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Medicine

इम्यूनोलेबल्ड किडनी ऊतक की ऑप्टिकल क्लियरिंग और इमेजिंग

Published: July 22, 2019 doi: 10.3791/60002
Automatic Translation
1, 1,2,3, 4, 4,5,6, 1,7
1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

Summary

एंटीबॉडी लेबलिंग, ऑप्टिकल समाशोधन, और उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संयोजन पूर्ण संरचनाओं या अंगों के तीन आयामी विश्लेषण की अनुमति देता है। यहाँ वर्णित मोटी गुर्दे स्लाइस के इम्यूनोलेबलिंग गठबंधन करने के लिए एक सरल तरीका है, एथिल cinnamate के साथ ऑप्टिकल समाशोधन, और confocal इमेजिंग कि दृश्य और तीन आयामी गुर्दे संरचनाओं के परिमाण सक्षम बनाता है.

Abstract

ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक बाद में तीन आयामी (3-डी) इमेजिंग के लिए एक नमूना भर में अपवर्तक सूचकांक को बराबर करके ऊतक पारदर्शी प्रदान करते हैं। वे सूक्ष्म multicellular संरचनाओं कि स्थूल दूरी पर विस्तार का विश्लेषण करने की क्षमता के लिए सभी अनुसंधान क्षेत्रों में महान ध्यान प्राप्त किया है. यह देखते हुए कि गुर्दे के ट्यूबल, vascuules, vascuuleture, नसों, और glomeruli कई दिशाओं में विस्तार, जो केवल आंशिक रूप से पारंपरिक दो आयामी तकनीकों द्वारा अब तक कब्जा कर लिया गया है, ऊतक समाशोधन भी गुर्दे अनुसंधान के कई नए क्षेत्रों को खोला. ऑप्टिकल समाशोधन तरीकों की सूची तेजी से बढ़ रहा है, लेकिन यह इस क्षेत्र में शुरुआती के लिए एक दिया अनुसंधान प्रश्न के लिए सबसे अच्छा तरीका चुनने के लिए मुश्किल रहता है. लेकिन यहाँ एक सरल तरीका है कि मोटी माउस गुर्दे स्लाइस के एंटीबॉडी लेबलिंग को जोड़ती है; सस्ते, गैर विषैले और तैयार करने के लिए उपयोग रासायनिक एथिल cinnamate के साथ ऑप्टिकल समाशोधन; और confocal इमेजिंग. इस प्रोटोकॉल गुर्दे perfuse और विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना एंटीबॉडी बाइंडिंग बढ़ाने के लिए एक प्रतिजन-पुनर्प्राप्ति कदम का उपयोग करने के लिए कैसे वर्णन करता है। इसके आवेदन गुर्दे के भीतर विभिन्न multicellular संरचनाओं इमेजिंग में प्रस्तुत किया है, और कैसे ऊतक में गरीब एंटीबॉडी प्रवेश समस्या निवारण को संबोधित किया है. हम भी इमेजिंग अंतर्जात fluorophores की संभावित कठिनाइयों पर चर्चा और बहुत बड़े नमूने प्राप्त करने और उन्हें कैसे दूर करने के लिए. यह सरल प्रोटोकॉल तीन आयामों में ऊतक का अध्ययन करने के लिए एक आसान करने के लिए सेटअप और व्यापक उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

पूरे अंगों या बड़े multicellular संरचनाओं के अध्ययन में बढ़ती रुचि ऑप्टिकल समाशोधन तरीकों है कि तीन आयामों में पारदर्शी ऊतक के इमेजिंग शामिल के विकास के लिए नेतृत्व किया है. हाल ही में जब तक, सेल संख्या, लंबाई, या पूरे संरचनाओं की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए सबसे अच्छा तरीके स्टीरियोलॉजी या संपूर्ण धारावाहिक अनुभागीकरण किया गया है, जो दो आयामों में बाद के विश्लेषण के लिए ऊतक के प्रणालीगत नमूने पर आधारित है1, २ , 3. हालांकि, इन तरीकों समय लेने वाली हैं और प्रशिक्षण और विशेषज्ञता4के एक उच्च स्तर की जरूरत है. ऑप्टिकल समाशोधन विधियों ने इन समस्याओं को एक नमूने में अपवर्तक सूचकांक को बराबर करके 3-डी इमेजिंग5,6,7के लिए ऊतक को पारदर्शी बनाने के लिए दूर किया .

विलायक आधारित और जलीय आधारित तरीकों: कई ऑप्टिकल समाशोधन तरीकों जो दो मुख्य श्रेणियों में गिर विकसित किया गया है। जलीय आधारित विधियों को सरल विसर्जन8,9,हाइपरहाइड्रेशन10,11और हाइड्रोजेल में विभाजित किया जा सकता है 12,13. विलायक आधारित तरीके ऊतक निर्जलित, लिपिड को हटाने और 1.55 के आसपास एक मूल्य के लिए अपवर्तक सूचकांक सामान्य। सबसे विलायक आधारित तरीकों की सीमाएं इस तरह के GFP, विलायक विषाक्तता, कुछ इमेजिंग कक्षों या उद्देश्य लेंस में इस्तेमाल गोंद भंग करने की क्षमता के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल किया रिपोर्टर प्रोटीन के अंतर्जात फ्लोरोसेंट की शमन कर रहे हैं, और के दौरान ऊतक के संकुचन निर्जलीकरण14,15,16,17,18,19,20,21. हालांकि, विलायक आधारित तरीके सरल, समय कुशल हैं, और विभिन्न ऊतक प्रकार के एक नंबर में काम कर सकते हैं।

जलीय-आधारित विधियाँ जलीय समाधानों में ऊतक के विसर्जन पर निर्भर करती हैं जिनमें 1.38-1.528,11,12,22,23,24 की श्रेणी में अपवर्तक सूचकांक होते हैं . इन तरीकों अंतर्जात फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन उत्सर्जन को बनाए रखने और निर्जलीकरण प्रेरित संकुचन को रोकने के लिए विकसित किए गए थे, लेकिन सबसे जलीय आधारित समाशोधन तरीकों की सीमाओं प्रोटोकॉल की एक लंबी अवधि शामिल, ऊतक विस्तार, और प्रोटीन संशोधन (अर्थात हाइपरहाइड्रेटिंग प्रोटोकॉल जैसे एससी ले ए 2)7,11,23,25में यूरिया द्वारा प्रोटीन का आंशिक विकृतीकरण . ScaleS संबोधित ऊतक विस्तार sorbitol के साथ यूरिया के संयोजन के द्वारा, जो यूरिया प्रेरित ऊतक विस्तार निर्जलीकरण द्वारा counterbalances, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी10द्वारा मूल्यांकन के रूप में ऊतक अल्ट्रास्ट्रक्चर संरक्षित. ऊतक संकुचन या विस्तार संरचनाओं के पूर्ण आकार, वस्तुओं के बीच की दूरी, या प्रति मात्रा सेल घनत्व को प्रभावित करता है; इस प्रकार ऊतक के समाशोधन में आकार परिवर्तन का मापन प्राप्त परिणामों की व्याख्या करने में मदद कर सकताहै 7,26.

सामान्य में, ऑप्टिकल समाशोधन के लिए एक प्रोटोकॉल pretreatment, permebilization, इम्यूनोलेबलिंग (यदि आवश्यक हो), अपवर्तक सूचकांक मिलान, और उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग सहित कई कदम होते हैं (जैसे, दो-फोटो, confocal, या प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी). अधिकांश समाशोधन दृष्टिकोण न्यूरोनल ऊतक की कल्पना करने के लिए विकसित किया गया है, और उभरते अध्ययन अन्य अंगों में उनके आवेदन को मान्य किया है5. इस व्यापक उपकरण पहले से गुर्दे की संरचनाओं के विश्वसनीय और कुशल विश्लेषण की अनुमति देने के लिए प्रदर्शन किया गया है, glomeruli27सहित ,28, प्रतिरक्षा घुसपैठ28, vasculature28, और ट्यूबल क्षेत्रों 29, और यह बेहतर glomerular समारोह और स्वास्थ्य और रोग में ट्यूबल remodeling की समझ के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण है.

यहाँ संक्षेप में एक विलायक आधारित विधि है कि गुर्दे नलिका के इम्यूनोस्टेनिंग को जोड़ती है; सस्ते, गैर विषैले, और तैयार करने के लिए उपयोग रासायनिक एथिल cinnamate (ECi) के साथ ऑप्टिकल समाशोधन; और confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग कि पूरा ट्यूब्यूल दृश्य और परिमाणीकरण की अनुमति देता है. इस विधि सरल है, वाणिज्यिक एंटीबॉडी के धुंधला के साथ गुर्दे स्लाइस के प्रतिजन-पुनर्प्राप्ति को जोड़ती है, और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, जो यह सबसे प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बनाता है.

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Protocol

नोट: सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियायहाँ वर्णित ओरेगन स्वास्थ्य और विज्ञान विश्वविद्यालय, पोर्टलैंड, ओरेगन, संयुक्त राज्य अमेरिका, और Aachen, जर्मनी में प्रासंगिक स्थानीय अधिकारियों के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACU) द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. रेट्रोग्रेड पेट महाधमनी भ्रम और माउस गुर्दे का निर्धारण

  1. समाधान उसी दिन या शाम से पहले तैयार करें और रात भर फ्रिज में रखें। उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान (आरटी) के लिए गर्म समाधान।
  2. 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में 3% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) का एक ताजा बैच बनाएं। प्रति माउस लगभग 50-100 एमएल पीएफए की आवश्यकता होती है।
    1. 3% पीएफए के 1 एल बनाने के लिए: 30 ग्राम पीएफए का वजन करें और धुएं के हुड में आसुत पानी के 800 एमएल जोड़ें। 50-60 डिग्री सेल्सियस के लिए हिलाओ और गर्मी। 70 डिग्री सेल्सियस से ऊपर गर्मी मत करो।
      चेतावनी: पीएफए विषाक्त है. धुँधले हुड में पीएफए तैयार करें।
    2. धीरे धीरे 2N NaOH के कई बूँदें जोड़ें. पीएफए समाधान में चला जाता है जब तक कुछ मिनट रुको या कुछ और बूँदें जोड़ें. कुछ छोटे टुकड़े भंग नहीं होगा.
    3. गर्मी से समाधान निकालें. 20x पीबीएस के 50 एमएल जोड़ें. आरटी के लिए बर्फ पर ठंडा.
    4. पीएच को 7-3-7.4 में एचसीएल के साथ समायोजित करें। 1 ल में आसुत जल जोड़ें।
    5. 0.22 डिग्री डिग्री फिल्टर के साथ 1x पीबीएस और 3% पीएफए को छानने के द्वारा किसी भी undissolved कणों निकालें।
  3. 1x पीबीएस के 1 एल करने के लिए Heparin की 1,000 इकाइयों जोड़ें. स्थानांतरण 1x पीबीएस अलग 50 एमएल प्लास्टिक सिरिंजों में 1x पीबीएस में heparin और 3% पीएफए युक्त।
    नोट: यदि उपलब्ध हो, दबाव नियंत्रित पंप 80-100 mmHg या hydrostatic दबाव पर सेट (ड्रिप विधि, भ्रम समाधान की ऊंचाई: 160-200 सेमी पशु के ऊपर) गुर्दे perfusion के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. एक तीन तरह stopcock करने के लिए पीबीएस, पीएफए और एक कुंद 21 जी तितली सुई कनेक्ट। सुनिश्चित करें कि पूरी प्रणाली में कोई हवा बुलबुले हैं।
  5. 15 एमएल शंकु नली को लेबल करें और उसमें 10 एमएल पीएफए वितरित करें।
  6. 120 मिलीग्राम/किलोग्राम बॉडीवेट केटामाइन और 16 मिलीग्राम/किग्रा बॉडीवेट जाइलेज़ीन का उपयोग करके एक पुरुष या मादा C57BL/6 माउस 12-24 सप्ताह की उम्र का गहराई से एनेस्थेट ीकरण करें। पशु सर्जरी के लिए आगे बढ़ने से पहले सजगता pinching द्वारा प्रतिक्रिया की पूरी अनुपस्थिति के लिए जाँच की जानी चाहिए (उदाहरण के लिए, टो चुटकी पलटा).
  7. एक बार जब जानवर संज्ञाहरण के एक शल्य विमान तक पहुँच गया है, यह विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे अपनी पीठ पर जगह है. सर्जिकल एक ऑपरेटिंग कैंची का उपयोग कर एक midline पेट चीरा के साथ पेट को खोलने और पेट के आरटा का पर्दाफाश.
  8. एक घुमावदार hemostat के साथ iliac धमनी के लिए शाखाओं के ठीक ऊपर पेट महाधमनी दबाना. फिर एक माइक्रो serrefine के साथ गुर्दे की धमनियों के ठीक नीचे पेट के आरटा दबाना. Vanass कैंची के साथ दो clamps के बीच पेट aorta पर एक छोटा सा चीरा (1 मिमी) बनाओ. धीरे धीरे चीरा में तितली सुई डालें और पेट के आरोटा खुला चीर करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  9. एक 5-0 रेशम सीवन के साथ सही गुर्दे धमनी लिगेट और अन्य विश्लेषण के लिए सही गुर्दे को हटा दें अगर केवल एक गुर्दा भ्रम और निर्धारण के लिए आवश्यक है।
  10. माइक्रो serrefine निकालें, vannas कैंची के साथ पोर्टल नस transect, और तुरंत heparin युक्त पीबीएस के 50 एमएल के साथ perfuse, तो स्विच और 3% पीएफए के 50 एमएल के साथ perfuse.
    नोट: पेट महारा के माध्यम से उच्च भ्रम दबाव ऊतक के माध्यम से बेहतर एंटीबॉडी प्रसार के लिए गुर्दे ट्यूबल खोलने के लिए आवश्यक है। दिल के माध्यम से भ्रम गुर्दे ट्यूब्यूल नहीं खोल सकते हैं।
  11. पर्पीड़ित गुर्दे को सावधानी से एकत्र करें और ऊतक को दंड देने या निचोड़ने से बचें।
  12. कैप्सूल निकालें और 1 मिमी मोटी कोरोनल स्लाइस में गुर्दे में कटौती. स्लाइस मोटाई मानकीकरण करने के लिए स्लाइसर मैट्रिक्स (सामग्री की तालिका)काउपयोग करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक vibratome का उपयोग करने पर विचार करें.
  13. गुर्दे के स्लाइस को 15 एमएल शंकु नली में तैयार पीएफए के साथ विसर्जित करें।
  14. पीएफए के 10 एमएल को दूसरे लेबल वाले 15 एमएल शंकु ट्यूब को वितरित करें। अगले माउस पर जाने से पहले तीन तरह से स्टॉपकॉक और तितली सुई को पीबीएस के साथ फ्लश करें।
  15. प्रकाश से सुरक्षित आरटी में रात भर के बाद तय करना।

2. ऊतक तैयारी और इम्यूनोस्टेनिंग

  1. निर्धारण के बाद, गुर्दे का टुकड़ा दो बार 1x धोने बफर (सामग्री की तालिका) के साथ एक क्षैतिज रॉकर पर 1 एच के लिए धो लें.
  2. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति निष्पादित करें. 500 एमएल बीकर में 1x एंटीजन अनमास्किंग घोल (सामग्रीका योग्य) के 300 एमएल को 92-98 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। कैसेट को 92-98 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए हिलाते हुए गर्म बफर के लिए पारगम्य embedding में टुकड़ा संलग्न करें। गर्मी से बीकर निकालें और इसे आरटी को ठंडा करने के लिए छोड़ दें।
    नोट: कुछ विक्रेताओं इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री आवेदन के लिए अपने एंटीबॉडी का परीक्षण और डेटा पत्रक में एक सुझाव प्रतिजन पुनर्प्राप्ति विधि शामिल होंगे. इसलिए, कुछ epitopes एक और अधिक बुनियादी बफर की आवश्यकता हो सकती है (उदा., पीएच 9).
  3. 0.1% Triton X-100 के साथ 1x धोने बफर के 10 एमएल में टुकड़ा स्थानांतरण और आर टी पर रात भर रॉक. अगले दिन 1 एच के लिए ताजा 1x धोने बफर के 10 एमएल के साथ स्लाइस 2x धो लो.
  4. सामान्य एंटीबॉडी के 500 डिग्री सेल्सियस में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें (सामग्री की तालिका)। 1:50-1:100 की एकाग्रता के साथ शुरू करते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घ के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी में गुर्दे का टुकड़ा धीरे रॉक।
    नोट: चूंकि प्रत्येक एंटीबॉडी अद्वितीय गुण है, एंटीबॉडी ऊष्मायन के दौरान तापमान और एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के लिए व्यक्तिगत जांच के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. माध्यमिक एंटीबॉडी केवल नियंत्रण के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना diluent में गुर्दे के ऊतकों को इनक्यूबेट करें। वाणिज्यिक एंटीबॉडी diluent के बजाय, 0.1% Triton एक्स-100 और 0.01% सोडियम azide के साथ 1x पीबीएस इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. 8 बजे के बाद धोने बफर के एक परिवर्तन के साथ आरटी पर रात भर 1x धोने बफर के 10 एमएल में गुर्दे का टुकड़ा धो लें।
  6. सामान्य एंटीबॉडी diluent के 500 डिग्री एल में माध्यमिक एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए, एलेक्सा फ्लोर-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए 1:100) को पतला करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए पतला माध्यमिक एंटीबॉडी में गुर्दे स्लाइस इनक्यूबेट। इस कदम से, प्रकाश से गुर्दे स्लाइस की रक्षा.
  7. 8 एच के बाद धोने बफर के एक परिवर्तन के साथ आरटी पर रात भर 1x धोने बफर के 10 एमएल में गुर्दे स्लाइस धो लें।

3. ऊतक समाशोधन

  1. उच्च ग्रेड 100% इथेनॉल के 5 एमएल के लिए गुर्दे का टुकड़ा स्थानांतरण (सामग्री की तालिका) कोमल कमाल के साथ आरटी में 2 एच के लिए (एक परिवर्तन के साथ ताजा इथेनॉल के लिए 1 ज के बाद). यह चरण ऊतक निर्जलीकरण के लिए है।
    नोट: उच्च ग्रेड इथेनॉल अगले चरण में एक उच्च ऊतक translucency प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। मेथेनोल या टेट्राहाइड्रोफ्यूरन उच्च delipidation क्षमता के साथ वैकल्पिक निर्जलीकरण अभिकर्मकों हैं।
  2. आरटी (2 ज के बाद ताजा ECi के लिए एक परिवर्तन के साथ) रात भर में कोमल रॉकिंग के साथ 2 एमएल ईसीआई (सामग्री कीतालिका) में गुर्दे का टुकड़ा विसर्जित कर दिया।
    नोट: ईसीआई का हिमांक 6-8 डिग्री सेल्सियस है। इसलिए, नमूने फ्रिज में संग्रहीत नहीं है। एक ठीक से हवादार धूआं हुड में विसर्जन आचरण और कपड़े और त्वचा के साथ सीधे संपर्क से बचने (ECi एक गैर विषैले खाद्य और औषधि प्रशासन को मंजूरी दे दी यौगिक है, लेकिन एक मजबूत गंध है). नियमित रूप से Eppendorf ट्यूबों या कांच के जहाजों (कोई polystyrene जहाजों) का प्रयोग करें.
  3. ऊतक translucency ECi विसर्जन के बाद प्राप्त किया जा सकता है और जब गुर्दे स्लाइस इमेजिंग के लिए तैयार हैं.

4. ConfocalImaging और छवि विश्लेषण

नोट: इमेजिंग के लिए, अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान उद्देश्य लेंस के साथ संगत होता है। इस प्रोटोकॉल एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है.

  1. कांच के नीचे डिश (सामग्री की तालिका) में ईसीआईके 600-1,000 एल जोड़ें।
    नोट: नियमित सेल संस्कृति व्यंजनों के उपयोग से बचें, क्योंकि ECi एक कार्बनिक विलायक है कि प्लास्टिक व्यंजन भंग होगा. इसी प्रकार, ईसीआई उद्देश्य लेंसों पर प्लास्टिक के भागों/इन्सुलेशन रिंगों पर हमला कर सकता है। संगत इमेजिंग व्यंजन30 और स्वयं बनाया 3 डी मुद्रित कक्षों28के अवलोकन के लिए उपयुक्त रिपोर्ट देखें.
  2. व्यंजन में पारदर्शी गुर्दे का टुकड़ा स्थानांतरण. कांच के नीचे की ओर हल्के दबाव को लागू करने के लिए गुर्दे के टुकड़े पर एक गोल कवरस्लिप रखें। ईसीआई के रिसाव से बचने के लिए पैराफिन फिल्म (सामग्री की तालिका) के साथ पकवान सील करें।
    नोट: पूरे अंगों या कई मिलीमीटर मोटी ऊतक स्लाइस एक सीमा की आवश्यकता हो सकती है (डेंटल सीमेंट या सिलिकॉन elastomer; सामग्री की तालिकादेखें) ऊतक के आसपास एक ECi-पूल बनाने के लिए नमूना के लिए.
  3. डिश को माइक्रोस्कोप इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर रखें।
  4. कई z-स्टैक ले लो और सिलाई प्रदर्शन करते हैं। 5 $m के एक z-चरण आकार के साथ प्रारंभ करें।
    नोट: लंबी दूरी का उपयोग करने पर विचार करें (gt; 5 मिमी) और उच्च संख्यात्मक एपर्चर (gt; 0.9) बहुत मोटी ऊतक स्लाइस या अंगों की इमेजिंग के लिए उद्देश्यों. इमेजिंग के बाद, ऊतक वापस इथेनॉल के लिए स्थानांतरण और धोने बफर या पीबीएस में 0.02% सोडियम azide के साथ की दुकान.
  5. सॉफ्टवेयर के साथ 3-डी प्रतिपादन का उपयोग कर छवि का विश्लेषण करें (सामग्रीकीतालिका)।

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Representative Results

गुर्दे जटिल अंग होते हैं जिनमें 43 विभिन्न कोशिका प्रकार31होते हैं . इन कोशिकाओं में से अधिकांश इस तरह के ग्लोमेरुली और ट्यूबल के रूप में बड़े multicellular संरचनाओं के रूप में, और उनके समारोह अत्यधिक एक दूसरे के साथ बातचीत पर निर्भर है. शास्त्रीय 2-डी हिस्टोलॉजिकल तकनीकें आंशिक रूप से इन बड़ी संरचनाओं पर कब्जा कर ली जाती हैं और अक्षुण्ण संरचनाओं31के भीतर फोकल परिवर्तन को याद कर सकती हैं। इस प्रकार, ऑप्टिकल समाशोधन तकनीकों का उपयोग कर3-डी विश्लेषण यह समझने में मदद करता है कि वे स्वास्थ्य और रोग में कैसे कार्य करते हैं।

अधिकांश विलायक आधारित ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक कम से कम आंशिक रूप से अंतर्जात फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन संकेत बुझाने होगा. वाईएफपी-टैग किए गए परवल्बुमिन का क्विंगएचन निर्जलीकरण और ऑप्टिकल समाशोधन पर ईसीआई (चित्र 1) के साथ मनाया गया । हालांकि, अन्य मजबूत फ्लोरोसेंट प्रोटीन संकेत शंका का विरोध कर सकते हैं, और बुनियादी स्तर के लिए पीएच के समायोजन (पीएच 8-11) अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्थिर कर सकते हैं14,20,28,30. इसके अलावा, यदि फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्सर्जन संरक्षण वांछित है, तो जलीय-आधारित तरीकों पर विचार किया जाना चाहिए। इस वर्तमान रिपोर्ट में, यह प्रदर्शित किया जाता है कि यह विलायक-आधारित समाशोधन प्रोटोकॉल एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ संगत है; हालांकि, यह ऊतक की गहरी इम्यूनोलेबलिंग को प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण रहता है, विशेष रूप से गुर्दे जैसे घने सेल समृद्ध अंग में।

इसके बाद रक्त कोशिकाओं को हटाने और ट्यूब्यूल खोलने के लिए गुर्दे के रेट्रोग्रेड उदर महाधमनी अपफ्यूजन का प्रदर्शन किया गया (चित्र 2ए, बी)। यह दृष्टिकोण ऑटोफ्लोरेन्सी कम हो जाता है और एंटीबॉडी विसरण में सुधार करता है। एंटीबॉडी एकाग्रता ऊतक के आकार और प्रतिजन की बहुतायत पर निर्भर करता है। अतः सतही संकेत या तो खराब एंटीबॉडी प्रवेश या एंटीबॉडी की अपर्याप्त मात्रा से संबंधित हो सकता है (चित्र 3ए,बी, मूवी 1देखें) भी । बड़े नमूनों या अत्यंत प्रचुर मात्रा में मार्करों के लिए, एंटीबॉडी की उच्च सांद्रता और 1-2 दिनों के बाद एंटीबॉडी की पुनःपूर्ति की आवश्यकता हो सकती है। यदि रुचि का प्रतिजन गुर्दे के वास्कुलेचर में व्यक्त किया जाता है तो एंटीबॉडी की अंत:संवहनी सुपुर्दगी पर विचार किया जाना चाहिए (चित्र 3 ब्) तथापि, नलिका उपकला कोशिकाओं की शीर्ष झिल्ली में प्रोटीन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी आण्विक आकार के कारण ग्लोमेरूलर निस्पंदन अवरोध को पार नहीं करते हैं, जिससे रक्त वाहिकाओं और ग्लोमेरुली (चित्र3डी)में विशिष्ट संकेत होते हैं।

इस प्रोटोकॉल गुर्दे स्लाइस या पूरे गुर्दे के लिए लागू किया जा सकता है (चित्र 4ए, बी) . एंटीबॉडी-विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, केवल नियंत्रण माध्यमिक एंटीबॉडी के अधीन थे (चित्र 4C)। ऊतक एक विशिष्ट कोशिका जनसंख्या का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जा सकता है (उदा., कोशिकाओं को बढ़ावा देने, चित्र 4D) या खंड-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पूरे ट्यूबल खंडों कल्पना करने के लिए (चित्र 4E)। इसके अलावा, कई एंटीबॉडी का संयोजन 3-डी में विभिन्न प्रोटीनों को सह-स्थानीयबनाने का अवसर प्रदान करता है (उदाहरण के लिए, खंड-विशिष्ट ट्यूब्यूल हाइपरप्लासिया का पता लगाने के लिए क्योंकि यह विभिन्न उत्तेजनाओं पर ट्यूब्यूल रीमॉडेलिंग में होता है) (चित्र 4एफ, जी; भी देखें मूवी 2).

Figure 1
चित्रा 1: अंतर्जात फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन संकेत की कतार. (ए) परवेल्बुमिनवाईएफपी+ट्रांसजेनिक माउस से व्युत्पन्न अंतर्जात फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन 5 डिग्री मीटर पतली पीएफए-फिक्स्ड जमे हुए गुर्दे वर्गों में पता लगाने योग्य है। तीर कुछ फ्लोरोसेंट लेबल parvalbumin+ कोशिकाओं distal जटिल ट्यूब्यूल के प्रारंभिक भाग में स्थित निशान. (बी) गुर्दे के ऊतकों के ऑप्टिकल समाशोधन के बाद कोई स्पष्ट फ्लोरोसेंट संकेत नहीं देखा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: गुर्दे perfusion गुणवत्ता का मूल्यांकन. (ए) आवधिक एसिड Schiff (PAS) --सना हुआ पैराफिन एम्बेडेड ऊतक (5 डिग्री मीटर पतली वर्गों) एक थोड़ा खोला लुमेन के साथ कुछ tubules से पता चलता है (आमतौर पर निकट आसन्न tubules जो ब्रश सीमा के अधिकारी; तीर देखें). (ख) सभी नलिकाएं अच्छी गुर्दे की परान के बाद खोली जाती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पूरे-माउंट इम्यूनोलेबलिंग का निवारण। (ए,बी) एक मोटी गुर्दे का टुकड़ा सोडियम-क्लोराइड कोट्राट्रांसपोर्टर-2 (NKCC2) के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ दागा गया था, जो हेनले के पाश के मोटे आरोही अंग में व्यक्त किया जाता है। संकेत ऊतक की सतह पर पता लगाने योग्य है (में तीर (बी).। हालांकि, एंटीबॉडी ऊतक में प्रवेश नहीं किया [में arrowhead देखें (बी)]. (ग) वाहिकाओं में व्यक्त प्रोटीनको लक्षित करने वाला इंट्रावास्कुलर एंटीबॉडी इंजेक्शन (उदा., CD31) तेज और समरूप रक्त वाहिका के दाग की अनुमति देता है। एक मजबूत संकेत के साथ गोल संरचनाओं glomeruli हैं. (घ) तथापि, नलिका एपिथेलिया (उदा., फॉस्फोरिलेट सोडियम-क्लोराइड कोट्रानेस्टर (फॉस्फो-एनसीसी) जो दूरस्थ संवलित नलिका में व्यक्त किया जाता है) की शीर्ष झिल्ली में व्यक्त किए गए प्रोटीनों को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी ग्लोमेरूलर को पार नहीं करेंगे निस्पंदन बाधा, इस प्रकार vascualture में विशिष्ट संकेतों के कारण (एरोहेड afferent arterioles और अन्य जहाजों की ओर इशारा करते हुए देखें) और glomeruli (तीर देखें). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: इम्यूनोलेबल के प्रतिनिधि परिणाम ऑप्टिकली मंजूरी दे दी गुर्दे के ऊतकों. (ए,बी) इस प्रोटोकॉल पूरे गुर्दे के ऑप्टिकल समाशोधन की अनुमति देता है. (ग) पूर्व ऊष्मायन के बिना नियंत्रण के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी की गैर-विशिष्ट बाइंडिंग की अनुपस्थिति दिखाने के लिए एक प्रतिनिधि z-स्टैक. (घ) एक प्रतिनिधि z-स्टैक के 3-डी दृश्य से पता चलता है कि ब्रोमोडॉक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू)+ गुर्दे के मेडुला में कोशिकाओं का प्रसार होता है। (ई) मेड्यूलरी संग्रह नलिकाओं को एक्वापोरिन-2 (AQP2) के विरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग करके देखा जाता है। (एफ,जी) विश्लेषण और BRDUके परिमाणीकरण + AQP2 के भीतर कोशिकाओं+ मज्जा इकट्ठा नलिकाओं. के लिए (F,G), भी मूवी 2देखें | यह आंकड़ा सरिता एट अल29से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मूवी 1 (चित्र 3 सेसंबंधित ) : एनकेसीसी2 के 3-डी दृश्य+हेनले के लूप के मोटे आरोही अंग। फिल्म एक ऑप्टिकली मंजूरी दे दी गुर्दे का टुकड़ा में गरीब एंटीबॉडी प्रवेश को दर्शाता है. वीडियो डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मूवी 2 (चित्र ाााः ााााःााा्)ः ब्रदु+कोशिकाओं तथा एकाप२़ंुषंएकत्र वयं कणक षड्वर्गय षड्वर्गतम् । BrdU+ कोशिकाओं (लाल रंग में) और AQP2+ मज्जा संग्रह नलिकाओं (हरे रंग में) दिखाए जाते हैं. Imaris स्थान और सतह एल्गोरिदम BrdU+ कोशिकाओं के बाहर (turcoise स्पॉट) या अंदर (गुलाबी धब्बे) AQP2+ट्यूब्यूल (हरी सतहों) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. यह फिल्म मूल रूप से सरिता एट अल में दिखाई दी. 29वीडियो डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक 3-डी दृश्य और विभिन्न अंगों में microanatomy के परिमाणीकरण के लिए व्यापक ध्यान प्राप्त किया है. यहाँ, विलायक आधारित समाशोधन विधि (ECi) गुर्दे स्लाइस में पूरे ट्यूबल के 3-डी इमेजिंग के लिए इम्यूनोलेबलिंग के साथ संयुक्त किया गया था। इस विधि सरल है, सस्ती, और जल्दी. हालांकि, अन्य अनुसंधान सवालों का सबसे अच्छा अन्य समाशोधन प्रोटोकॉल5के साथ जवाब दिया जा सकता है। यह भी ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि विलायक आधारित विधियों चर डिग्री पर ऊतक-संकुचन का कारण बनता है, मुख्य रूप से निर्जलीकरण चरण14,18के कारण. अधिकांश विलायक आधारित तरीके (जैसे., ECi14) भी कम से कम आंशिक रूप से इस तरह के GFP या tdTomato के रूप में पत्रकारों के अंतर्जात फ्लोरोसेंट बुझाने; इस प्रकार, FDISCO32, स्पष्टता12, या CUBIC11 वैकल्पिक प्रोटोकॉल के रूप में सेवा कर सकते हैं. तथापि, ECi के शमन प्रभाव चर है और प्रत्येक रिपोर्टर माउस28के व्यक्तिगत constructs पर निर्भर करता है. इसके अलावा, का उपयोग 1) GFP और अन्य पत्रकारों या 2) संशोधित विलायक आधारित प्रोटोकॉल है कि अंतर्जात फ्लोरोसेंट संकेतों की रक्षा के खिलाफ एक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी30,32 भी इस संदर्भ में एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हो सकता है. यह उल्लेखनीय है कि कई समूहों ने 3-डी में आरएनए की कल्पना करने के लिए जलीय-आधारित प्रोटोकॉल24,33,34 की संगतता का परीक्षण किया है, जबकि विलायक-आधारित समाशोधन विधियों का अभी तक परीक्षण नहीं किया गया है। इस प्रकार, आरएनए विश्लेषण पर विचार किया जाता है जब स्पष्टता33 के संशोधित संस्करण के रूप में जलीय आधारित समाशोधन विधियों पसंद किया जाना चाहिए।

कोशिकाओं या ब्याज के जीन उत्पादों अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर visualized किया जा सकता है, लेकिन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस लाइनों की पीढ़ी समय लेने वाली और महंगी है. इसलिए, एंटीबॉडी लेबलिंग अधिक व्यावहारिक है और अधिक लचीलापन प्रदान करता है, हालांकि बड़े ऊतक की इम्यूनोलेबलिंग चुनौतीपूर्ण है। मूल ECi प्रोटोकॉल14के विपरीत, हमारे दृष्टिकोण एक संशोधित ECi ऑप्टिकल समाशोधन विधि और इम्यूनोलेबलिंग, जो एक प्रतिजन पुन: प्राप्ति कदम का उपयोग करता है को जोड़ती है. गर्मी प्रेरित प्रतिजन-पुनर्प्राप्ति प्रोटीन विकृत हो जाएगा, लेकिन पीएफए फिक्सिंग के दौरान एंटीजेनिकिटी की हानि को ठीक करने में मदद करता है35 और एंटीबॉडी बाध्यकारी में सुधार.

इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, यह गुर्दे का अच्छा भ्रम प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है। लाल रक्त कोशिकाओं वाले हीमोग्लोबिन इमेजिंग गहराई7 और खुले लुमेन के साथ विस्तारित ट्यूब्यूल को सीमित करता है जो एंटीबॉडी प्रवेश को बढ़ाता है। नलिकाओं के खुलने से विपरीत पक्ष पर अन्य एपिकली व्यक्त प्रोटीन से उपकला शीर्ष झिल्ली में व्यक्त प्रोटीन के बेहतर भेद की अनुमति देता है। हालांकि, कृत्रिम रूप से विस्तारित ट्यूबल ट्यूबल संरचना को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं और गुर्दे की विशिष्ट पैथोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रिया को मुखौटा कर सकते हैं (उदाहरण के लिए घायल समीपस्थ नलिकाओं का फैलाव,) लेकिन स्वस्थनलिका36की नहीं। दूसरा, 4 डिग्री सेल्सियस या आरटी के बजाय 37 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबॉडी ऊष्मायन एंटीबॉडी प्रवेश27में सुधार करता है। हालांकि, प्रत्येक एंटीबॉडी अद्वितीय गुण है; इस प्रकार, एंटीबॉडी ऊष्मायन के दौरान तापमान को व्यक्तिगत जांच के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है। तीसरा, एलेक्सा फ्लुओर-647 (दूर-लाल स्पेक्ट्रम) माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने में मदद करता है, विशेष रूप से गुर्दे नीले-हरे स्पेक्ट्रम37में ऑटोफ्लोरोसेंट की एक बड़ी मात्रा का उत्सर्जन करते हैं।

रक्त वाहिकाओं में व्यक्त प्रोटीन के खिलाफ फ्लोरोफोर-कंजुटेड एंटीबॉडी के साथ गुर्देके 14 या अपफ्यूजन38 रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन गुर्दे के वास्कुलेचर को लेबल करने के लिए एक सुंदर और तेज़ तरीका है। हालांकि, ट्यूबल की शीर्ष झिल्ली में प्रोटीन इंट्रावास्कुलर इंजेक्शन द्वारा दुर्गम रहते हैं क्योंकि एंटीबॉडी 60-65 केडीए की रेंज में प्रोटीन के निस्पंदन के लिए अपने कट-ऑफ आणविक वजन के साथ ग्लोमेरूलर निस्पंदन बाधा को पार नहीं कर सकते हैं। इसलिए, छोटे एंटीबॉडी टुकड़े और इंजीनियर वेरिएंट जैसे फैब टुकड़े ($55 kDa), डायबॉडी ($50 kDa), अग्रानुक्रम scFv ($28 kDa) या न्यूक्लिक-एसिड aptamers ($6-30 केडीए) एंटीबॉडी के संरक्षित आणविक मान्यता गुणों के साथ एक प्रदान कर सकते हैं के रूप में इंजीनियर वेरिएंट का उपयोग एक प्रदान कर सकते हैं ट्यूबल की शीर्ष झिल्ली का उपयोग करने का अवसर38,39. इसके अलावा, बिजली के क्षेत्रों के साथ छोटे एंटीबॉडी टुकड़े का संयोजन40 या दबाव13 या सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के उपयोग के आधार पर समाशोधन प्रोटोकॉल लिपिड को दूर करने के लिए24,41,42 ऊतक के तेजी से और कुशल एंटीबॉडी प्रवेश सक्षम हो सकता है.

कई समूहों ने दिखा दिया कि समाशोधन अभिकर्मक के साथ भ्रम न केवल प्रोटोकॉल समय को कम करता है , बल्कि ऊतक पारदर्शिता को भी बढ़ाताहै 19,24,43,44. इसलिए, पेट महाधमनी या गुर्दे की धमनी के साथ निर्जलीकरण और अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान के साथ गुर्दे के भ्रम के साथ कैनुलेशन बेहतर और तेजी से ऊतक समाशोधन प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। हालांकि, हम समाशोधन अभिकर्मकों के साथ पूरे गुर्दे perfuse नहीं किया और कई कारणों के लिए कटा हुआ गुर्दे का इस्तेमाल किया. सबसे पहले, विभिन्न एंटीजन एक गुर्दे से कई गुर्दे स्लाइस के एंटीबॉडी लेबलिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है। दूसरा, कम समय और एंटीबॉडी एक पूरी गुर्दे की तुलना में एक गुर्दे का टुकड़ा के इम्यूनोलेबलिंग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं। तीसरा, बड़े नमूनों की 3-डी इमेजिंग डेटा को कई टेराबाइट्स तक सेट करती है, जो अधिकांश कार्यस्थानों के लिए प्रबंधित करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसलिए, ऊतक स्लाइस या बड़ी फ़ाइलों के सबसेट से डेटा स्वचालित गिनती या दूरी माप जैसे जटिल संचालन करने के लिए अधिक सुविधाजनक हैं।

इस प्रोटोकॉल में, confocal माइक्रोस्कोपी एकल सेल संकल्प है, जो colocalization अध्ययन में विशेष रूप से प्रासंगिक है के साथ इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, confocal इमेजिंग लेजर स्कैनिंग की आवश्यकता है, क्योंकि इसकी इमेजिंग गति मंजूरी दे दी ऊतक के छोटे टुकड़े के लिए ही व्यावहारिक है. इस तरह के लंबे ट्यूबल क्षेत्रों या यहां तक कि पूरे अंगों के रूप में multicellular संरचनाओं के 3-डी morphometric विश्लेषण करने के लिए, प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (LSFM) के रूप में तेजी से माइक्रोस्कोप तकनीक आवश्यक हैं। LSFM तेजी से इमेजिंग की अनुमति है जब उच्चतम सेलुलर संकल्प आवश्यक नहीं है. उदाहरण के लिए, दूरस्थ जटिल नलिकाओं की लंबाई का मूल्यांकन हाल ही में स्पष्टता12और एलएसएफएम29के आधार पर पूरे-माउंट इम्यूनोलेबलिंग, ऑप्टिकल समाशोधन के संयोजन से किया गया था। दुर्भाग्य से, वाणिज्यिक LSFM महंगा है और विलायक आधारित समाशोधन प्रोटोकॉल के साथ हमेशा संगत नहीं है. वास्तव में, स्पष्टता इस अध्ययन के लिए चुना गया था, क्योंकि स्पष्टता के लिए अनुकूलित एक उद्देश्य के साथ हमारे विशेष LSFM ECi29के साथ संगत नहीं था. हालांकि, Klingberg एट अल प्रदर्शन किया है कि ECi सिद्धांत LSFM14के साथ संगत में है.

अंत में, एक सरल ECi आधारित ऑप्टिकल समाशोधन विधि का प्रदर्शन किया है, जो किसी भी अनुसंधान परियोजना के लिए लागू किया जा सकता है निश्चित ऊतक स्लाइस का उपयोग कर $100 m से लेकर मोटाई में कई मिलीमीटर के लिए. यह भी व्यावहारिक विश्लेषण है कि पहले लगभग संपूर्ण प्रयासों को पूरा करने की आवश्यकता की अनुमति देता है, और आवश्यक मान्यताओं और आकृति विज्ञान के दो आयामी विश्लेषण के साथ जुड़े अनुमान समाप्त. पूरे-माउंट इम्यूनोलेबलिंग, ऑप्टिकल समाशोधन, और उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संयोजन से स्वास्थ्य और बीमारी में सेलुलर समारोह की समझ को आगे बढ़ाने में मदद मिलेगी।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

टी एस DFG जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (332853055), अन्य Kr$ner-Fresenius-Stiftung (2015-A197) से अनुदान द्वारा समर्थित है, और RWTH Aachen के चिकित्सा संकाय (आरडब्ल्यूटीरिटर्नर कार्यक्रम). वी जी पी ड्यूश Gesellschaft फर नेफ्रोलोजी, अलेक्जेंडर वॉन Humboldt फाउंडेशन, और ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद से अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित है। D. H. E Fondation LeDucQ द्वारा समर्थित है। आर के DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), Northrhinewestfalia के राज्य (MIWF-NRW) और RWTH Aachen विश्वविद्यालय में नैदानिक अनुसंधान के लिए अंतःविषय केंद्र (O3-11) से अनुदान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Fisher Scientific 09-761-112
15 mL conical tube Fisher Scientific 339650
21 G butterfly needle Braun Venofix
3-way stopcock Fisher Scientific K420163-4503
3D analyis software Bitplane AG IMARIS
3D analyis software Cellprofiler free open-source software
5-0 silk suture Fine Science Tools 18020-50
50 mL plastic syringes Fisher Scientific 14-817-57
Anti-BrdU monoclonal antibody Roche 11296736001
Antibody diluent Dako S0809
CD31-647 BioLegend 102516
Citrate-based antigen retrieval solution Vector Laboratories H-3300
Curved hemostat Fisher Scientific 13-812-14
Dako Wash Buffer Agilent S3006
Dissecting microscope Motic DSK-500
Embedding cassettes Carl Roth E478.1
Ethanol Merck 100983
Ethyl cinnamate Sigma-Aldrich 112372
Flexible film/Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Goat anti-AQP2 Santa Cruz Biotechnology sc-9882
Guinea pig anti-NKCC2 N/A N/A DOI: 10.1681/ASN.2012040404
HCl Carl Roth P074.1
Heparin Sagent Pharmaceuticals 401-02
Hemostat Agnthos 312-471-140
Horizontal rocker Labnet S2035-E
Imaging dish Ibidi 81218
Ketamine MWI Animal Health 501090
Micro serrefine Fine Science Tools 18052-03
NaOH Fisher Scientific S318-500
Operating scissors Merit 97-272
Paraformaldehyde Thermo Fischer Scientific O4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCC PhosphoSolutions p1311-53
Silicone elastomer World Precision Instruments Kwik-Sil KWIK-SIL
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Tissue slicer Zivic Instruments HSRA001-1
Triton X-100 Acros Organics AC215682500
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-00
Vibratome Lancer Series 1000
Xylazine MWI Animal Health AnaSed Inj SA (Xylazine)

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References

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).

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Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue. J. Vis. Exp. (149), e60002, doi:10.3791/60002 (2019).

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