Summary
L'activité altérée de nucléase a été associée à différentes conditions humaines, sous-jacenteà son potentiel en tant que biomarqueur. La méthodologie modulaire et facile à mettre en œuvre de criblage présentée dans ce document permet la sélection des sondes spécifiques d'acide nucléique pour exploiter l'activité de nucléane comme biomarqueur de la maladie.
Abstract
Les nucléases sont une classe d'enzymes qui décomposent les acides nucléiques en catalysant l'hydrolyse des liaisons phosphodiester qui relient les sucres ribose. Les nucléases présentent une variété de rôles physiologiques vitaux dans les organismes procaryotes et eucaryotes, allant du maintien de la stabilité du génome à la protection contre les agents pathogènes. L'activité modifiée de nucléase a été associée à plusieurs conditions pathologiques comprenant des infections bactériennes et le cancer. À cette fin, l'activité de nucléane a montré un grand potentiel d'exploitation comme biomarqueur spécifique. Cependant, une méthode de dépistage robuste et reproductible basée sur cette activité demeure hautement souhaitable.
Ici, nous introduisons une méthode qui permet le criblage pour l'activité de nucléane utilisant des sondes d'acide nucléique comme substrats, avec la portée de différencier entre les conditions pathologiques et saines. Cette méthode offre la possibilité de concevoir de nouvelles bibliothèques de sondes, avec une spécificité croissante, d'une manière itérative. Ainsi, plusieurs séries de criblage sont nécessaires pour affiner la conception des sondes avec des caractéristiques améliorées, en profitant de la disponibilité d'acides nucléiques chimiquement modifiés. Le potentiel considérable de la technologie proposée réside dans sa flexibilité, sa haute reproductibilité et sa polyvalence pour le dépistage de l'activité nucléase associée aux maladies. On s'attend à ce que cette technologie permette le développement d'outils diagnostiques prometteurs avec un grand potentiel dans la clinique.
Introduction
Les nucléases sont une classe d'enzymes capables de ciquer les liaisons phosphodiester qui forment la structure dorsale des molécules d'acide nucléique. La grande diversité des nucléases rend leur classification assez difficile. Cependant, certains critères communs sont utilisés pour décrire les nucléases, comme la préférence pour le substrat (acide désoxyribonucléique (ADN) ou acide ribonucléique (ARN), le site de clivage (endonucleases ou exonuclées), ou la dépendance aux ions métalliques, entre autres1. Les nucléases sont des enzymes catalytiques hautement conservées qui ont des rôles fondamentaux dans les organismes procaryotes et eucaryotes et ont été utilisées, et continuent d'être utilisées, comme outils d'édition de gènes2. Ils sont également des acteurs fondamentaux dans l'entretien et la réplication de l'ADN, aidant à maintenir la stabilité du génome et participant aux processus de relecture3. Chez les bactéries, par exemple, les nucléases ont été identifiées comme des facteurs de virulence importants, capables de promouvoir la survie bactérienne en réduisant l'efficacité du système immunitaire de l'hôte4,5,6,7 ,8. Chez les mammifères, on a suggéré que les nucléases soient impliquées dans l'apoptose9, la biogenèse et l'entretien mitochondriaux10 et la médiation des réponses immunitaires innées antibactériennes et antivirales11. Comme on pouvait s'y attendre, des altérations de l'activité nucléane, qu'elles soient améliorées ou en l'absence, ont été impliquées dans un large éventail de maladies humaines. Ces maladies vont d'une grande variété de cancers12,13 à l'hypertrophie cardiaque10 ou les maladies auto-immunes14. Par conséquent, les nucléases sont devenues des candidats intéressants comme biomarqueurs pour un groupe hétérogène de conditions humaines. En fait, les nucléases ont déjà démontré leur potentiel en tant qu'outils de diagnostic efficaces pour la détection des infections causées par des agents bactériens spécifiques, tels que Staphylococcus aureus ou Escherichia coli15, 16. Dans beaucoup de types de cancer, l'expression de la protéine de domaine de nucléase staphylococcique-contenante 1 (SND1) ribonuclease est indicative du pronostic pauvre17. Dans les patients de cancer pancréatique, les niveaux élevés de sérum de ribonuclease I (RNase I) ont été rapportés18 et ont proposé d'être associés aux phénotypes cancéreux de cellules19. Dans les affections cardiaques ischémiques, telles que l'infarctus du myocarde ou l'angine de poitrine instable, les niveaux de sérum de désoxyribonuclease I (DNase I) se sont avérés être un marqueur diagnostique valide20,21.
On a émis l'hypothèse que le plan global de l'activité nucléase peut être différent dans les états sains et les états de maladie. En fait, des rapports récents ont utilisé des différences dans l'activité nucléase pour distinguer entre les phénotypes sains et cancéreux22 ou pour identifier les infections bactériennes pathogènes d'une manière spécifique à l'espèce15,23. Ces résultats ont ouvert une nouvelle voie pour l'utilisation des nucléases comme biomarqueurs de la maladie. Par conséquent, il est nécessaire de mettre au point une méthode de dépistage complète capable d'identifier systématiquement les différences associées à la maladie dans l'activité nucléase, qui peuvent être d'une importance capitale dans le développement de nouveaux outils de diagnostic.
Dans ce cas, nous introduisons et décrivons une nouvelle approche de dépistage in vitro (figure 1) pour identifier les sondes sensibles et spécifiques capables de discriminer entre l'activité nucléase en bonne santé et malsaine, ou l'activité spécifique à un type de cellule ou de bactéries. Profitant de la modularité des acides nucléiques, nous avons conçu une première bibliothèque de sondes oligonucléotides fluorescentes étanchées composées d'un ensemble complet de différentes séquences et chimies, les deux étant des paramètres importants pour la conception de la bibliothèque. Ces sondes d'oligonucléotide sont flanquées d'un fluorophore (fluorescein amidite, FAM) et d'un quencher (tide quencher 2, TQ2) aux 5' et 3' extrémités respectivement (tableau 1). En utilisant cet air fluorométrique basé sur le transfert d'énergie par résonance fluorescente (FRET) pour mesurer la cinétique de la dégradation enzymatique, nous avons pu identifier les sondes candidates ayant le potentiel de discriminer les modèles différentiels d'activité nucléane associés à des états sains ou malades. Nous avons conçu un processus itératif, dans lequel de nouvelles bibliothèques sont créées sur la base des meilleures sondes candidates, qui permet d'identifier des sondes candidates toujours plus spécifiques dans les étapes de dépistage ultérieures. De plus, cette approche tire parti de la nature catalytique des nucléases pour augmenter la sensibilité. Ceci est réalisé en tirant parti de la nature activatable des sondes de reporter et de la capacité des nucléases à traiter continuellement des molécules de substrat, représentant tous deux des avantages clés par rapport aux anticorps alternatifs ou aux méthodes de criblage à base de petites molécules.
Cette approche offre un outil de dépistage hautement modulaire, flexible et facile à mettre en œuvre pour l'identification de sondes d'acide nucléique spécifiques capables de discriminer entre les états sains et les états pathiques, et une excellente plate-forme pour le développement de nouveaux diagnostics qui peuvent être adaptés pour de futures applications cliniques. En tant que tel, cette approche a été utilisée pour identifier l'activité de nucléane dérivée de Salmonella Typhimurium (ci-dessus appelé Salmonella) pour l'identification spécifique de cette bactérie. Dans le protocole suivant, nous rendons compte d'une méthode pour dépister l'activité bactérienne de nucléase utilisant l'analyse cinétique.
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Protocol
1. Conception et préparation de la bibliothèque Oligonucleotide
- Conception de bibliothèque
- Sur la base des critères suivants, une bibliothèque de sondes d'oligonucléotides fluorescents étanchéités de 8 à 12 mers de long afin d'éviter la formation de structures secondaires, avec une longueur égale pour toutes les sondes.
- Inclure au moins un ADN et une séquence aléatoire d'ARN contenant une combinaison d'adénine (A), de guanine (G), de cytosine (C) et de thymine (T)/uracil (U)(sondes d'ADN et d'ARN dansle tableau 1 ).
REMARQUE : Les séquences d'ADN et d'ARN décrites dans le tableau 1 ont été utiles comme substrats initiaux pour classer un type inconnu d'activité nucléase, soit DNase ou RNase. Ces deux séquences sont recommandées comme point de départ pour tout dépistage, car elles ont montré une grande capacité à détecter les profils d'activité nucléane dans les bactéries et les échantillons de tissus. Si l'activité de nucléase n'est pas observée avec ces séquences d'ADN et d'ARN, la conception des oligonucléotides supplémentaires est nécessaire. - Inclure des séquences de polynucléotides composées d'un seul type de nucléotide pour déterminer la dépendance à la séquence pour une activité de nucléane donnée (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, ADN-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C et RNA-Poly G dans le tableau 1).
- En utilisant la même séquence de résidus de nucléotides que les séquences initiales d'ADN et d'ARN, incluez des séquences qui contiennent des analogues nucléosides hébergeant des modifications chimiques à la position de 2'-du sucre de ribose, tels que 2'-Fluoro et 2'-O-Methyl, comme une étape rigoureuse pour augmenter la sélectivité des nucléases.
- Inclure des séquences entièrement modifiées composées entièrement d'analogues nucléosides de 2'-Fluoro ou d'analogues nucléosides 2'-O-Methyl (All 2'-F et All 2'-OMe, Tableau 1)
- Inclure des séquences chimériques composées de purines naturelles non modifiées et d'analogues nucléosides de 2'-Fluoro pyrimidine (RNA Pyr-2'F, tableau 1).
- Inclure des séquences chimériques composées de purines naturelles non modifiées et d'analogues nucléodés de pyrimidine 2'-O-Methyl (RNA Pyr-2'OMe, tableau 1).
- Inclure des séquences chimériques composées de pyrimidines naturelles non modifiées et d'analogues nucléodés purines de 2'-Fluoro (ARN Pur-2'F, tableau 1).
- Inclure des séquences chimériques composées de pyrimidines naturelles non modifiées et d'analogues nucléonus purines 2'-O-Methyl (RNA Pur-2'OMe, tableau 1).
- Inclure au moins un ADN et une séquence aléatoire d'ARN contenant une combinaison d'adénine (A), de guanine (G), de cytosine (C) et de thymine (T)/uracil (U)(sondes d'ADN et d'ARN dansle tableau 1 ).
- Sur la base des critères suivants, une bibliothèque de sondes d'oligonucléotides fluorescents étanchéités de 8 à 12 mers de long afin d'éviter la formation de structures secondaires, avec une longueur égale pour toutes les sondes.
- Préparation et stockage de la sonde Oligonucleotide
REMARQUE : Les oligonucléotides sont synthétisés par la méthode de la phosphoramidite. Après synthèse, les oligonucléotides sont purifiés à l'aide d'une chromatographie liquide de haute performance (HPLC) et la masse est mesurée par spectrométrie de masse.- Faites tourner les sondes oligonucléotides lyophilisées à l'aide d'une centrifugeuse et diluez-les dans le tampon Tris-EDTA (TE) pour prévenir la dégradation de la nucléase. Déterminer le volume de dilution en fonction du rendement de chaque sonde pour rendre une solution de stock avec une concentration de 500 pmol/L.
- Conserver les oligonucléotides lyophilisés à 4 oC ou à température ambiante à court terme. Pour le stockage à long terme (de plusieurs mois à des années), entreposez les oligonucléotides lyophilisés à -20 oC. Après la résuspension des oligonucléotides lyophilisés en TE, entreposez les solutions de stock à -20 oC ou, de préférence, à -80 oC.
2. Culture bactérienne
- Prenez une perle de verre poreuse du flacon de stockage cryogénique dans des conditions stériles.
- Pour isoler les colonies bactériennes individuelles (Salmonella et E. coli), utilisez la méthode du quadrant24 en stries/rouler la perle directement sur un plat Petri contenant Tryptic Soy Agar (TSA) moyen complété par des moutons défigétés sang.
- Incuber la culture à 37 oC pendant 24 h.
3. Préparation de supernatant
- Transférer une seule colonie de milieux solides à 50 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) et couver à 37 oC pendant 24 h à 200 tr/min.
- Diluer la culture (1:500) dans le BST (sous-culture) et incuber à 37 oC pendant 24 h à 200 tr/min dans un incubateur secouant.
REMARQUE : On s'attend à ce qu'après 24 heures d'incubation les cultures bactériennes soient en phase stationnaire atteignant des valeurs supérieures à 109 CFU/mL. - Après la période d'incubation, transférer les cultures vers des tubes stériles plafonnés et une centrifugeuse à 4 500 x g pendant 30 min.
- Recueillir le supernatant et l'utiliser immédiatement. Vous pouvez également conserver les supernatants à 4 oC ou à -20 oC.
4. Etoiles d'activité nucléane
- Préparation de solutions de travail
- Préparer une solution de travail de 20 l pour chaque sonde dans des tubes microcentrifugesans nucléases de 1,5 ml en diluant (1:10 ratio) la solution de stock (500 pmol/L) pour une concentration de travail finale de 50 pmol/L. À cette fin, mélanger 18 l de phosphate tampon saline (PBS) contenant MgCl2 et CaCl2 avec 2 'L de solution de stock de sonde.
REMARQUE: Soyez conscient que dans la solution de travail, les oligonucléotides sont plus vulnérables à la dégradation des nucléasses, par conséquent, il est recommandé de préparer les solutions de travail juste avant de mettre en place la réaction. - Évitez le contact direct avec la lumière pendant la préparation et gardez-le dans l'obscurité (enveloppé dans du papier d'aluminium), lorsqu'il s'agit de fluorophores.
- Préparer une solution de travail de 20 l pour chaque sonde dans des tubes microcentrifugesans nucléases de 1,5 ml en diluant (1:10 ratio) la solution de stock (500 pmol/L) pour une concentration de travail finale de 50 pmol/L. À cette fin, mélanger 18 l de phosphate tampon saline (PBS) contenant MgCl2 et CaCl2 avec 2 'L de solution de stock de sonde.
- Réaction mise en place
- Préchauffer le fluoromètre (p. ex. Cytation 1) à 37 oC.
- Préparer un ensemble (un tube/sonde) de tubes microcentrifuge sans nucléarité de 1,5 ml pour chaque échantillon (TSB, E. coli et Salmonella)et étiqueter en conséquence.
- Ajouter délicatement 96 L de supports culturels stériles du BST, Salmonella supernatant ou E. coli supernatant (à partir de l'étape 3.4.). Par la suite, ajoutez en conséquence une solution de travail de 4 l/tube de sonde. Effectuez cette étape à température ambiante.
REMARQUE : 10 sondes ont été utilisées pour le premier tour du criblage et 6 sondes pour le deuxième tour. - Bien mélanger en pipetting de haut en bas pour obtenir une solution homogène. Évitez d'introduire des bulles d'air dans les échantillons tout en mélangeant.
- Chargez 95 L de chaque solution (sonde et supernatant ou média culturel) dans un puits séparé d'un fond noir, non traité 96 plaque de puits. Minimisez la formation de bulles dans les puits lors du chargement en distribuant soigneusement avec la pointe près de la paroi du puits.
- Couvrir la plaque avec son couvercle. Inspectez visuellement le couvercle et vérifiez s'il y a des marques de stylo ou une accumulation de particules de poussière qui peuvent introduire des artefacts de mesure. Remplacez le couvercle pour un nouveau si c'est le cas.
- Mesure mise en place
- Ouvrez le logiciel d'acquisition (Gen5 3.05) en cliquant sur l'icône de raccourci logiciel (Figure S1A).
- Sélectionnez Lire maintenant à partir de la fenêtre du gestionnaire de tâches et choisissez Nouveau... pour créer le protocole de mesure cinétique (Figure S1B).
- Cliquez sur La température définie dans la fenêtre de dialogue intitulée Procédure et sélectionnez 37 oC. Confirmer et enregistrer les paramètres en appuyant sur OK (Figure S1C).
- Cliquez sur Démarrer Kinetics dans la fenêtre de dialogue intitulé Procédure. Ensuite, dans la fenêtre de dialogue pop-up, intitulé Étape cinétique, sélectionnez 2 h dans la boîte d'entrée Run Time et 2 min dans la boîte d'entrée Interval. Confirmer et enregistrer les paramètres en appuyant sur OK (Figure S1D).
- Cliquez sur Lire dans la fenêtre de dialogue intitulée Procédure. Ensuite, dans la fenêtre de dialogue pop-up, intitulé Lire la méthode, sélectionnez l'intensité de fluorescence comme méthode de détection, Endpoint / Kinetic comme un type de lecture et filtres comme type optique. Confirmer et enregistrer les paramètres en appuyant sur OK (Figure S1E).
- Dans la fenêtre de dialogue pop-up intitulée Read Step (Kinetic), sélectionnez Vert à partir de l'ensemble de filtre. Confirmer et enregistrer les paramètres en appuyant sur OK (Figure S2A).
- Dans la fenêtre de dialogue intitulée Procédure, sélectionnez utiliser le couvercle et cliquez sur valider pour s'assurer que le protocole créé est valide. Ceci est confirmé par une fenêtre de dialogue pop-up (Figure S2B).
- Sélectionnez le protocole dans la barre de menu et choisissez la procédure (Figure S2C).
- Dans la fenêtre de dialogue intitulée Procédure, définir les puits à mesurer (Figure S2D).
- Entrez le nom de l'expérience dans la boîte d'entrée de nom de fichier (Figure S2E).
- Chargez la plaque avec son couvercle dans le lecteur de plaque. Assurez-vous que la plaque est dans la bonne orientation.
- Démarrer l'acquisition en cliquant sur lire le nouveau bouton dans la barre d'outils ( FigureS2F).
- Analyse des données
- Cliquez sur l'un des puits mesurés dans la fenêtre de dialogue intitulée Plaque 1 (Figure S3A).
- Cliquez sur sélectionner les puits et inclure tous les puits mesurés dans la fenêtre de dialogue de sélection de puits. Confirmer et enregistrer les paramètres en appuyant sur OK. (Figure S3B).
- Sélectionnez les données dans la fenêtre de dialogue intitulée Plate 1 pour visualiser les résultats tabulés (Figure S3C).
- Exporter les données vers une feuille de calcul en sélectionnant l'exportation rapide à partir du menu contextuel (Figure S3C).
- Dans la feuille de calcul, étiquetez les colonnes de données en conséquence pour chaque échantillon et sonde.
- Générer des graphiques cinétiques, en utilisant la ligne avec le style des marqueurs, en traçant les unités de fluorescence relative (RFU) par rapport au temps (x-axe: chronologie de la réaction et y-axe: RFU).
REMARQUE : La description de la génération d'un graphique s'applique à l'utilisation de programmes de feuilles de calcul (p. ex., Excel). Cependant, tous les autres programmes peuvent être utilisés pour générer des graphiques à partir des données brutes obtenues, en traçant RFU par rapport au temps. - Calculer le taux de la réaction enzymatique pour chaque intervalle mesuré
selon la formule suivante25: taux , où Si est RFU au point de temps d'intervalle maximal et Ii est RFU au point de temps d'intervalle minimal, et Tf et Ti sont les points de temps d'intervalle maximum et minimal, respectivement. - Sélectionnez le taux avec la valeur la plus élevée (Rmax) pour chaque courbe. S'il y a plus d'un Rmax par échantillon, sélectionnez celui qui se produit au premier point de mesure.
- Calculer le rapport entre Rmax et la valeur moyenne de l'intervalle de temps auquel se produit Rmax : coefficient de taux
- Calculer la différence de pli (FD) entre le coefficient de taux de Salmonella et E. coli pour chaque sonde.
- Considérez une valeur de différence de pli supérieure à 3 comme significative.
- Considérez les sondes significatives avec les valeurs de différence de pli (FD) les plus élevées comme sondes de candidat et comme base pour la conception de bibliothèque dans la prochaine ronde de sélection.
selon la formule suivante25: taux , où Si est RFU au point de temps d'intervalle maximal et Ii est RFU au point de temps d'intervalle minimal, et Tf et Ti sont les points de temps d'intervalle maximum et minimal, respectivement.
5. Critères de sélection des rondes de dépistage (figure 1)
- Première série de projections
- Effectuer l'analyse d'activité nucléane (tel que décrit dans la section 4) à l'aide de sondes d'ADN, d'ARN et de polynucléotide.
- Évaluer la préférence pour la chimie de l'ADN ou la chimie de l'ARN en comparant le nombre et la performance (valeur FD) des sondes candidates à l'ADN et à l'ARN.
- Sélectionnez le type de chimie de l'acide nucléique qui rend le plus grand nombre de sondes candidates, comme l'illustre la figure 1.
- Deuxième série de dépistage
- Effectuer l'évaluation de l'activité nucléane (comme décrit à la section 4) à l'aide de sondes entièrement modifiées et de sondes chimériques conçues à partir du substrat d'acide nucléique sélectionné lors de la première ronde de dépistage.
- Évaluer la préférence pour les séquences contenant 2'-Fluoro et 2'-O-Methyl nucléoside analogues en comparant les résultats obtenus pour 2'-Fluoro et 2'-O-Methyl sondes candidat modifiés.
- Sélectionnez le type de modification analogique nucléoside qui rend le plus grand nombre de sondes candidates, comme l'illustre la figure 1.
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Representative Results
La figure 1 montre le flux de travail de cette méthodologie, qui est divisée en deux cycles de sélection. Dans la première série de dépistage, nous avons utilisé 5 sondes d'ADN (ADN, ADN Poly A, ADN Poly T, ADN Poly C et ADN Poly G) et aussi 5 sondes d'ARN (ARN, ARN Poly A, ARN Poly U RNA Poly C et RNA Poly G). Les données brutes de cette ronde de dépistage se trouvent dans le tableau supplémentaire 1. Au deuxième tour, les sondes modifiées chimiquement ont été synthétisées en remplaçant la séquence d'ARN par des nucléosides chimiquement modifiés (Tous les 2'-Fluoro et All 2'-OMethyl) ou par la combinaison de l'ARN et des purines ou des pyrimidines chimiquement modifiés (ARN Pyr-2'F, ARN Pyr-2'OMe, RNA Pur-2'F et RNA Pur-2'OMe). Les données brutes de cette ronde de dépistage se trouvent dans le tableau supplémentaire 2. Une description détaillée des séquences se trouve dans le tableau 1. Les résultats obtenus lors de la première ronde de dépistage sont présentés à la figure 2, où les supernatants de la culture Salmonella signalent une nette préférence pour les sondes d'ARN par rapport aux sondes d'ADN. En revanche, les contrôles de E. coli et des médias de culture montrent une capacité très limitée de dégrader les sondes d'ARN. De plus, nous avons calculé la différence de pli (DF) entre les coefficients de taux de Salmonella et d'E. coli (tableau supplémentaire 3 et tableau supplémentaire 4) afin d'identifier les sondes les plus performantes. Les calculs ont été effectués comme décrit dans la section du protocole.
Ces résultats suggèrent la présence d'un type d'activité RNase dérivé de Salmonella. Sur la base de l'identification de l'ARN comme le type d'acide nucléique préféré pour les nucléases Salmonella, nous avons conçu une nouvelle bibliothèque utilisant des nucléotides chimiquement modifiés à utiliser dans la deuxième série de dépistage visant à accroître la spécificité de la Sondes. La figure 3 montre les profils cinétiques des sondes contenant des nucléotides chimiquement modifiés. Fait intéressant, l'ARN Pyr-2'OMe et l'ARN Pur-2'OMe montrent le comportement cinétique le plus performant par rapport à l'ARN Pyr-2'F et l'ARN Pur-2'F, respectivement.
Ces résultats suggèrent que Salmonella a une activité importante de RNase qui peut être employée pour sélectionner des sondes capables de reconnaître spécifiquement cette bactérie. En outre, nous avons observé que les nucléosides chimiquement modifiés 2'-OMe sont plus appropriés pour le type de RNAs sécrétés par Salmonella. Dans cet esprit, le protocole décrit dans cette contribution offre la possibilité d'explorer l'utilisation de l'activité nucléase comme biomarqueur.
Figure 1: Cultures de bactéries et flux de travail du processus de dépistage. Préparation des cultures de bactéries et des supernatants (à gauche). Description du flux de travail pour les deux tours de dépistage. Premier dépistage : La préférence pour l'ADN ou l'ARN est évaluée à l'aide de 10 sondes. Deuxième dépistage : Selon la préférence en matière d'acide nucléique, des sondes supplémentaires contenant des nucléotides modifiés chimiquement sont évaluées afin d'identifier les substrats les plus performants pour une activité de nucléane donnée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Premier tour dedépistage cinétique. Profils cinétiques de Salmonella, E. coli et des médias culturels (TSB) à l'aide de sondes d'ADN et d'ARN. L'activité nucléane est représentée par des unités de fluorescence relatives (RFU). Les graphiques sont représentatifs d'au moins 3 expériences effectuées individuellement. Les différents échantillons sont étiquetés comme indiqué dans la légende du graphique. Les valeurs de la différence de pli (DF) ont été calculées à l'aide des coefficients de taux de Salmonella et d'E. coli pour chaque sonde. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Deuxième tour dedépistage cinétique. Profils cinétiques de Salmonella, E. coli et des médias culturels (TSB) à l'aide de sondes modifiées chimiquement. L'activité nucléane est représentée par des unités de fluorescence relatives (RFU). Les graphiques sont représentatifs d'au moins 3 expériences effectuées individuellement. Les différents échantillons sont étiquetés comme indiqué dans la légende du graphique. Les valeurs de la différence de pli (DF) ont été calculées à l'aide des coefficients de taux de Salmonella et d'E. coli pour chaque sonde. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau 1 : Séquences de sondes d'acide nucléique. Liste de toutes les sondes d'acide nucléique utilisées dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Mesure mise en place. Boutons clics et fenêtres de dialogue décrivant le processus stepwise effectué dans le logiciel d'acquisition pour configurer les différents paramètres de mesure. (A) Icône de bureau. (B) Fenêtre de dialogue du gestionnaire de tâche. (C) Procédure et température Configurer les fenêtres de dialogue. (D) Procédures et fenêtres de dialogue De l'étape cinétique. (E) Procédures et lire Les fenêtres de dialogue de la méthode. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 2 : Mesure mise en place. Boutons clics et fenêtres de dialogue décrivant le processus stepwise effectué dans le logiciel d'acquisition pour configurer les différents paramètres de mesure. (A) Procédure et lecture étape (kinetique) fenêtres de dialogue. (B) Fenêtre de dialogue de procédure (C) barre de menu "Protocole". (D) Fenêtre de dialogue de sélection de puits. (E) Boîte d'entrée de nom de fichier. (F) Exécuter Nouvelle icône utilisée pour démarrer l'acquisition dans le logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 3 : Analyse des données. Boutons clics et fenêtres de dialogue décrivant le processus stepwise effectué dans le logiciel d'acquisition pour exporter les données acquises dans une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie. (A) Fenêtre de dialogue Plate Matrix. (B) Plate et Puits Selection fenêtres de dialogue. (C) Fenêtre de dialogue de plaque et menu contexte D'exportation rapide. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 4 : Troisième tour de dépistage (optimisation des préférences de séquence). Description des différentes étapes d'une ronde de dépistage supplémentaire visant à évaluer les variations de séquence. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 5 : Quatrième ronde de sélection (ronde d'évaluation de la spécificité). Description des différentes étapes d'une ronde de dépistage supplémentaire visant à accroître la spécificité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 6 : Cinquième tour de dépistage (optimisation des paramètres de réaction). Description des différentes étapes d'une ronde de dépistage supplémentaire visant à réduire la réactivité croisée non ciblée en modulant l'activité de nucléase. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau supplémentaire 1 : Données brutes du premier tour de sélection. Pour chaque sonde (étiquetée en rouge, en plus), le temps d'acquisition et les valeurs de fluorescence brute ont été signalés pour le BST, E. coli et Salmonella, ainsi que la valeur tarifaire calculée pour chaque intervalle. Les calculs ont été effectués comme décrit dans la section des méthodes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 2 : Données brutes de la deuxième ronde de sélection. Pour chaque sonde (étiquetée en rouge, en plus), le temps d'acquisition et les valeurs de fluorescence brute ont été signalés pour le BST, E. coli et Salmonella, ainsi que la valeur tarifaire calculée pour chaque intervalle. Les calculs ont été effectués comme décrit dans la section des méthodes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 3 : Analyse des données pour la première ronde de sélection. Pour chaque sonde (étiquetée en rouge, en haut), les valeurs suivantes ont été obtenues pour le BST, E. coli et Salmonella: valeurs maximales de taux, points de temps d'intervalle minimes et maximaux, coefficient de taux, valeurs de différence de pliage entre Salmonella et E. coli par rapport au BST et plier les valeurs de différence entre Salmonella et E. coli (surlignés en jaune). Les calculs ont été effectués tels que décrits dans la section des méthodes et les formules de calcul et les calculs étape par étape sont indiqués dans la feuille de calcul. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 4 : Analyse des données pour la deuxième ronde de sélection. Pour chaque sonde (étiquetée en rouge, en haut), les valeurs suivantes ont été obtenues pour le BST, E. coli et Salmonella: valeurs maximales de taux, points de temps d'intervalle minimes et maximaux, coefficient de taux, valeurs de différence de pliage entre Salmonella et E. coli par rapport au BST et plier les valeurs de différence entre Salmonella et E. coli (surlignés en jaune). Les calculs ont été effectués tels que décrits dans la section des méthodes et les formules de calcul et les calculs étape par étape sont indiqués dans la feuille de calcul. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Des modifications de l'activité nucléase ont été associées à une grande variété de phénotypes de la maladie, y compris différents types de cancer et d'infections bactériennes. Ces modifications sont proposées pour être l'agent causal d'une condition14, tandis que dans d'autres cas, elles sont la conséquence d'un événement physiologique préjudiciable20 ou agent pathogène16,26. Comme on pouvait s'y attendre, les tentatives d'utiliser les nucléases et l'activité nucléase comme biomarqueur diagnostique ont été décrites15,22,23,26, avec une promesse considérable. Par conséquent, l'établissement d'une approche de dépistage robuste et reproductible pour l'évaluation systématique de l'activité nucléase dans la maladie et pour l'identification d'un journaliste spécifique et sensible semble pertinent. Pour répondre à cette nécessité, nous avons développé une plate-forme de dépistage robuste, modulaire et facile à mettre en œuvre basée sur un test de fluorescence, qui permet la découverte de nouveaux biomarqueurs de maladies et l'identification de sondes sensibles et spécifiques d'acide nucléique dans parallèle, en utilisant l'action catalytique des nucléases.
De puissants outils de criblage tels que le dépistage à haut débit par petites molécules (HTS)27, l'évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX)28 ou l'affichage de phage29 ont été précédemment rapportés, qui permettent le identification de molécules de reconnaissance à forte affinité (p. ex. petites molécules, aptamères ou peptides liants). En comparaison, l'approche de dépistage présentée ici permet de sélectionner des sondes qui peuvent identifier l'activité de nucléase connue et inconnue. De plus, cette approche est compatible avec les modèles de dépistage in vitro, ex vivo et in vivo. En outre, la nature réactive des nucléases confère un avantage évident par rapport aux approches susmentionnées, en ce que l'interaction sonde-nucléase n'est pas un processus statique, mais un processus dynamique. Cela signifie que l'activité des nucléases devient un module intrinsèque d'amplification du signal pour les sondes de reporter puisque plusieurs sondes de reporter peuvent interagir avec une seule nucléase.
Comme dans toute autre méthode de dépistage, la génération et la gestion de la bibliothèque initiale sont essentielles. La nature des sondes d'acide nucléique offre une grande flexibilité dans la conception et la création d'une bibliothèque et permet l'introduction de divers degrés de complexité en fonction de l'application de dépistage. La complexité de la bibliothèque peut être introduite à différents niveaux, y compris les motifs de séquence, la chimie des nucléotides, la chimie de l'épine dorsale du phosphate et la longueur de l'oligonucléotide. La modulation de la complexité de la bibliothèque permet d'identifier les sondes, non seulement pour leur capacité à identifier avec succès l'activité nucléase associée à la maladie, mais aussi pour les propriétés compatibles avec les applications in vivo ultérieures. En outre, une bibliothèque de base d'acide nucléique offre plusieurs avantages par rapport à ses homologues d'anticorps ou de peptides. D'une part, la production d'anticorps est bien connue pour être lourde, nécessitant des animaux ou des systèmes complexes de culture eucaryotique, qui augmentent le coût et introduisent la variabilité des lots30,31. En outre, le poids moléculaire élevé et l'immunogénicité limitent leur application28,32. D'autre part, la génération de bibliothèques de peptides biologiques nécessite généralement des systèmes d'expression virale ou bactérienne29,30, ce qui augmente la complexité du processus de dépistage. Les bibliothèques de peptides chimiques évitent ce problème, au détriment de l'utilisation de systèmes à base de perles alambiqués ou de multiples cycles de synthèse de peptides coûteux33. Tous ces problèmes sont contournés à l'aide d'une bibliothèque d'acide nucléique. Une fois la bibliothèque initiale établie, les méthodes de dépistage sont rapides et simples. La méthode décrite ci-dessus sert de plate-forme pour des rondes de dépistage supplémentaires, telles que l'optimisation des séquences (figure supplémentaire 4), l'évaluation de la spécificité ( figure supplémentaire5) ou l'optimisation des éléments modulatoires de l'activité nuclease, comme les cofacteurs métalliques (cations typiquement divalentes) et les chélateurs, qui sont très utiles pour augmenter la spécificité des sondes sélectionnées (Figure supplémentaire 6).
L'analyse fluorométrique cinétique utilisée dans cette étude peut être optimisée pour les cultures bactériennes et cellulaires, le dépistage étant effectué dans des plaques de microtiter conviviales. Dans le cas des essais cellulaires, ce protocole est compatible avec les cultures de suspension et de monocouche, qui, après l'optimisation, peuvent être utilisées selon les nécessités du modèle in vitro étudié. Nous avons identifié plusieurs étapes critiques qui nécessitent une optimisation avant le dépistage. Il s'agit notamment du nombre cellulaire ou de la densité bactérienne à mettre en fonction, de la concentration de sonde, des paramètres de gain de détecteur de fluoromètre ou de la mise en œuvre de méthodes intégrées de correction de fond. Une limitation de cette technologie est la nécessité d'une activité de nucléase altérée associée à l'état pathologique d'intérêt. Sans cette caractéristique, l'approche de présélection pour la sélection des sondes des candidats n'est pas réalisable. Une autre limitation est la capacité d'auto-désétrage des guanines quand ils sont à proximité du fluorophore. Cette caractéristique doit être prise en considération lors de la conception de la bibliothèque.
La nature enzymatique de la réaction mesurée rend nécessaire de considérer les temps de chargement des plaques. La réduction des temps de chargement réduira les différences de fond entre les différentes conditions expérimentales. Plusieurs options existent pour surmonter ce problème, comme ralentir la réaction enzymatique pendant le chargement en utilisant des réactifs à froid, ou en utilisant des systèmes de chargement automatisés, bien que ce dernier augmente considérablement les coûts, mais aussi le débit. En outre, les mesures cinétiques sont une grande amélioration par rapport aux mesures statiques, fournissant une image complète et plus réaliste de la dynamique de l'activité catalytique des nucléasses.
En résumé, notre protocole offre une méthode de dépistage polyvalente, robuste et reproductible pour l'identification des sondes sensibles et spécifiques d'acide nucléique pour la détection de l'activité nucléane associée à la maladie, qui surmonte les obstacles majeurs de méthodes de dépistage alternatives. Nous prévoyons que cette technologie de dépistage permettra le développement de nouveaux outils de diagnostic dans une multitude de conditions, avec une traduisibilité facile à la clinique.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier Luiza I. Hernandez (Université de Link-ping) pour sa révision minutieuse du manuscrit et ses précieux conseils. Ce travail a été soutenu par la Fondation Knut et Alice Wallenberg et le Swedish Government Strategic Research Area in Materials Science on Advanced Functional Materials de l'Université Link-ping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU no 2009-00971).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
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