Summary
Kombinationen av antikropps märkning, optisk clearing och avancerad ljusmikroskopi möjliggör tredimensionell analys av kompletta strukturer eller organ. Beskrivs här är en enkel metod för att kombinera immunolabeling av tjocka njure skivor, optisk clearing med etylcinnamate, och konfokal avbildning som möjliggör visualisering och kvantifiering av tredimensionella njure strukturer.
Abstract
Optiska clearing tekniker gör vävnaden transparent genom att jämtera brytningsindex i ett prov för efterföljande tredimensionell (3D) avbildning. De har fått stor uppmärksamhet inom alla forskningsområden för potentialen att analysera mikroskopiska flercelliga strukturer som sträcker sig över makroskopiska avstånd. Med tanke på att njurtubuli, vasculature, nerver, och glomeruli sträcker sig i många riktningar, som har endast delvis fångas upp av traditionella tvådimensionella tekniker hittills, vävnad clearing öppnade också många nya områden av njur forskning. Listan över optiska clearing metoder växer snabbt, men det är fortfarande svårt för nybörjare inom detta område att välja den bästa metoden för en given forskningsfråga. Tillhandahålls här är en enkel metod som kombinerar antikropp märkning av tjocka mus njure skivor; optisk clearing med billig, giftfri och klar att använda kemisk etylcinnamat; och konfokal avbildning. Detta protokoll beskriver hur man parfymera njurar och använder ett antigen-hämtningsteg för att öka antikropps bindningen utan att kräva specialiserad utrustning. Dess tillämpning presenteras i Imaging olika flercelliga strukturer inom njuren, och hur man felsöker dålig antikropp penetration i vävnad adresseras. Vi diskuterar också de potentiella svårigheterna med att avbilda endogena fluorofotar och förvärva mycket stora prover och hur man kan övervinna dem. Detta enkla protokoll ger en enkel att installera och omfattande verktyg för att studera vävnad i tre dimensioner.
Introduction
Det växande intresset för att studera hela organ eller stora flercelliga strukturer har lett till utvecklingen av optiska clearing metoder som involverar avbildning av transparent vävnad i tre dimensioner. Fram till nyligen har de bästa metoderna för att uppskatta cellantal, längd eller volym av hela strukturer varit stereo logi eller uttömmande seriell snittning, som bygger på systemisk provtagning av vävnad för efterföljande analys i två dimensioner1, 2 , 3. dessa metoder är dock tidskrävande och behöver en hög utbildningsnivå och expertis4. Optiska clearing metoder övervinna dessa problem genom att för brytningsindex i ett prov för att göra vävnad genomskinlig för 3-D Imaging5,6,7.
Flera optiska clearing metoder har utvecklats som hör till två huvudkategorier: lösningsmedelsbaserade och vattenbaserade metoder. Vattenbaserade metoder kan delas upp ytterligare i enkla Immersion8,9, Hyperhydrering10,11, och hydrogel inbäddning12,13. Lösningsmedelsbaserade metoder torkar vävnaden, avlägsnar lipider och normaliserar brytningsindexet till ett värde runt 1,55. Begränsningar av de flesta lösningsmedelsbaserade metoder är kylning av endogena fluorescens av vanligt förekommande reporter proteiner såsom GFP, lösningsmedelstoxicitet, förmåga att lösa upp lim som används i vissa bild kammare eller objektiva linser, och krympning av vävnad under dehydrering14,15,16,17,18,19,20,21. Lösningsmedelsbaserade metoder är dock enkla, tidseffektiva och kan fungera i ett antal olika vävnadstyper.
Vattenbaserade metoder förlitar sig på nedsänkning av vävnaden i vattenlösningar som har brytningsindex i intervallet 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Dessa metoder har utvecklats för att bevara endogena fluorescerande reporter protein emission och förhindra uttorkning-inducerad krympning, men begränsningar av de flesta vattenbaserade clearing metoder inkluderar en längre varaktighet av protokollet, vävnadsexpansion, och proteinmodifiering (dvs. partiell denaturering av proteiner genom urea i hyperhydrerande protokoll såsom SCALea2)7,11,23,25. SCALeS behandlade vävnadsexpansion genom att kombinera urea med sorbitol, som motbalanserar genom uttorkning urea-inducerad vävnad expansion, och bevarade vävnaden ultrastruktur som utvärderas av elektronmikroskopi10. Vävnad krympning eller expansion påverkar de absoluta storlekarna av strukturer, avstånd mellan objekt, eller celltäthet per volym; Således kan mätningen av storleksändringar vid röjning av vävnaden hjälpa till att tolka de erhållna resultaten7,26.
I allmänhet består ett protokoll för optisk clearing av flera steg, inklusive förbehandling, permeabilisering, immunolabeling (vid behov), refraktiv index matchning och avbildning med avancerad ljusmikroskopi (t. ex. två-Photon, Confocal, eller fluorescens-mikroskopi). De flesta av clearing metoder har utvecklats för att visualisera neuronala vävnad, och nya studier har validerat sin ansökan i andra organ5. Detta omfattande verktyg har tidigare visat sig möjliggöra tillförlitlig och effektiv analys av njur strukturer, inklusive glomeruli27,28, immuninfiltrat28, kärlsystemet28, och tubuli segment 29, och det är en idealisk metod för att bättre förstå glomerulär funktion och tubuli remodeling i hälsa och sjukdom.
Sammanfattas här är en lösningsmedelsbaserade metod som kombinerar immunofärgning av njurtubuli; optisk clearing med billig, giftfri och klar att använda kemisk etylcinnamat (ECi); och konfokal mikroskopi avbildning som möjliggör komplett tubuli visualisering och kvantifiering. Denna metod är enkel, kombinerar antigen-hämtning av njure skivor med färgning av kommersiella antikroppar, och kräver inte specialiserad utrustning, vilket gör den tillgänglig för de flesta laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Alla experimentella procedurer som beskrivs här godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, USA, och relevanta lokala myndigheter i Aachen, Tyskland.
1. retrograd buk aorta perfusion och fixering av mus njurar
- Förbered lösningar samma dag eller kväll innan och förvara i ett kylskåp över natten. Varma lösningar till rumstemperatur (RT) före användning.
-
Gör en ny omgång 3% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Om 50-100 mL PFA behövs per mus.
- För att göra 1 L av 3% PFA: väg 30 g PFA och tillsätt 800 mL destillerat vatten i rök huven. Rör om och Värm till 50-60 ° c. Värm inte över 70 ° c.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftigt. Förbered PFA i draghuv. - Tillsätt långsamt flera droppar av 2N NaOH. Vänta några minuter tills PFA går in i lösningen eller lägga till några droppar. Vissa små bitar kommer inte att lösas upp.
- Ta bort lösningen från värmen. Tillsätt 50 mL 20x PBS. Chill på is till RT.
- Justera pH till 7.3-7.4 med HCl. Tillsätt destillerat vatten till 1 L.
- Avlägsna alla oupplösta partiklar genom att filtrera 1x PBS och 3% PFA med 0,22 μm filter.
- För att göra 1 L av 3% PFA: väg 30 g PFA och tillsätt 800 mL destillerat vatten i rök huven. Rör om och Värm till 50-60 ° c. Värm inte över 70 ° c.
- Tillsätt 1 000 enheter heparin till 1 L 1x PBS. Överför 1x PBS innehållande heparin och 3% PFA i 1x PBS i separata 50 mL plast sprutor.
Anmärkning: Om tillgängligt, tryckstyrd pump inställd på 80-100 mmHg eller hydrostatiskt tryck (dropp metod, höjden av perfusion lösningar: 160-200 cm över djur) kan användas för njure perfusion. - Anslut PBS, PFA och en avtruvad 21 G fjäril nål till en trevägs stopcock. Se till att det inte finns några luftbubblor i hela systemet.
- Märk ett 15 mL koniskt rör och fördela 10 mL PFA i det.
- Djupt söva en manlig eller kvinnlig C57BL/6 mus 12-24 veckors ålder med 120 mg/kg kroppsvikt ketamin och 16 mg/kg kroppsvikt xylazin. Djuret måste kontrolleras för fullständig avsaknad av lyhördhet genom att nypa reflexer innan du fortsätter till kirurgi (t. ex., tå nypa reflex).
- När djuret har nått ett kirurgiskt plan av anestesi, placera den på ryggen under dissekera Mikroskop. Kirurgiskt öppna buken med en mittlinje buken snitt med en fungerande sax och exponera bukaorta.
- Klämma buken aorta precis ovanför förgrening till iliaca artären med en böjd hemostat. Sedan klämma buken aorta direkt under njurartärerna med en mikro serraffinera. Gör ett litet snitt (1 mm) på bukaorta mellan de två klämmorna med Vännäs sax. Sätt in fjärilnålen i snittet långsamt och var noga med att inte rippa bukaorta öppna.
- Ligate rätt njurartär med en 5-0 Silk sutur och ta bort rätt njure för andra analys om endast en njure behövs för perfusion och fixering.
- Ta bort Micro serraffinera, transekt portalen ven med Vännäs sax, och omedelbart parfymera med 50 ml PBS innehåller heparin, sedan byta och parfymera med 50 ml 3% PFA.
Anmärkning: Högt perfusionstryck genom bukaorta krävs för att öppna njurtubuli för bättre antikropps diffusion genom vävnad. Perfusion genom hjärtat kan inte öppna njurtubuli. - Samla den parfymera njuren noggrant och undvika punktera eller klämma vävnaden.
- Ta bort kapseln och skär njuren i 1 mm tjocka koronala skivor. Använd en utsnitts mat ris (tabell över material) för att standardisera segment tjockleken.
Anmärkning: Alternativt kan du överväga att använda en vibratome. - Sänk ned njurskiden med den beredda PFA i den märkta 15 mL koniska röret.
- Dispensera 10 mL PFA till ett annat märkt 15 mL koniskt rör. Spola trevägs Avstängningskranen och fjäril nål med PBS innan du flyttar till nästa mus.
- Utför efter fixering över natten vid RT skyddat från ljus.
2. vävnads beredning och immunofärgning
- Efter efter fixering, tvätta njure slice två gånger med 1x tvättbuffert (tabell över material) för 1 h på en horisontell Rocker vid RT.
- Utföra antigen hämtning. Värm upp 300 mL 1x antigen avmasknings lösning (Tmaterial) i en 500 ml bägare till 92-98 ° c. Omsluta segmentet i inbäddnings kassett genomsläpplig till uppvärmd buffert med omrörning för 1 h vid 92-98 ° c. Ta bort bägaren från värmen och låt den svalna till RT.
Anmärkning: Vissa leverantörer testar sina antikroppar för immunohistokemi ansökan och kommer att innehålla en föreslagen antigen hämtningsmetod i databladet. Därför kan vissa epitoper kräva en mer grundläggande buffert (t. ex., pH 9). - Överför segmentet till 10 mL 1x tvättbuffert med 0,1% Triton X-100 och rock över natten vid RT. Tvätta skivorna 2x med 10 mL färsk 1x tvättbuffert för 1 h nästa dag.
- Späd den primära antikroppen i 500 μL av den normala antikropps spädningsvätskan (tabell över material). Börja med en koncentration av 1:50-1:100. Försiktigt klippa njure slice i utspädd primär antikropp för 4 d vid 37 ° c.
Anmärkning: Eftersom varje antikropp har unika egenskaper, måste temperaturen vid inkubation av antikroppar och spädningar av antikroppar optimeras för enskilda sonder. För kontroll av sekundära antikroppar, inkubera njure vävnad i spädningsvätska utan primär antikropp. I stället för kommersiell antikropps spädningsvätska kan 1x PBS med 0,1% Triton X-100 och 0,01% natriumazid användas. - Tvätta njure skiva i 10 mL 1x tvättbuffert över natten vid RT med en förändring av tvättbuffert efter 8 h.
- Späd ut de sekundära antikropparna (t. ex. 1:100 för Alexa fluor-konjugerade sekundära antikroppar) i 500 μL av den normala antikropps spädningsvätskan. Inkubera njurskivorna i utspädd sekundär antikropp i 4 dagar vid 37 ° c. Från detta steg och framåt, skydda njure skivor från ljus.
- Tvätta njure skivorna i 10 mL 1x tvättbuffert över natten vid RT med en ändring av tvättbuffert efter 8 h.
3. vävnads rensning
- Överför njure slice till 5 mL av hög grad 100% etanol (tabell över material) för 2 h vid RT med mild Rocking (med en förändring till färsk etanol efter 1 h). Detta steg är för vävnad uttorkning.
Anmärkning: Hög kvalitet etanol krävs för att uppnå en hög vävnad translucens i nästa steg. Metanol eller tetrahydrofuran är alternativa dehydratisering reagenser med hög delipidation potential. - Sänk njure slice i 2 mL av ECi (tabell över material) med mild gunga på RT (med en förändring till färskt ECI efter 2 h) över natten.
Anmärkning: Infrysningen/smältpunkten för ECi-dokument är 6-8 ° c. Förvara därför inte proverna i kylskåpet. Genomför nedsänkning i ett väl ventilerat draghuv och Undvik direkt kontakt med kläder och hud (ECi är en giftfri livsmedels-och läkemedels administration godkänd förening men har en stark lukt). Använd regelbundna Eppendorf-rör eller glas fartyg (inga polystyrenkärl). - Vävnads genomskinlighet kan uppnås efter nedsänkning i ECi-dokument och när njurskivorna är klara för avbildning.
4. ConfocalImaging och bildanalys
Anmärkning: För avbildning kan andra mikroskopi tekniker användas så länge brytningsindex matchande lösning är kompatibel med objektivlinsen. Detta protokoll använder ett inverterat konfokalmikroskop.
- Tillsätt 600-1000 μL ECi-dokument i glasbotten skålen (tabell över material).
Anmärkning: Undvik att använda vanliga cellkultur rätter, eftersom ECi är ett organiskt lösningsmedel som kommer att lösa upp plast rätterna. På samma sätt kan ECi attackera plastdelar/isolerings ringar på objektiva linser. Se lämpliga rapporter för en översikt över kompatibla bild rätter30 och egentillverkade 3-D tryckta kamrar28. - Överför genomskinliga njure skiva i skålen. Placera en rund täckglas på njurens skiva för att applicera lätt tryck mot glas bottnen. Försegla skålen med paraffin film (tabell över material) för att undvika läckage av ECI.
Anmärkning: Hela organ eller flera millimeter tjock vävnad skivor kan kräva en gräns (tandcement eller silikon elastomer; se tabell över material) runt vävnaden för att göra en ECI-pool för provet. - Placera skålen på Mikroskop Imaging plattformen.
- Ta flera z-stackar och utföra sömnad. Börja med en z-stegs storlek på 5 μm.
Anmärkning: Överväg att använda långa arbetsavstånd (> 5 mm) och höga numeriska bländare (> 0,9) mål för avbildning av mycket tjocka vävnads skivor eller organ. Efter avbildning, överför vävnaden tillbaka till etanol och förvara i tvättbuffert eller PBS med 0,02% natriumazid. - Analysera bilden med hjälp av 3D-rendering med programvara (tabell över material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Njurar är komplexa organ som består av 43 olika celltyper31. De flesta av dessa celler bildar stora flercelliga strukturer såsom glomeruli och tubuli, och deras funktion är mycket beroende av interaktioner med varandra. Klassisk 2-D histologisk teknik fångar delvis dessa stora strukturer och kan sakna Bränn förändringar inom intakt strukturer31. Sålunda, 3-D analys med hjälp av optiska clearing tekniker hjälper till att förstå hur de fungerar i hälsa och sjukdom.
De flesta lösningsmedelsbaserade optiska clearing tekniker kommer åtminstone delvis att släcka den endogena fluorescerande reporter protein signalen. Kylning av YFP-märkta Parvalbumin observerades vid uttorkning och optisk röjning med ECi (figur 1). Andra starka fluorescerande proteiner kan dock motstå signal kylning, och justering av pH till grundläggande nivåer (pH 8-11) kan stabilisera endogena fluorescerande proteiner14,20,28,30. Dessutom bör vatten-baserade metoder övervägas om fluorescerande protein utsläpp bevarande önskas. I den aktuella rapporten visas att detta lösningsmedelsbaserade clearingprotokoll är kompatibelt med antikropps märkning. även om, det är fortfarande utmanande att uppnå djup immunolabeling av vävnad, särskilt i en tät cell-rika organ såsom njuren.
Retrograd buk aorta perfusion av njurarna utfördes sedan för att ta bort blodkroppar och öppna upp tubuli (figur 2a, B). Detta tillvägagångssätt minskar autofluorescence och förbättra antikropp diffusion. Koncentrationen av antikroppar beror på storleken på vävnaden och förekomsten av antigenet. Därför kan den ytliga signalen avse antingen dålig antikropps inträngning eller otillräcklig mängd antikropp (figur 3A, B, Se även film 1). För stora prover eller extremt rikliga markörer kan högre koncentrationer av antikroppar och påfyllning av antikroppar efter 1-2 dagar krävas. Om antigen av intresse uttrycks i njurvasulatur bör intravaskulär tillförsel av antikroppen övervägas (figur 3c). Men antikroppar som riktar sig mot proteiner i det apikala membranet i tubuli epitelceller korsar inte den glomerulära filtrerings barriären på grund av molekylstorlek, vilket orsakar ospecifika signaler i blodkärlen och glomeruli (figur 3D).
Detta protokoll kan appliceras på njurskivor eller hela njurar (figur 4A, B). För att testa antikropps specificitet utsattes endast kontroller för sekundär antikropp (figur 4c). Vävnaden kan märkas med antikroppar för att detektera en specifik cellpopulation (t. ex. prolifererande celler, figur 4D) eller för att visualisera hela tubuli segment med hjälp av segmentsspecifika antikroppar (figur 4e). Dessutom, kombinationen av flera antikroppar ger möjlighet att colocalize olika proteiner i 3-D (t. ex., att upptäcka segmentsspecifika tubuli hyperplasi eftersom det förekommer i tubuli Remodeling på olika stimuli) (figur 4F, g; Se även film 2).
Figur 1: kylning av endogena fluorescerande reporter protein signal. A) den endogena fluorescerande reportern protein som härrör från Parvalbuminyfp +transgena mus är detekterbar i 5 μm tunna PFA-fasta frysta njure sektioner. Pilarna markerar några fluorescerande-märkta parvalbumin+ celler som ligger i början av den distala invecklade tubuli. (B) ingen uppenbar fluorescerande signal efter den optiska clearing av njure vävnad observeras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: utvärdering av njurens per fusions kvalitet. A) periodiska syrliga SCHIFF (PAS)-färgade paraffin inbäddade vävnad (5 μm tunna sektioner) visar några tubuli med en något öppnad lumen (typiskt proximala tubuli som besitter pensel gränsen, se pilar). (B) alla tubuli öppnas upp efter god njure perfusion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Felsöka hel-Mount immunolabeling. (a,B) En tjock njure skiva färgas med en antikropp mot natriumkloridcotransporter-2 (NKCC2), som uttrycks i den tjocka stigande delen av slingan av Henle. Signalen är detekterbar på ytan av vävnaden (pilar i (B)). Men, antikroppen inte tränga in i vävnaden [se Arrowhead i (B)]. C) intravaskulär injektion av antikroppar som riktar sig mot proteiner som uttrycks i kärlen (t. ex. CD31) möjliggör snabb och homogen färgning av blodkärlen. Rundan strukturerar med ett starkt signalerar är glomeruli. (D) antikroppar som riktar sig mot proteiner som uttrycks i det apikala membranet hos tubuli epitel (t. ex. fosforylerad natriumkloridcotransportör (Phospho-NCC) som uttrycks i den distala invecklade tubulen) kommer inte att korsa den glomerulära filtrerings barriär, vilket orsakar ospecifika signaler i vaskulaturen (se Arrowhead pekar på afferenta arterioler och andra fartyg) och glomeruli (se pilar). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat av immunolabeled optiskt clearad njurvävnad. (a,B) Detta protokoll tillåter optisk clearing av hela njuren. Cen representativ z-stack för att Visa avsaknad av icke-specifik bindning av sekundär antikropp som kontroll utan föregående inkubation. (D) 3D-visualisering av en representativ z-stack visar prolifererande Bromdeoxiuridin (BrdU)+ celler i njure medulla. (E) medullära uppsamlings kanaler visualiseras med hjälp av en antikropp mot aquaporin-2 (AQP2). (F,G) Analys och kvantifiering av BrdU+ celler inom AQP2+ medullär insamlings kanaler. För (F, G), se även film 2. Denna siffra har modifierats från saritas et al.29. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1 (relaterat till figur 3): 3-D visualisering av NKCC2+tjock stigande del av slingan av Henle. Filmen visar dålig antikropps inträngning i en optiskt rensat njure slice. Vänligen klicka här för att ladda ner videon.
Film 2 (relaterat till figur 4): 3D-visualisering av BrdU+-celler och AQP2+medullär uppsamlings kanaler i en optiskt rensat njure skiva. BrdU+ -celler (i rött) och AQP2+ medullär uppsamlings kanaler (i grönt) visas. Imaris spot-och ytalgoritmer användes för att bestämma BrdU+ -celler utanför (turkosa fläckar) eller inuti (rosa fläckar) AQP2+tubuli (gröna ytor). Den här filmen publicerades ursprungligen i saritas et al. 29. vänligen klicka här för att ladda ner videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optisk clearing tekniker har fått stor uppmärksamhet för 3-D visualisering och kvantifiering av mikroanatomi i olika organ. Här, lösningsmedelsbaserade clearing metod (ECi) kombinerades med immunolabeling för 3-D avbildning av hela tubuli i njure skivor. Denna metod är enkel, billig och snabb. Andra forskningsfrågor kan dock bäst besvaras med andra clearingprotokoll5. Det är också viktigt att komma ihåg att lösningsmedelsbaserade metoder orsakar vävnad krympning vid varierande grader, främst på grund av uttorkning steg14,18. De flesta lösningsmedelsbaserade metoder (t. ex. ECI14) också åtminstone delvis släcka endogena fluorescens av reportrar som GFP eller tdtomato; Sålunda, FDISCO32, Clarity12, eller Cubic11 kan fungera som alternativa protokoll. Den släckande effekten av ECi är dock varierande och beror på enskilda konstruktioner av varje reporter Mouse28. Dessutom, användning av 1) en fluorescerande antikropp mot GFP och andra reportrar eller 2) modifierade lösningsmedelsbaserade protokoll som bevarar endogena fluorescens signaler30,32 kan också vara en alternativ metod i detta sammanhang. Det är värt att nämna att flera grupper har testat kompatibiliteten av aqueous-baserade protokoll24,33,34 för att visualisera RNA i 3-D, medan lösningsmedelsbaserade clearing metoder har ännu inte testats. Således bör vattenbaserade clearing metoder såsom den modifierade versionen av CLARITY33 vara att föredra när RNA-analys beaktas.
Celler eller genprodukter av intresse kan visualiseras med hjälp av transgena möss med endogent fluorescerande proteinuttryck, men generationen av genetiskt modifierade mus linjer är tidskrävande och dyrt. Därför är antikropps märkning mer praktiskt och ger mer flexibilitet, även om immunolabeling av stor vävnad är utmanande. I motsats till det ursprungliga medborgarinitiativet protokoll14, kombinerar vår metod en modifierad ECI optisk clearing metod och immunolabeling, som använder ett antigen-hämtning steg. Värmeinducerade antigen-hämtning kommer denaturera proteiner, men hjälper till att återhämta förlust av antigenicitet under PFA-fixering35 och förbättrar antikroppsbindning.
Det finns några kritiska steg i det här protokollet. Först, det är viktigt att utföra god perfusion av njuren. Hemoglobin som innehåller röda blodkroppar begränsar Imaging djup7 och expanderade tubuli med öppna lumen öka antikropp penetration. Öppnandet av tubuli ger också bättre särskiljande av proteiner uttrycks i epitelial apikala membran från andra apically uttryckt proteiner på kontralaterala sidan. Emellertid, artificiellt expanderade tubuli kan negativt påverka tubuli struktur och mask specifika patofysiologiska svar av njuren (t. ex. dilatation av skadade proximala tubuli,) men inte av friska tubuli36. Andra, antikropp inkubering vid 37 ° c i stället för 4 ° c eller RT förbättrar antikropp penetration27. Varje antikropp har dock unika egenskaper; Således måste temperaturen vid inkubation av antikroppar optimeras för enskilda sonder. För det tredje, användningen av Alexa fluor-647 (far-Red Spectrum) sekundära antikroppar bidrar till att öka signal-brus-förhållande, särskilt eftersom njurarna avger en stor mängd autofluorescence i den blå-gröna spektrumet37.
Retro-orbital injektion14 eller perfusion av njure38 med fluorophore-konjugerade antikroppar mot proteiner uttrycks i blodkärlen är ett elegant och snabbt sätt att märka njure vasculature. Emellertid, proteiner i apikala membranet av tubuli förbli otillgängliga genom intravaskulär injektion eftersom antikroppar inte kan korsa glomerulär filtrering barriären med sin cut-off molekylvikt för filtrering av proteiner i intervallet 60-65 kDa. Därför kan användningen av små antikropps fragment och konstruerade varianter såsom fab fragment (~ 55 kDa), diabodies (~ 50 kDa), tandem scFv (~ 28 kDa) eller nukleinsyra aptamers (~ 6-30 kDa) med bevarade molekylära erkännanden egenskaper av antikroppar ge en möjlighet att få tillgång till det apikala membranet i tubuli38,39. Dessutom är kombinationen av små antikropps fragment med elektriska fält40 eller tryck13 eller användning av natriumdodecylsulfat (SDS)-baserade clearingprotokoll för att avlägsna lipider24,41,42 kan möjliggöra snabb och effektiv antikropps inträngning av vävnad.
Flera grupper visade att perfusion med clearing reagens inte bara minskar protokollet tid, men också ökar vävnad öppenhet19,24,43,44. Därför, kanylering av bukaorta eller Njurartären med efterföljande perfusion av njuren med uttorkande och refraktiv index matchande lösningar bör övervägas för att uppnå bättre och snabbare vävnad clearing. Vi har dock inte parfymera hela njuren med clearing reagenser och använt skivade njurar av flera anledningar. Först, olika antigener kan visualiseras genom antikropp märkning av flera njure skivor från en njure. För det andra, mindre tid och antikropp behövs för att utföra immunolabeling av en njure slice jämfört med en hel njure. Tredje, 3D-avbildning av stora prover genererar datauppsättningar upp till flera terabyte, vilket kan vara utmanande att hantera för de flesta arbetsstationer. Data från vävnads segment eller delmängder av större filer är därför mer praktiskt att utföra komplexa åtgärder, till exempel automatiserade inventerings-eller avståndsmätningar.
I detta protokoll används konfokalmikroskopi för att utföra avbildning med encellsupplösning, vilket är särskilt relevant vid studier av samlokalisering. Dock kräver konfokal avbildning laserskanning, eftersom dess bildhastighet är endast praktiskt för små bitar av rensad vävnad. För att utföra 3-D morphometriska analys av flercelliga strukturer såsom långa tubuli segment eller ens hela organ, snabbare Mikroskop tekniker såsom ljus blad fluorescerande Mikroskop (lsfm) är nödvändiga. LSFM tillåter snabb avbildning när den högsta cellulära upplösningen inte är nödvändig. Till exempel, de längder av distala invecklade tubuli bedömdes nyligen genom att kombinera hela Mount immunolabeling, optisk clearing baserad på klarhet12, och LSFM29. Tyvärr är kommersiella LSFM dyrt och inte alltid förenligt med lösningsmedelsbaserade clearing protokoll. I själva verket valdes klarhet för denna studie, eftersom vår särskilda LSFM med ett mål anpassade för tydlighet inte var förenligt med ECi29. Klingberg et al. visade dock att ECi i princip är förenligt med LSFM14.
Sammanfattningsvis, en enkel ECi-baserade optisk clearing metod demonstreras, som kan tillämpas på alla forskningsprojekt med hjälp av fasta vävnad skivor som sträcker sig från ~ 100 μm till flera millimeter i tjocklek. Det möjliggör också genomförbara analyser som tidigare krävde nästan uttömmande insatser för att slutföra, och eliminerar de nödvändiga antaganden och slutsatser som är förknippade med tvådimensionell analys av morfologi. Kombinationen av hela-Mount immunolabeling, optisk clearing, och avancerad ljusmikroskopi kommer att bidra till att främja förståelsen av cellulära funktion i hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
T. S. stöds av bidrag från den tyska forskningsstiftelsen DFG (332853055), Else kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), och den medicinska fakulteten vid RWTH Aachen (RWTH Returner program). V. G. P. stöds av forskningsstipendier från Deutsche Gesellschaft Fur Nelogie, Alexander von Humboldt Foundation, och nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien. D. H. E stöds av Fondation LeDucq. R. K. stöds av bidrag från DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), staten Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) och tvärvetenskapliga centrum för klinisk forskning vid RWTH Aachen University (O3-11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
References
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
