Summary
Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.
Abstract
Optik temizleme teknikleri, sonraki üç boyutlu (3-b) görüntüleme için bir örnek boyunca refraktif indeks dengelenmiş doku şeffaf hale. Makroskopik mesafelere uzanan mikroskobik çok hücreli yapıları analiz etme potansiyeli için tüm araştırma alanlarında büyük önem aldılar. Böbrek tübülleri, damar, sinirler ve glomerüller, sadece kısmen geleneksel iki boyutlu teknikler tarafından şimdiye kadar yakalanan birçok yönde, uzatmak göz önüne alındığında, doku Temizleme de böbrek araştırma birçok yeni alanlar açtı. Optik temizleme yöntemlerinin listesi hızla büyüyor, ancak bu alandaki yeni başlayanlar için belirli bir araştırma sorusu için en iyi yöntemi seçmek zor kalır. Burada sağlanan kalın fare böbrek dilimleri antikor etiketleme birleştiren basit bir yöntemdir; ucuz, toksik olmayan ve kullanıma hazır kimyasal etil cinnamate ile optik temizleme; ve Konfokal görüntüleme. Bu protokol, böbrekler perfkullanmak ve özel ekipman gerektirmeden antikor bağlama artırmak için bir antijen alma adımı kullanın açıklamaktadır. Onun uygulama böbrek içinde görüntüleme farklı çok hücreli yapıları sunulmaktadır, ve nasıl doku içine zayıf antikor penetrasyon sorunlarını gidermek için ele alınmıştır. Ayrıca endojen fluorophores görüntüleme ve çok büyük numuneler edinme ve onları aşmak için potansiyel zorlukları tartışıyoruz. Bu basit protokol, üç boyutta doku çalışması için kolay kurulum ve kapsamlı bir araç sağlar.
Introduction
Tüm organlar veya büyük çok hücreli yapıların incelenmesi artan ilgi üç boyutta şeffaf doku görüntüleme içeren optik temizleme yöntemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Yakın zamana kadar, tüm yapıların hücre numarasını, uzunluğunu veya hacmini tahmin etmek için en iyi yöntemler stereoloji veya kapsamlı seri bölümlendirme olmuştur, bu iki boyutta sonraki analiz için doku sistemik örnekleme dayanmaktadır1, 2 , 3. ancak, bu yöntemler zaman alıcı ve eğitim ve uzmanlık yüksek düzeyde gerekir4. Optik temizleme yöntemleri, 3-b görüntüleme5,6,7için doku yarı saydam yapmak için bir örnek boyunca refraktif indeks dengelenerek bu sorunların üstesinden.
İki ana kategoriye düşen çeşitli optik temizleme yöntemleri geliştirilmiştir: solvent bazlı ve sulu bazlı Yöntemler. Sulu-tabanlı yöntemler daha basit daldırma8,9, hiperhidrasyon10,11ve hidrojel gömme12,13bölünebilir. Solvent bazlı Yöntemler dokusu susuz bırakmak, lipidleri kaldırmak ve 1,55 civarında bir değere refraktif indeksleri normalleştirmek. Çoğu solvent bazlı yöntemin sınırlamaları, GFP, solvent toksisitesi, bazı görüntüleme odalarında veya objektif lenslerde kullanılan yapıştırmaları çözünme kapasitesine sahip yaygın olarak kullanılan muhabir proteinlerinin endojen floresans ve dehidrasyon14,15,16,17,18,19,20,21. Ancak, solvent tabanlı Yöntemler, basit, zaman verimli ve farklı doku türleri bir dizi çalışabilir.
Sulu tabanlı Yöntemler, 1,38-1.52 aralığında refraktif endeksleri olan sulu çözümlerde dokusunun daldırma güveniyor8,11,12,22,23,24 . Bu yöntemler endojen floresan muhabiri protein emisyonunu korumak ve dehidrasyon kaynaklı daralma önlemek için geliştirilmiştir, ancak en sulu bazlı Temizleme yöntemlerinin sınırlamaları protokolün daha uzun bir süre içerir, doku genişleme, ve protein modifikasyon (örneğin SCALea2 gibi hiperhidrasyon protokollerinde üretan proteinleri kısmi denatürasyon)7,11,23,25. SCALe, üre kaynaklı doku genişlemesinin dehidrasyon ile dengelenmesi ve elektron mikroskobu10ile değerlendirildiği gibi doku ultrastrasyonu korunmuş olan Ürea ile Sorbitol ile birleştirerek doku genişlemesini ele aldı. Doku daralma veya genişleme yapıların mutlak boyutlarını, nesneler arasındaki mesafeleri veya hacim başına hücre yoğunluğunu etkiler; Böylece, doku temizlendiğinde boyut değişikliklerinin ölçülmesi elde edilen sonuçların yorumlanmasından7,26' ya yardımcı olabilir.
Genel olarak, optik temizleme için bir protokol, ön tedavi, geçirgen, immünolabeling (gerekirse), refraktif indeksleme ve gelişmiş ışık mikroskobu ile görüntüleme (örn. iki foton, konfoköz veya Floresan mikroskopisi). Temizleme yaklaşımlarının çoğu nöronal dokusu görselleştirmek için geliştirilmiştir, ve gelişmekte olan çalışmalar diğer organlarda uygulama doğruluyor5. Bu kapsamlı araç daha önce glomerül27,28, bağışıklık infiltratlar28, damarsal28ve tübül segmentleri dahil olmak üzere böbrek yapıları, güvenilir ve verimli analiz izin göstermiştir 29, ve glomerüler fonksiyon ve sağlık ve hastalık tübül remodeling daha iyi anlayış için ideal bir yaklaşımdır.
Burada özetlenen burada böbrek tübüllerin immünostonluk birleştiren bir solvent tabanlı yöntemdir; ucuz, toksik olmayan ve kullanıma hazır kimyasal etil sinamat (ECI) ile optik temizleme; ve tam tübül görselleştirme ve quantification sağlayan Konfokal mikroskobik görüntüleme. Bu yöntem basittir, antijen-alma böbrek dilimleri ticari antikorların boyama ile birleştirir ve en laboratuvarları için erişilebilir kılan özel ekipman gerektirmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi, Portland, Oregon, ABD ve Almanya 'nın Aachen kentinde ilgili yerel makamların kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.
1. retrograd abdominal aort perfüzyon ve fare böbrekleri Fikrasyonu
- Çözümleri aynı gün veya akşam önce hazırlayın ve bir gecede bir buzdolabında saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına (RT) sıcak çözümler.
-
1x fosfat-tamponlu tuz (PBS) içinde% 3 paraformaldehit (PFA) taze bir toplu olun. Yaklaşık 50-100 mL PFA fare başına gereklidir.
- % 3 PFA 1 L yapmak için: PFA 30 g tartım ve duman kaputu damıtılmış su 800 mL ekleyin. 50-60 °C ' ye kadar karıştırın ve ısıtın. 70 °C ' nin üstünde ısınmayın.
DIKKAT: PFA zehirli. PFA 'yı duman kaputunda hazırlayın. - Yavaşça 2N NaOH birkaç damla ekleyin. PFA çözüme gider veya birkaç damla daha eklemek kadar birkaç dakika bekleyin. Bazı küçük parçalar çözülür olmaz.
- Solüsyonu ısıdan çıkarın. 50 mL 20X PBS ekleyin. RT buz üzerinde Chill.
- HCl ile f 7.3-7.4 ayarlayın. 1 L 'ye damıtılmış su ekleyin.
- 0,22 μm filtreli 1x PBS ve% 3 PFA filtreleme yaparak çözülmemiş parçacıkları çıkarın.
- % 3 PFA 1 L yapmak için: PFA 30 g tartım ve duman kaputu damıtılmış su 800 mL ekleyin. 50-60 °C ' ye kadar karıştırın ve ısıtın. 70 °C ' nin üstünde ısınmayın.
- 1 L 1x PBS için heparin 1.000 birimleri ekleyin. 1x PBS 'de heparin ve% 3 PFA içeren 1x PBS 'yi ayrı 50 mL Plastik şırıngalar halinde aktarın.
Not: Varsa, basınç kontrollü pompa 80-100 mmHg veya hidrostatik basınç (damla yöntemi, perfüzyon çözümleri yüksekliği: 160-200 cm hayvan) böbrek perfüzyon için kullanılabilir ayarlayın. - PBS, PFA ve körelmiş 21 G kelebek iğne üç yönlü stopcock bağlayın. Tüm sistemde hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
- 15 mL konik tüpü etiketleyin ve 10 mL PFA 'yı içine yerleştirin.
- Derin anestezi bir erkek veya kadın C57BL/6 fare 12-24 kullanarak yaş 120 mg/kg vücut ağırlığı ketamin ve 16 mg/kg vücut ağırlığı xylazine. Hayvan cerrahiye geçmeden önce refleksleri pinching tarafından yanıt tam yokluğunda kontrol edilmelidir (örneğin, ayak tutam refleks).
- Hayvan anestezi bir cerrahi düzlem ulaştı sonra, onun arkasına diseksiyon mikroskop altında yerleştirin. Cerrahi bir makas kullanarak orta hat abdominal kesi ile karın açmak ve abdominal aorta maruz.
- Karın aortunu, eğri bir hemostat ile iliak arter için dallanma hemen yukarıda kelepçe. Sonra bir mikro serrafine ile böbrek arterlerin hemen altında abdominal aort kelepçe. Vannas makas ile iki kelepçeler arasında abdominal aort üzerinde küçük bir kesi (1 mm) olun. Kelebeği iğnesini yavaşça kesi içine takın ve abdominal aort açık olarak yırtmamaya dikkat edin.
- Bir 5-0 ipek sütür ile sağ böbrek arter ligate ve perfüzyon ve fiksasyon için sadece bir böbrek gerekirse diğer analiz için sağ böbrek çıkarın.
- Mikro serrafine çıkarın, Vannas makas ile portal ven Transect ve hemen heparin içeren PBS 50 ml ile serpmek, sonra geçiş ve% 3 PFA 50 ml ile serpmek.
Not: Abdominal aort ile yüksek perfüzyon basıncı, doku yoluyla daha iyi antikor difüzyon için böbrek tübülleri açmak için gereklidir. Kalp yoluyla perfüzyon böbrek tübülleri açmayabilir. - Özenle perfüze böbrek toplayın ve delme veya doku sıkılması kaçının.
- Kapsülü çıkarın ve böbreği 1 mm kalınlığında koronal dilimlere keser. Dilim kalınlığını standartlaştırmak etmek için bir dilimleyici matrisini (malzeme tablosu) kullanın.
Not: Alternatif olarak, bir vibratome kullanmayı düşünebilirsiniz. - Yazılı 15 mL konik tüpte hazırlanan PFA ile böbrek dilimlerini batırın.
- 10 mL PFA 'yı başka bir etiketli 15 mL Konik Tüpe dağıtın. Sonraki fare geçmeden önce PBS ile üç yönlü stopkoku ve kelebek iğne Flush.
- RT 'de gün ışığına karşı korunan bir gece sonrası sabitleme gerçekleştirin.
2. doku hazırlama ve Immünostasyon
- Post-fiks sonra, iki kez 1x yıkama tampon (malzeme tablosu) ile 1 saat RT yatay rocker üzerinde böbrek dilimi yıkayın.
- Antigen alma gerçekleştirin. 500 mL 'lik, 92-98 °C ' ye kadar 300 mL 1x antijeni maskeleme çözeltisi (TAble malzeme) ısı. 92-98 °C ' de 1 h için karıştırma ile ısıtılan tampona geçirgen kaset katıştırma dilimi içine alın. Isı kabı çıkarın ve RT serin bırakın.
Not: Bazı satıcılar bağışıklık Histokimya uygulaması için antikorlarını test eder ve veri sayfasında önerilen bir antijen alma yöntemini içerir. Bu nedenle, bazı epitopları daha temel bir tampon gerektirebilir (örn., pH 9). - Dilimi, 0,1% Triton X-100 ve kaya olarak bir gecede RT 'de 10 mL 1x yıkama tamponu içine aktarın. dilimlerini 2x ile 10 mL taze 1x yıkama tamponunu ertesi gün 1 saat yıkayın.
- Normal antikor seyreltici (malzeme tablosu) 500 μL 'de primer antikor seyreltilebilir. 1:50-1:100 bir konsantrasyon ile başlayın. 37 °C ' de 4 d için seyreltilmiş primer antikor içinde böbrek dilimini yavaşça kaya.
Not: Her antikor benzersiz özelliklere sahip olduğundan, antikor inkübasyon sırasında sıcaklık ve antikor dilüsyonları bireysel prob için optimize edilmesi gerekir. İkincil antikor sadece kontroller için, primer antikor olmadan seyreltilme böbrek dokusu inkübe. Ticari antikor seyreltme yerine, 0,1% Triton X-100 ve% 0,01 sodyum azid ile 1x PBS kullanılabilir. - 8 saat sonra bir yıkama tampon değişikliği ile RT 'de gece 10 mL 1x yıkama tamponunun içinde böbrek dilimi yıkayın.
- İkincil antikorları seyreltir (örn. 1:100, Alexa Fluor-konjuli ikincil antikorlar için), 500 μL 'de normal antikor seyreltici. 37 °C ' de 4 gün boyunca seyreltilmiş sekonder antikor içinde böbrek dilimlerini kulbe etme. Bu adımda, böbrek dilimleri ışığında koruyun.
- 8 saat sonra bir yıkama tampon değişikliği ile RT 'de gece 10 mL 1x yıkama tamponunun içinde böbrek dilimleri yıkayın.
3. doku Temizleme
- Yüksek dereceli 100% etanol (malzeme tablosu) 5 ml 'ye transfer böbrek dilimi (1 saat sonra taze etanol bir değişiklik ile) yumuşak sallanan RT 2 h için. Bu adım doku dehidrasyon içindir.
Not: Yüksek dereceli etanol sonraki adımda yüksek doku saydamlık elde etmek için gereklidir. Metanol veya tetrahidrofuran yüksek delipidation potansiyeli ile alternatif dehidrasyon reaktifler vardır. - Sadece RT (2 saat sonra taze ECi bir değişiklik ile) bir gecede yumuşak sallanan ile ECi 2 mL (malzeme tablosu) böbrek dilim bırakın.
Not: ECi 'nin donma/erime noktası 6-8 °C ' dir. Bu nedenle, örnekleri buzdolabına saklamayın. Düzgün havalandırılan bir duman kaputu içine daldırma ve giysi ve cilt ile doğrudan temas önlemek (ECi olmayan bir toksik gıda ve Ilaç Idaresi-onaylı bileşik ama güçlü bir koku vardır). Normal Eppendorf tüpler veya cam gemiler kullanın (polistiren gemiler yok). - Doku saydam ecin daldırma sonra elde edilebilir ve böbrek dilimleri görüntüleme için hazır olduğunda.
4. Confocalımaging ve görüntü analizi
Not: Görüntüleme için, refraktif endeks eşleştirme çözeltisi objektif objektif ile uyumlu olduğu sürece diğer mikroskopi teknikleri kullanılabilir. Bu protokol ters bir Konfokal mikroskop kullanır.
- Cam alt çanak (malzeme tablosu) içine 600-1000 μL eci ekleyin.
Not: Normal hücre kültürü yemeklerinden kaçının, çünkü ECi plastik yemekleri çözülecek bir organik çözücüdür. Benzer şekilde, ECi objektif lensler plastik parçalar/yalıtım halkaları saldırı olabilir. Uyumlu görüntüleme yemekleriyle ilgili genel bir bakış için uygun raporlara bakın30 ve kendinden Made 3-D baskılı Odalar28. - Yarı saydam böbrek dilimini çanak içine aktarın. Cam alt doğru ışık basıncı uygulamak için böbrek dilimi üzerinde yuvarlak bir lamel magazini yerleştirin. Ecın sızıntısını önlemek için tabağı parafin filmi (malzeme tablosu) ile mühürleyin.
Not: Tüm organlar veya birkaç milimetre kalınlığında doku dilimleri bir sınır gerektirebilir (diş çimento veya silikon elastomer; malzeme tablosunugörmek) numune Için bir eci-havuz yapmak için doku etrafında. - Çanak mikroskop görüntüleme platformu üzerine yerleştirin.
- Birkaç z-yığınları alın ve dikiş gerçekleştirin. Z-Step boyutu 5 μm ile başlayın.
Not: Çok kalın doku dilimleri veya organlarının görüntülenmesi için uzun çalışma mesafesi (> 5 mm) ve yüksek sayısal diyafram (> 0.9) hedeflerini kullanmayı düşünün. Görüntüleme sonrası, doku etanol geri aktarmak ve yıkama tampon veya PBS 0,02% sodyum azid ile saklayın. - Yazılım (malzeme tablosu) ile 3-b Rendering kullanarak görüntüyü analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Böbrek 43 farklı hücre tipleri31oluşan karmaşık organlar vardır. Bu hücrelerin çoğu glomerül ve tübüller gibi büyük çok hücreli yapıları oluşturur ve fonksiyonları birbirleri ile etkileşimlere son derece bağımlıdır. Klasik 2-D histolojik teknikler, bu büyük yapıları kısmen yakalar ve bozulmamış yapıların içinde odak değişikliklerini kaçırabilir31. Bu nedenle, optik temizleme tekniklerini kullanan 3-b analizi, sağlık ve hastalıklarda nasıl çalışmasını anlamanıza yardımcı olur.
Çoğu solvent bazlı optik temizleme teknikleri en azından kısmen endojen floresan muhabir protein sinyalini gidermek olacaktır. YFP-Tagged parvalbumin dehidratasyon ve ECI ile optik temizleme üzerine gözlemlendi (Şekil 1). Ancak, diğer güçlü floresan proteinleri sinyal-Quenching karşı ve pH temel seviyelere ayarlanması (pH 8-11) endojen floresan proteinleri stabilize olabilir14,20,28,30. Buna ek olarak, floresan protein emisyonu korunması istenirse sulu bazlı Yöntemler dikkate alınmalıdır. Bu geçerli raporda, bu solvent bazlı Temizleme protokolünün antikor etiketleme ile uyumlu olduğu gösterilmiştir; rağmen, özellikle böbrek gibi yoğun bir hücre zengini organ, doku derin immünolabeling elde etmek için zorlu kalır.
Böbrek retrograd abdominal aort perfüzyon daha sonra kan hücrelerini kaldırmak ve tübüller açmak için gerçekleştirilen (Şekil 2A, B). Bu yaklaşım otofloresans azaltır ve antikor difüzyon geliştirmek. Antikor konsantrasyonu doku ve antijen bolluk boyutuna bağlıdır. Bu nedenle, yüzeysel sinyal ya kötü antikor penetrasyon veya antikor yetersiz miktarda ilgili olabilir (Şekil 3A, B, Ayrıca bkz: Film 1). 1-2 gün sonra büyük numuneler veya son derece bol belirteçleri, antikor yüksek konsantrasyonları ve antikor yenileme için gerekli olabilir. Eğer faiz antijen böbrek damarında ifade edilir, antikor intravasküler teslim dikkate alınmalıdır (Şekil 3c). Ancak, tübül epitelyal hücrelerin apikal membranında proteinleri hedefleyen antikorlar, moleküler boyuta bağlı glomerüler filtrasyon bariyerini geçmez, böylece kan damarlarında ve glomerüllerde spesifik olmayan sinyallere neden olur (şekil 3D).
Bu protokol böbrek dilimleri veya tüm böbrekler için uygulanabilir (Şekil 4A, B). Antikor-özgüllüğü test etmek için, sadece kontroller ikincil antikor (Şekil 4c) maruz kalmıştır. Doku belirli bir hücre popülasyonunu tespit etmek için antikorlar ile etiketlenebilir (örn. proliferasyon hücreleri, Şekil 4d) veya segmentlere özgü antikorlar kullanarak tüm tübül segmentlerini görselleştirmek için (Şekil 4E). Dahası, birden fazla antikorların kombinasyonu 3-b farklı proteinleri colocalize fırsatı sağlar (örneğin, farklı uyaranlara üzerine tübül remodeling meydana gibi segmente özgü tübül hiperplazisi algılamak için) (Şekil 4F, g; Ayrıca bkz. Film 2).
Şekil 1: endojen floresan muhabiri protein sinyalinin giderici. (A) parvalbuminYFP +transjenik fardan elde edilen endojen floresan muhabir proteini 5 μm ince PFA-sabit dondurulmuş böbrek bölümlerinde algılanabilir. Oklar bazı floresan etiketli parvalbumin işareti+ distal konik tubule erken kısmında bulunan hücreler. (B) böbrek dokusunun optik temizlendikten sonra belirgin floresan sinyali görülmez. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: böbrek perfüzyon kalitesinin değerlendirilmesi. (A) periyodik asit SCHIFF (pas)-lekeli parafin gömülü doku (5 μm ince bölümler) biraz açılan lümen (genellikle fırça sınırına sahip proksimal tübüller; okları görmek) ile birkaç tübüller gösterir. (B) tüm tübüller iyi böbrek perfüzyon sonra açıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: tüm montaj immünolabeling sorun giderme. (A,B) Kalın bir böbrek dilimi, Henle döngüsünün kalın artan ekstremitinde ifade edilen, sodyum klorür cotransporter-2 (NKCC2) karşı bir antikor ile lekelenmiş. Sinyal doku yüzeyinde algılanabilir (oklar (B)). Ancak, antikor dokuya nüfuz etmedi [bkz: Arrowhead (B)]. (C) damarlarda ifade edilen intravasküler antikor enjeksiyonu (örn. CD31) hızlı ve homojen kan damarının lekeleymesine olanak sağlar. Güçlü bir sinyal ile yuvarlak yapıları glomeruli vardır. (D) ancak, proteinleri hedefleyen antikorlar tübül epitelia apikal membranı ifade (örneğin, fosforik sodyum-klorür cotransporter (phospho-NCC) hangi distal konik tübül içinde ifade edilir) glomerüler çapraz olmayacaktır filtrasyon bariyeri, böylece damarlarda spesifik olmayan sinyaller neden (bakınız ok ucu afferent arterioller ve diğer damarlarda işaret) ve glomerül (okları bakın). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: immünolabeled optik olarak temizlenmiş böbrek dokusunun temsili sonuçları. (A,B) Bu protokol tüm böbrek optik temizleme sağlar. (C) bir temsili z-yığın ikincil antikor önceden inkübasyon olmadan denetim olarak spesifik olmayan bağlama yokluğu göstermek için. (D) bir temsili z-yığını 3-b görselleştirme Proliferasyona bromodeoxyuridine gösterir (BrdU)+ böbrek medulla hücreleri. (E) medüller toplama kanalları Aquaporin-2 (AQP2) karşı bir antikor kullanılarak görselleştirildi. (F,G) AQP2+ medüller toplama kanalları Içinde BrdU+ hücrelerinin Analizi ve ölçümü. (F, G) için Ayrıca bkz: Film 2. Bu rakam saritas ve al.29' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Film 1 ( Şekil 3ile ilgili): 3-b NKCC2+kalın, Henle döngüsünün artan ekstremite görselleştirme. Film, optik olarak temizlenmiş bir böbrek diliminde zayıf antikor penetrasyonunu gösterir. Videoyu indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Film 2 ( Şekil 4ile ilgili): 3-b BrdU+hücreler ve AQP2+medüller toplama kanalları optik temizlenmiş böbrek diliminde görselleştirme. BrdU+ hücreler (kırmızı) ve AQP2+ medüller toplama kanalları (yeşil renkte) gösterilir. Imaris spot ve yüzey algoritmaları BrdU belirlemek için kullanılan+ hücreleri dışında (Turkuaz lekeler) veya içinde (pembe lekeler) AQP2+tübüllerin (yeşil yüzeyler). Bu film aslen saritas ve ark 'da ortaya çıktı. 29. lütfen videoyu indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optik temizleme teknikleri, 3-b görselleştirme ve çeşitli organlarda mikroanatomisinin ölçülmesi için geniş önem almıştır. Burada, solvent bazlı Temizleme Yöntemi (ECI) böbrek dilimleri içinde tüm tübüllerin 3-b görüntüleme için immünolabeling ile birleştirilir. Bu yöntem, basit, ucuz ve hızlı. Ancak, diğer araştırma soruları en iyi diğer temizleme protokolleri ile cevap olabilir5. Aynı zamanda solvent tabanlı yöntemlerin değişken derecelerde doku-küçülme neden, özellikle dehidrasyon adım14,18nedeniyle akılda tutmak önemlidir. Çoğu solvent bazlı Yöntem (örn., eci14) aynı zamanda Gfp veya tdtomato gibi gazetecilerin en az kısmen giderici endojen floresans; Böylece, FDıSCO32, CLARITY12veya CUBIC11 alternatif protokoller olarak hizmet verebilir. Ancak, ecin 'nin sönme efekti değişkendir ve her Reporter Mouse28' in bireysel yapılarını bağlıdır. Buna ek olarak, 1) Gfp ve diğer gazetecilere karşı bir floresan antikor veya 2) endojen floresan sinyalleri koruyan solvent tabanlı protokoller değiştirilmiş30,32 de bu bağlamda alternatif bir yaklaşım olabilir. Çeşitli grupların, 3-D RNA görselleştirmek için24,33,34 sulu tabanlı protokoller uyumluluğu test ettik söz değerinde, solvent tabanlı temizleme yöntemleri henüz test edilmemiş iken. Böylece, RNA Analizi kabul edildiğinde CLARITY33 değiştirilmiş versiyonu gibi sulu bazlı temizleme yöntemleri tercih edilmelidir.
Hücre veya faiz gen ürünleri endojen floresan protein ifadesi ile transgenik fareler kullanılarak görselleştirilebilir, ancak genetik olarak tasarlanan fare hatları nesil zaman alıcı ve pahalıdır. Bu nedenle, antikor etiketleme daha pratik ve daha fazla esneklik sağlar, büyük doku immünolabeling zor olmasına rağmen. Orijinal ECi protokol14aksine, bizim yaklaşım değiştirilmiş bir ECI optik temizleme yöntemi ve immünolabeling, bir antijen alma adımı kullanır birleştirir. Isı kaynaklı antijen alımı proteinleri denecektir, ancak PFA-Fixation35 sırasında antigenisite kaybını kurtarmak için yardımcı olur ve antikor-bağlayıcı geliştirir.
Bu protokolde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, böbreğin iyi perfüzyon gerçekleştirmek önemlidir. Hemoglobin kırmızı kan hücreleri içeren görüntüleme derinliği sınırlar7 ve açık lümen genişletilmiş tübüller antikor penetrasyon geliştirmek. Tübüllerin açılışı aynı zamanda epitelyal apikal membranında diğer apikal ifade edilen proteinlerin Kontralateral tarafta ifade edildiği proteinleri daha iyi ayırt etmenizi sağlar. Bununla birlikte, yapay olarak genişletilmiş tübüller, böbrek tübülü yapısını ve maskeyi spesifik patofizyolojik tepkisi olumsuz etkileyebilir (örneğin yaralı proksimal tübüllerin genişlememesi,) ancak sağlıklı tübüller36. İkinci olarak, 37 ° c ' den ziyade antikor inkübasyon 4 °C veya RT antikor penetrasyonunu geliştirir27. Ancak, her antikor benzersiz özelliklere sahiptir; Böylece, antikor inkübasyon sırasında sıcaklık bireysel problar için optimize edilmesi gerekir. Üçüncü olarak, Alexa Fluor-647 (uzak-kırmızı spektrumlu) ikincil antikorların kullanımı, özellikle böbrek mavi-yeşil spektrumunda37büyük miktarda otofloresans yaydığı için sinyal-gürültü oranını artırmaya yardımcı olur.
Retro-orbital enjeksiyon14 veya böbreğin perfüzyon38 fluorophore-konjuyum antikorlar kan damarlarında ifade edilen proteinlere karşı böbrek damarlarını etiketlemek için zarif ve hızlı bir yoldur. Ancak, antikor apikal membranındaki proteinler intravasküler enjeksiyon ile erişilemez kalır, çünkü antikorlar, 60-65 kDa aralığında proteinlerin filtrasyon için kesilmiş molekül ağırlığı ile glomerüler filtrasyon bariyerini geçemez. Bu nedenle, küçük antikor parçaları ve Fab parçaları (~ 55 kDa), diabodies (~ 50 kDa), tandem scFv (~ 28 kDa) veya nüklik-asit aptamers (~ 6-30 kDa) gibi mühendislik türevleri kullanımı antikorların korunan moleküler tanıma özellikleri ile bir sağlayabilir tübüllerin38,39apikal membranı erişmek için fırsat. Buna ek olarak, elektrik alanları40 veya basınç13 veya sodyum Dodesil sülfat (SDS) tabanlı temizleme protokolleri kullanımı ile küçük antikor parçaları kombinasyonu lipidleri kaldırmak için24,41,42 hızlı ve verimli doku antikor penetrasyon olanaklı hale gelebilir.
Çeşitli gruplar, reaktif Temizleme ile perfüzyon sadece protokol süresini azaltır, aynı zamanda doku şeffaflık artırır göstermiştir19,24,43,44. Bu nedenle, abdominal aort veya renal arter kanülasyon ile böbreğin sonraki perfüzyon ile susuz ve Refraktif endeks eşleştirme çözümleri daha iyi ve daha hızlı doku Temizleme elde etmek için düşünülmelidir. Ancak, biz reaktifler Temizleme ile tüm böbrek serpmek vermedi ve çeşitli nedenlerle dilimlenmiş böbrekler kullanılır. İlk olarak, farklı antijenler bir böbreğin birden fazla böbrek dilimleri antikor etiketleme tarafından görselleştirilebilir. İkincisi, daha az zaman ve antikor bir böbrek dilimi immünolabeling bir bütün böbrek ile karşılaştırıldığında gerçekleştirmek için gereklidir. Üçüncü olarak, büyük numunelerin 3-b görüntüleme çoğu iş istasyonları için yönetmek zor olabilir birkaç terabayt, veri kümeleri oluşturur. Bu nedenle, doku dilimleri veya büyük dosyaların alt kümeleri verileri otomatik sayım veya mesafe ölçümleri gibi karmaşık işlemleri gerçekleştirmek için daha uygundur.
Bu protokolde, Konfokal mikroskopisi, tek hücreli çözünürlüğe sahip görüntüleme yapmak için kullanılır, bu da özellikle kolokalizasyon çalışmalarla ilgilidir. Ancak, görüntüleme hızı yalnızca küçük temizlenmiş doku parçaları için pratik olduğundan, konfoksel görüntüleme Lazer taraması gerektirir. Uzun tübül segmentleri ve hatta tüm organlar gibi çok hücreli yapıların 3-b morfometrik analizini gerçekleştirmek için, hafif sac floresan mikroskoplar (lsfm) gibi daha hızlı mikroskop teknikleri gereklidir. En yüksek hücresel çözünürlük gerekli olmadığında LSFM hızlı görüntüleme sağlar. Örneğin, distal konik tübüllerin uzunlukları yakın zamanda tüm montaj immünolabeling, CLARITY12dayalı optik temizleme ve lsfm29birleştirerek değerlendirildi. Ne yazık ki, ticari LSFM pahalı ve her zaman solvent tabanlı temizleme protokolleri ile uyumlu değildir. Aslında, bu çalışma için CLARITY seçildi, çünkü özel LSFM ile CLARITY için özelleştirilmiş bir objektif ECI29ile uyumlu değildi. Ancak, Klingberg ve ark. ECi 'nin LSFM14ile uyumlu olduğunu göstermiştir.
Sonuç olarak, basit bir ECI tabanlı optik temizleme yöntemi gösterilmiştir, hangi herhangi bir araştırma projesi ~ 100 μm arasında değişen sabit doku dilimleri kullanarak uygulanabilir birkaç milimetre kalınlığında. Ayrıca, daha önce tamamlamak için neredeyse kapsamlı çabalar gerektiren uygulanabilir analizler sağlar ve morfoloji iki boyutlu analizi ile ilişkili gerekli varsayımlar ve çıkarımları ortadan kaldırır. Tüm montaj immünolabeling kombinasyonu, optik Temizleme, ve gelişmiş ışık mikroskopisi sağlık ve hastalık hücresel fonksiyon anlayışı ilerletmek yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
T. S. DFG Alman Araştırma Vakfı (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) ve RWTH Aachen Tıp Fakültesi (RWTH Returner programı) gelen hibe tarafından desteklenmektedir. V. G. P. Deutsche Gesellschaft kürk Nefrologie, Alexander von Humboldt Vakfı ve Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıp Araştırma Konseyi araştırma Burslar tarafından desteklenmektedir. D. H. E, Fondation LeDucq tarafından desteklenmektedir. R. K. DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) devleti ve RWTH Aachen Üniversitesi 'nde klinik araştırmalar için disiplinlerarası Merkezi (O3-11) ' den hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
References
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al.
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M.
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
