Summary
La combinación de etiquetado de anticuerpos, limpieza óptica y microscopía de luz avanzada permite el análisis tridimensional de estructuras u órganos completos. Aquí se describe un método sencillo para combinar la inmunoetiquetado de rodajas renales gruesas, la limpieza óptica con la canela etílico y la imagen confocal que permite la visualización y cuantificación de estructuras renales tridimensionales.
Abstract
Las técnicas de limpieza óptica hacen que el tejido sea transparente equilibrando el índice de refracción a lo largo de una muestra para imágenes tridimensionales posteriores (3-D). Han recibido gran atención en todas las áreas de investigación por el potencial de analizar estructuras microscópicas multicelulares que se extienden a lo largo de distancias macroscópicas. Dado que los túbulos renales, la vasculatura, los nervios y los glomérulos se extienden en muchas direcciones, que sólo han sido capturados parcialmente por técnicas bidimensionales tradicionales hasta el momento, la limpieza de tejidos también abrió muchas nuevas áreas de investigación renal. La lista de métodos de compensación óptica está creciendo rápidamente, pero sigue siendo difícil para los principiantes en este campo elegir el mejor método para una pregunta de investigación dada. Aquí se proporciona un método simple que combina el etiquetado de anticuerpos de rebanadas gruesas de riñón de ratón; limpieza óptica con canela etílico química barata, no tóxica y lista para usar; e imágenes confocales. Este protocolo describe cómo perfumar los riñones y utilizar un paso de recuperación de antígenos para aumentar la unión de anticuerpos sin necesidad de equipos especializados. Su aplicación se presenta en imágenes de diferentes estructuras multicelulares dentro del riñón, y se aborda cómo solucionar la mala penetración de anticuerpos en el tejido. También discutimos las posibles dificultades de la toma de imágenes de fluoróforos endógenos y la adquisición de muestras muy grandes y cómo superarlas. Este sencillo protocolo proporciona una herramienta completa y fácil de configurar para estudiar el tejido en tres dimensiones.
Introduction
El creciente interés en estudiar órganos enteros o grandes estructuras multicelulares ha llevado al desarrollo de métodos de limpieza óptica que implican imágenes de tejido transparente en tres dimensiones. Hasta hace poco, los mejores métodos para estimar el número de células, la longitud o el volumen de estructuras enteras han sido la estereología o la sección serial exhaustiva, que se basa en el muestreo sistémico de tejido para su posterior análisis en dos dimensiones1, 2 , 3. Sin embargo, estos métodos consumen mucho tiempo y necesitan un alto nivel de formación y experiencia4. Los métodos de limpieza óptica superan estos problemas equilibrando el índice de refracción a lo largo de una muestra para hacer que el tejido sea translúcido para imágenes 3D5,6,7.
Se han desarrollado varios métodos de compensación óptica que se dividen en dos categorías principales: métodos basados en disolventes y acuosos. Los métodos acuosos se pueden dividir aún más en una inmersión simple8,9, hiperhidratación10,11,e hidrogel incrustando12,13. Los métodos a base de disolventes deshidratan el tejido, eliminan los lípidos y normalizan el índice de refracción a un valor alrededor de 1,55. Las limitaciones de la mayoría de los métodos basados en disolventes son el enfriamiento de la fluorescencia endógena de proteínas de reportero de uso común como GFP, toxicidad de disolventes, capacidad para disolver los pegamentos utilizados en algunas cámaras de imágenes u lentes objetivas, y contracción del tejido durante deshidratación14,15,16,17,18,19,20,21. Sin embargo, los métodos basados en disolventes son simples, eficientes en el tiempo y pueden funcionar en varios tipos de tejidos diferentes.
Los métodos acuosos se basan en la inmersión del tejido en soluciones acuosas que tienen índicesrefractivos en el rango de 1,38-1,52 8,11,12,22,23,24 . Estos métodos fueron desarrollados para preservar la emisión de proteínas fluorescentes endógenas de reportero y prevenir la contracción inducida por la deshidratación, pero las limitaciones de la mayoría de los métodos de limpieza a base acuosa incluyen una mayor duración del protocolo, expansión de tejidos y modificación proteica (es decir, desnaturalización parcial de proteínas por urea en protocolos hiperhidratantes como ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS abordó la expansión del tejido mediante la combinación de urea con sorbitol, que contrarresta por deshidratación la expansión del tejido inducida por la urea, y preserva la ultraestructura del tejido según lo evaluado por la microscopía electrónica10. La contracción o expansión del tejido afecta a los tamaños absolutos de las estructuras, las distancias entre los objetos o la densidad celular por volumen; por lo tanto, la medición de los cambios de tamaño al limpiar el tejido puede ayudar a interpretar los resultados obtenidos7,26.
En general, un protocolo para la compensación óptica consta de múltiples pasos, incluyendo pretratamiento, permeabilización, inmunoetiquetado (si es necesario), coincidencia de índices de refracción e imágenes con microscopía de luz avanzada (por ejemplo, bitótno, confocal o microscopía de fluorescencia de láminas de luz). La mayoría de los enfoques de limpieza se han desarrollado para visualizar el tejido neuronal, y estudios emergentes han validado su aplicación en otros órganos5. Esta completa herramienta se ha demostrado previamente para permitir un análisis fiable y eficiente de las estructuras renales, incluyendo glomérulos27,28, infiltrados inmunes28, vasculatura28,y segmentos de túbulos 29, y es un enfoque ideal para mejorar la comprensión de la función glomerular y la remodelación de túbulos en salud y enfermedades.
Aquí se resume un método a base de disolvente que combina inmunomanchado de túbulos renales; limpieza óptica con canela etílico química barata, no tóxica y lista para usar (ECi); y la imagen por microscopía confocal que permite la visualización y cuantificación completa de los túbulos. Este método es simple, combina la recuperación de antígenos de rodajas de riñón con la tinción de anticuerpos comerciales, y no requiere equipo especializado, lo que lo hace accesible a la mayoría de los laboratorios.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos experimentales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU., y las autoridades locales pertinentes en Aquisgrán, Alemania.
1. Perfusión aórtica abdominal retrógrada y fijación de riñones de ratón
- Prepare las soluciones el mismo día o la noche anterior y guárdelas en una nevera durante la noche. Soluciones cálidas a temperatura ambiente (RT) antes de usar.
-
Haga un lote nuevo de 3% de paraformaldehida (PFA) en 1 salina con búfer de fosfato (PBS). Se necesitan alrededor de 50-100 mL PFA por ratón.
- Para hacer 1 L de 3% PFA: Pesar 30 g de PFA y añadir 800 mL de agua destilada en la campana de humo. Revuelva y caliente a 50-60 oC. No calentar por encima de 70 oC.
ADVERTENCIA: La PFA es tóxica. Prepare PFA en la campana de humos. - Agregue lentamente varias gotas de 2N NaOH. Espere unos minutos hasta que el PFA entre en la solución o agregue algunas gotas más. Algunos trozos pequeños no se disolverán.
- Retire la solución del fuego. Agregue 50 mL de 20pbS. Enfríe en hielo a RT.
- Ajuste el pH a 7.3-7.4 con HCl. Añadir agua destilada a 1 L.
- Elimine las partículas no disueltas filtrando 1 x PBS y 3% de PFA con un filtro de 0,22 m.
- Para hacer 1 L de 3% PFA: Pesar 30 g de PFA y añadir 800 mL de agua destilada en la campana de humo. Revuelva y caliente a 50-60 oC. No calentar por encima de 70 oC.
- Agregue 1.000 unidades de Heparina a 1 L de 1x PBS. Transfiera 1 PBS que contenga heparina y 3% de PFA en 1pbS en jeringas de plástico separadas de 50 ml.
NOTA: Si está disponible, la bomba a presión controlada a 80-100 mmHg o la presión hidrostática (método de goteo, la altura de las soluciones de perfusión: 160-200 cm por encima del animal) se puede utilizar para la perfusión renal. - Conecte el PBS, pfA y una aguja de mariposa de 21 G con contundente a una aguja de tres vías. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en todo el sistema.
- Etiquetar un tubo cónico de 15 ml y dispensar 10 ml de PFA en él.
- Anestesia profundamente un ratón C57BL/6 masculino o femenino de 12-24 semanas de edad usando 120 mg/kg de ketamina corporal y 16 mg/kg de xilazina de peso corporal. El animal debe ser revisado para la ausencia completa de capacidad de respuesta pellizcando los reflejos antes de proceder a la cirugía (por ejemplo, reflejo de pellizcar del dedo del dedo del tiempo).
- Una vez que el animal haya alcanzado un plano quirúrgico de anestesia, colóquelo en su espalda bajo el microscopio de disección. Abra quirúrgicamente el abdomen con una incisión abdominal de línea media con unatijera de funcionamiento y exponga la aorta abdominal.
- Sujeta la aorta abdominal justo encima de la ramificación hasta la arteria ilíaca con un hemostat curvo. Luego sujeta la aorta abdominal justo debajo de las arterias renales con un micro serrefine. Hacer una pequeña incisión (1 mm) en la aorta abdominal entre las dos abrazaderas con tijeras de vannas. Inserte la aguja de mariposa en la incisión lentamente y tenga cuidado de no abrir la aorta abdominal.
- Ligar la arteria renal derecha con una sutura de seda 5-0 y extraer el riñón derecho para otros análisis si sólo se necesita un riñón para la perfusión y la fijación.
- Retire el micro serrefine, transborde la vena porta con tijeras de vannas e persiga inmediatamente con 50 ml de PBS que contenga heparina, luego cambie y persiga con 50 ml de 3% de PFA.
NOTA: Se requiere una alta presión de perfusión a través de la aorta abdominal para abrir los túbulos renales para una mejor difusión de anticuerpos a través del tejido. La perfusión a través del corazón puede no abrir los túbulos renales. - Recoja el riñón perfundido cuidadosamente y evite pinzar o apretar el tejido.
- Retire la cápsula y corte el riñón en rodajas coronales de 1 mm de espesor. Utilice una matrizdesegmentación de datos (Tabla de materiales) para estandarizar el espesor de la rebanada.
NOTA: Alternativamente, considere el uso de un vibratome. - Sumerja las rodajas renales con el PFA preparado en el tubo cónico de 15 ml etiquetado.
- Dispensar 10 ml de PFA a otro tubo cónico de 15 ml etiquetado. Enjuague la aguja de la aguja de la aguja de la aguja del tapón y la mariposa de tres vías con PBS antes de pasar al siguiente ratón.
- Lleve a cabo la post-fijación durante la noche en RT protegido de la luz.
2. Preparación e inmunofinación de tejidos
- Después de la post-fijación, lave la rebanada de riñón dos veces con 1x tampón de lavado (Tablade Materiales)durante 1 h en un balancín horizontal en RT.
- Realizar la recuperación de antígenos. Calentar 300 ml de 1x solución de desenmascaramiento de antígeno (Tcapaz de Materiales)en un vaso de precipitados de 500 ml a 92-98 oC. Encierre la rebanada en el cassette de incrustación permeable al tampón calentado con agitación durante 1 h a 92-98 oC. Retire el vaso de precipitados del fuego y déjelo enfriar a RT.
NOTA: Algunos proveedores prueban sus anticuerpos para la aplicación de inmunohistoquímica e incluirán un método de recuperación de antígenos sugerido en la hoja de datos. Por lo tanto, algunos epítopos pueden requerir un tampón más básico (por ejemplo, pH 9). - Transfiera la rebanada en 10 ml de tampón de lavado 1x con 0,1% De Tritón X-100 y roca durante la noche en RT. Lavar las rodajas 2x con 10 ml de tampón de lavado fresco 1x durante 1 h al día siguiente.
- Diluir el anticuerpo primario en 500 ml de diluyente normal de anticuerpos (Tablade materiales). Comience con una concentración de 1:50-1:100. Mezcle suavemente la rodaja renal en anticuerpoprimario diluido durante 4 d a 37 oC.
NOTA: Dado que cada anticuerpo tiene propiedades únicas, la temperatura durante la incubación de anticuerpos y las diluciones de anticuerpos deben optimizarse para sondas individuales. Para controles secundarios solo de anticuerpos, incubar tejido renal en diluyente sin anticuerpo primario. En lugar de diluyente de anticuerpos comerciales, se puede utilizar 1 pbS con 0,1% de tritón X-100 y 0,01% de azida sódica. - Lave la rodaja renal en 10 ml de tampón de lavado 1x durante la noche en RT con un cambio de tampón de lavado después de 8 h.
- Diluir los anticuerpos secundarios (p. ej., 1:100 para anticuerpos secundarios conjugados por Alexa Fluor) en 500 l de diluyente de anticuerpos normal. Incubar las rodajas renales en anticuerpos secundarios diluidos durante 4 días a 37 oC. A partir de este paso, proteja las rodajas renales de la luz.
- Lave las rodajas renales en 10 ml de tampón de lavado 1x durante la noche en RT con un cambio de tampón de lavado después de 8 h.
3. Limpieza de tejidos
- Transfiera la rebanada renal a 5 ml de etanol de alto grado 100% (Tablade Materiales)durante 2 h a RT con balanceo suave (con un cambio a etanol fresco después de 1 h). Este paso es para la deshidratación de los tejidos.
NOTA: Se requiere etanol de alto grado para lograr una alta translucidez tisular en el siguiente paso. El metanol o el tetrahidrofurano son reactivos alternativos de deshidratación con alto potencial de deslipidación. - Sumerja la rodaja renal en 2 ml de ECi (Tablade Materiales)con un suave balanceo a RT (con un cambio a ECi fresco después de 2 h) durante la noche.
NOTA: El punto de congelación/fusión de ECi es de 6-8 oC. Por lo tanto, no guarde las muestras en la nevera. Llevar a cabo la inmersión en una campana de humo adecuadamente ventilada y evitar el contacto directo con la ropa y la piel (ECi es un compuesto no tóxico aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos, pero tiene un fuerte olor). Utilice tubos eppendorf regulares o recipientes de vidrio (sin recipientes de poliestireno). - La translucidez tisular se puede lograr después de la inmersión en ECi y cuando las rodajas renales están listas para la toma de imágenes.
4. ConfocalImaging y análisis de imágenes
NOTA: Para la toma de imágenes, se pueden utilizar otras técnicas de microscopía siempre que la solución de coincidencia de índice de refracción sea compatible con la lente objetivo. Este protocolo utiliza un microscopio confocal invertido.
- Añadir 600-1,000 l de ECi en el plato inferior de vidrio (Tablade materiales).
NOTA: Evitar el uso de platos regulares de cultivo celular, porque ECi es un disolvente orgánico que disolverá los platos de plástico. Del mismo modo, ECi podría atacar piezas de plástico / anillos de aislamiento en lentes objetivas. Consulte los informes adecuados para obtener una visión general de las placas de imagen compatibles30 y las cámaras impresas 3D hechas a sí mismas28. - Transfiera la rebanada renal translúcida al plato. Coloque un cubreobjetos redondo en la rodaja renal para aplicar una ligera presión sobre el fondo de cristal. Selle el plato con película de parafina (Tablade Materiales)para evitar fugas de ECi.
NOTA: Los órganos enteros o varias rebanadas de tejido de milímetro pueden requerir un borde (cemento dental o elastómero de silicona; ver Tabla de Materiales)alrededor del tejido para hacer una piscina ECi para la muestra. - Coloque el plato en la plataforma de imágenes del microscopio.
- Tome varias pilas z y realice costuras. Comience con un tamaño de paso z de 5 m.
NOTA: Considere la posibilidad de utilizar objetivos de larga distancia de trabajo (>5 mm) y alta apertura numérica (>0.9) para la toma de imágenes de rebanadas u órganos de tejido muy gruesos. Después de la toma de imágenes, transfiera el tejido de nuevo al etanol y guárdelo en tampón de lavado o PBS con 0.02% de azida sódica. - Analice la imagen utilizando renderizado 3D con software (Tablade materiales).
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Representative Results
Los riñones son órganos complejos compuestos por 43 tipos de células diferentes31. La mayoría de estas células forman grandes estructuras multicelulares como glomérulos y túbulos, y su función depende en gran medida de las interacciones entre sí. Las técnicas histológicas 2D clásicas capturan parcialmente estas grandes estructuras y pueden pasar por alto los cambios focales dentro de las estructuras intactas31. Por lo tanto, el análisis 3D utilizando técnicas de limpieza óptica ayuda a entender cómo funcionan en la salud y la enfermedad.
La mayoría de las técnicas de limpieza óptica basadas en disolventes apagarán al menos parcialmente la señal de proteína del reportero fluorescente endógeno. El enfriamiento de Parvalbumin con etiqueta YFP se observó tras la deshidratación y la limpieza óptica con ECi (Figura 1). Sin embargo, otras proteínas fluorescentes fuertes pueden resistir el enfriamiento de la señal, y el ajuste del pH a niveles básicos (pH 8-11) puede estabilizar las proteínas fluorescentes endógenas14,20,28,30. Además, se deben considerar métodos acuosos si se desea la conservación de las emisiones de proteínas fluorescentes. En este informe actual, se demuestra que este protocolo de compensación basado en disolventes es compatible con el etiquetado de anticuerpos; aunque, sigue siendo difícil lograr inmunoetiquetado profundo del tejido, especialmente en un órgano denso rico en células como el riñón.
Luego se realizó una perfusión aórtica abdominal retrógrada de los riñones para eliminar las células sanguíneas y abrir los túbulos (Figura2A,B). Este enfoque disminuye la autofluorescencia y mejora la difusión de anticuerpos. La concentración de anticuerpos depende del tamaño del tejido y de la abundancia del antígeno. Por lo tanto, la señal superficial puede estar relacionada con una penetración deficiente de anticuerpos o una cantidad insuficiente de anticuerpos (Figura3A,B, véase también Película 1). Para muestras grandes o marcadores extremadamente abundantes, pueden ser necesarias concentraciones más altas de anticuerpos y reposición de anticuerpos después de 1-2 días. Si el antígeno de interés se expresa en la vasculatura renal, se debe considerar la administración intravascular del anticuerpo (Figura3C). Sin embargo, los anticuerpos dirigidos a proteínas en la membrana apical de las células epiteliales del túbulo no cruzan la barrera de filtración glomerular debido al tamaño molecular, causando así señales inespecíficas en los vasos sanguíneos y glomérulos (Figura 3D).
Este protocolo se puede aplicar a las rodajas renales o riñones enteros (Figura4A,B). Para probar la especificidad de los anticuerpos, sólo los controles fueron sometidos a anticuerpos secundarios (Figura4C). El tejido se puede etiquetar con anticuerpos para detectar una población celular específica (por ejemplo, células que proliferan, Figura 4D)o para visualizar segmentos de túbulos enteros utilizando anticuerpos específicos del segmento (Figura4E). Además, la combinación de múltiples anticuerpos ofrece la oportunidad de colocalizar diferentes proteínas en 3-D (por ejemplo, para detectar hiperplasia de túbulos específica del segmento, ya que ocurre en la remodelación de túbulos en diferentes estímulos) (Figura4F,G; véase también la película 2).
Figura 1: Enfriamiento de la señal de proteína del reportero fluorescente endógeno. (A) La proteína de reportero fluorescente endógena derivada del ratón transgénico ParvalbuminYFP+es detectable en secciones renales congeladas fijas en PFA de 5 m de delgado. Las flechas marcan algunas células de parvalbumina+ etiqueta fluorescente ubicadas en la primera parte del túbulo enrevesado distal. (B) No se observa ninguna señal fluorescente evidente después de la limpieza óptica del tejido renal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la calidad de la perfusión renal. (A) El tejido incrustado de parafina manchada de schiff ácido periódico (PAS) (secciones delgadas de 5 m) muestra pocos túbulos con un lumen ligeramente abierto (típicamente túbulos proximales que poseen borde de pincel; ver flechas). (B) Todos los túbulos se abren después de una buena perfusión renal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Solución de problemas de inmunoetiquetado de montaje completo. (A,B) Una rebanada renal gruesa se tiñó con un anticuerpo contra el cotransportador de cloruro sódico-2 (NKCC2), que se expresa en la extremidad ascendente gruesa del bucle de Henle. La señal es detectable en la superficie del tejido (flechas en (B)). Sin embargo, el anticuerpo no penetró en el tejido [ver punta de flecha en (B)]. (C) La inyección intravascular de anticuerpos dirigida a proteínas expresadas en los vasos (por ejemplo, CD31) permite la tinción rápida y homogénea de los vasos sanguíneos. Las estructuras redondas con una señal fuerte son glomérulos. (D) Sin embargo, los anticuerpos dirigidos a proteínas expresadas en la membrana apical de la epicitela de túbulos (por ejemplo, cotransportador de cloruro sódico fosforilado (fosfo-NCC) que se expresa en el túbulo distal enrevesado) no cruzarán el barrera de filtración, causando así señales inespecíficas en la vasculatura (ver punta de flecha apuntando a arteriolas aferentes y otros vasos) y glomérulos (ver flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos del tejido renal inmunoetiquetado con eliminación óptica. (A,B) Este protocolo permite la limpieza óptica de todo el riñón. (C) Una pila z representativa para mostrar la ausencia de unión no específica de anticuerpos secundarios como control sin incubación previa. (D) La visualización 3D de una pila z representativa muestra la proliferación de la bromodeoxiuridina (BrdU)+ células en la médula renal. (E) Los conductos de recolección medular se visualizan utilizando un anticuerpo contra la aquaporina-2 (AQP2). (F,G) Análisis y cuantificación de BrdU+ células dentro de AQP2+ conductos colectores medulares. Para (F,G), véase también Película 2. Esta cifra ha sido modificada de Saritas et al.29. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1 (relacionada con la figura 3): visualización 3D de NKCC2+extremidad ascendente gruesa del buclede Henle. La película demuestra una pobre penetración de anticuerpos en una rebanada renal limpiada ópticamente. Haga clic aquí para descargar el vídeo.
Película 2 (relacionada con la Figura4): visualización 3D de BrdU+células y AQP2+conductos derecolección medular en una rebanada renal limpiada ópticamente. Se muestran BrdU+ células (en rojo) y AQP2+ conductos de recolección medular (en verde). Se utilizaron algoritmos de punto y superficie de Imaris para determinar BrdU+ células fuera (manchas turquesas) o interiores (manchas rosas) AQP2+túbulos (superficies verdes). Esta película apareció originalmente en Saritas et al. 29. Haga clic aquí para descargar el vídeo.
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Discussion
Las técnicas de limpieza óptica han recibido una amplia atención para la visualización tridimensional y la cuantificación de la microanatomía en diversos órganos. Aquí, el método de limpieza a base de disolventes (ECi) se combinó con el inmunoetiquetado para imágenes tridimensionales de túbulos enteros en rodajas renales. Este método es simple, barato y rápido. Sin embargo, otras preguntas de investigación pueden ser mejor respondidas con otros protocolos de compensación5. También es importante tener en cuenta que los métodos basados en disolventes causan la contracción del tejido a grados variables, principalmente debido a la etapa de deshidratación14,18. La mayoría de los métodos basados en disolventes (porejemplo, ECi14) también aquen al menos parcialmente la fluorescencia endógena de reporteros como GFP o tdTomato; por lo tanto, FDISCO32, CLARITY12o CUBIC11 pueden servir como protocolos alternativos. Sin embargo, el efecto de enfriamiento de ECi es variable y depende de las construcciones individuales de cada ratón reportero28. Además, el uso de 1) un anticuerpo fluorescente contra GFP y otros reporteros o 2) protocolos modificados basados en disolventes que preservan las señales de fluorescencia endógena30,32 también puede ser un enfoque alternativo en este contexto. Vale la pena mencionar que varios grupos han probado la compatibilidad de los protocolos acuosos24,33,34 para visualizar el ARN en 3-D, mientras que los métodos de limpieza basados en disolventes aún no han sido probados. Por lo tanto, se deben preferir métodos de compensación acuosos como la versión modificada de CLARITY33 cuando se considere el análisis de ARN.
Las células o productos genéticos de interés se pueden visualizar utilizando ratones transgénicos con expresión de proteína fluorescente endógena, pero la generación de líneas de ratón genéticamente diseñadas es lenta y costosa. Por lo tanto, el etiquetado de anticuerpos es más práctico y proporciona más flexibilidad, aunque el inmunoetiquetado de tejido grande es un desafío. A diferencia del protocolo ECi14original, nuestro enfoque combina un método de compensación óptica ECi modificado y el inmunoetiquetado, que utiliza un paso de recuperación de antígenos. La recuperación de antígenos inducida por calor desnaturalizará las proteínas, pero ayuda a recuperar la pérdida de antigenicidad durante la fijación de PFA35 y mejora la unión a los anticuerpos.
Hay algunos pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, es importante realizar una buena perfusión del riñón. La hemoglobina que contiene glóbulos rojos limita la profundidad de imagen7 y los túbulos expandidos con lumen abierto mejoran la penetración de anticuerpos. La apertura de los túbulos también permite distinguir mejor las proteínas expresadas en la membrana apical epitelial de otras proteínas expresadas apiáticamente en el lado contralateral. Sin embargo, los túbulos expandidos artificialmente pueden influir negativamente en la estructura del túbulo y enmascarar la respuesta fisiopatológica específica del riñón (por ejemplo, dilatación de los túbulos proximales lesionados), pero no de los túbulos sanos36. En segundo lugar, la incubación de anticuerpos a 37 oC en lugar de 4 oC o RT mejora la penetración de anticuerpos27. Sin embargo, cada anticuerpo tiene propiedades únicas; por lo tanto, la temperatura durante la incubación de anticuerpos debe optimizarse para sondas individuales. En tercer lugar, el uso de anticuerpos secundarios Alexa Fluor-647 (espectro rojo lejano) ayuda a aumentar la relación señal-ruido, especialmente porque los riñones emiten una gran cantidad de autofluorescencia en el espectro azul-verde37.
La inyección retro-orbital14 o la perfusión de riñón38 con anticuerpos conjugados con fluoróforos contra proteínas expresadas en los vasos sanguíneos es una forma elegante y rápida de etiquetar la vasculatura renal. Sin embargo, las proteínas de la membrana apical de los túbulos siguen siendo inaccesibles mediante inyección intravascular, ya que los anticuerpos no pueden cruzar la barrera de filtración glomerular con su peso molecular de corte para la filtración de proteínas en el rango de 60-65 kDa. Por lo tanto, el uso de pequeños fragmentos de anticuerpos y variantes de ingeniería tales como fragmentos Fab (55 kDa), diacuerpos (50 kDa), scFv en tándem (28 kDa) o aptámeros de ácido nucleico (6-30 kDa) con propiedades de reconocimiento molecular preservadas de anticuerpos pueden proporcionar un aptámeros de ácido nucleico (6-30 kDa) con propiedades de reconocimiento molecular preservadas de anticuerpos puede proporcionar un oportunidad de acceder a la membrana apical de los túbulos38,39. Además, la combinación de pequeños fragmentos de anticuerpos con campos eléctricos40 o presión13 o el uso de protocolos de limpieza basados en dodecilo sódico (SDS) para eliminar los lípidos24,41,42 puede permitir una penetración rápida y eficiente de anticuerpos en el tejido.
Varios grupos demostraron que la perfusión con reactivo de limpieza no sólo reduce el tiempo del protocolo, sino que también aumenta la transparencia tisular19,24,43,44. Por lo tanto, se debe considerar la cannulación de la aorta abdominal o la arteria renal con posterior perfusión del riñón con soluciones de eliminación e intercambio de índices de refracción para lograr un mejor y más rápido aclaramiento del tejido. Sin embargo, no perfundimos todo el riñón con reactivos de limpieza y usamos riñones en rodajas por varias razones. En primer lugar, se pueden visualizar diferentes antígenos mediante el etiquetado de anticuerpos de múltiples rodajas renales de un riñón. En segundo lugar, se necesita menos tiempo y anticuerpos para realizar la inmunoetiquetado de una rebanada renal en comparación con un riñón entero. En tercer lugar, las imágenes en 3D de muestras grandes generan conjuntos de datos de hasta varios terabytes, lo que puede ser difícil de administrar para la mayoría de las estaciones de trabajo. Por lo tanto, los datos de sectores de tejido o subconjuntos de archivos más grandes son más convenientes para realizar operaciones complejas, como el recuento automatizado o las mediciones de distancia.
En este protocolo, la microscopía confocal se utiliza para realizar imágenes con resolución de una sola célula, que es particularmente relevante en los estudios de colocalización. Sin embargo, la imagen confocal requiere escaneo láser, ya que su velocidad de imagen sólo es práctica para pequeños trozos de tejido despejado. Para realizar análisis morfométricos tridimensionales de estructuras multicelulares como segmentos de túbulos largos o incluso órganos enteros, son necesarias técnicas de microscopio más rápidas como microscopios fluorescentes de láminas de luz (LSFM). LSFM permite imágenes rápidas cuando la resolución celular más alta no es esencial. Por ejemplo, las longitudes de los túbulos enrevesados distales se evaluaron recientemente combinando inmunoetiquetado de montaje completo, compensación óptica basada en CLARITY12y LSFM29. Desafortunadamente, lSFM comercial es caro y no siempre es compatible con protocolos de compensación basados en disolventes. De hecho, CLARITY fue elegido para este estudio, ya que nuestro LSFM particular con un objetivo personalizado para CLARITY no era compatible con ECi29. Sin embargo, Klingberg y otros demostraron que ECi es en principio compatible con LSFM14.
En conclusión, se demuestra un sencillo método de limpieza óptica basado en ECi, que se puede aplicar a cualquier proyecto de investigación utilizando rodajas de tejido fijo que van desde 100 á m a varios milímetros de espesor. También permite análisis factibles que anteriormente requerían esfuerzos casi exhaustivos para completar, y elimina los supuestos e inferencias requeridos asociados con el análisis bidimensional de morfología. La combinación de inmunoetiquetado de montaje completo, compensación óptica y microscopía de luz avanzada ayudará a avanzar en la comprensión de la función celular en la salud y la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
T. S. cuenta con el apoyo de subvenciones de la DFG German Research Foundation (332853055), Else Kr'ner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) y la Facultad de Medicina de la RWTH Aachen (Programa de Retorno RWTH). V. G. P. cuenta con el apoyo de becas de investigación de Deutsche Gesellschaft fur Nephrologie, la Fundación Alexander von Humboldt y el Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia. D. H. E es apoyado por la Fundación LeDucq. R. K. cuenta con el apoyo de subvenciones del DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), el Estado de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica de la Universidad RWTH Aachen (O3-11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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