将有助于促进对健康和疾病中细胞功能的理解。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
T. S. 得到 DFG 德国研究基金会 (332853055)、埃尔塞·克鲁纳-弗雷塞纽斯-斯蒂夫通 (2015_A197) 和 RWTH Aachen 医学院(RWTH 返回计划)的资助。V.G.P.由德国格塞尔舍夫毛皮尼腓罗基、亚历山大·冯·洪堡基金会和澳大利亚国家健康和医学研究委员会的研究奖学金提供支持。D. H. E 由 LeDucq 基金会支持。R. K. 得到 DFG(KR-4073/3-1、SCHN1188/5-1、SFB/TRR57、SFB/TRR219)、北莱茵威斯特法伦州(MIWF-NRW)和RWTH Aachen大学跨学科临床研究中心(O3-11)的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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