Summary
وقد ارتبط النشاط النيوداز المتغيرة مع الظروف البشرية المختلفة ، الكامنة وراء إمكاناتها باعتبارها البيولوجية. تسمح منهجيه الفحص النموذجية وسهله التنفيذ المعروضة في هذه الورقة باختيار مجسات محدده من الأحماض النووية لتسخير نشاط النيوداز كمؤشر حيوي للمرض.
Abstract
Nucleases هي فئة من الانزيمات التي تكسر الأحماض النووية عن طريق تحفيز التحلل المائي من السندات الفوسفاوديستر التي تربط السكريات الريبوز. عرض nucleases مجموعه متنوعة من الأدوار الفسيولوجية الحيوية في الكائنات البدائية النواة والنواة الحقيقية ، بدءا من الحفاظ علي استقرار الجينوم لتوفير الحماية ضد مسببات الامراض. وقد ارتبط النشاط النيوداز المتغيرة مع العديد من الحالات المرضية بما في ذلك العدوى البكتيرية والسرطان. وتحقيقا لهذه الغاية ، اظهر نشاط النيوداز امكانيه كبيره للاستغلال باعتباره مؤشرا إحيائيا محددا. ومع ذلك ، فان طريقه الفرز القوية والقابلة للتكرار المستندة إلى هذا النشاط لا تزال مستصوبه للغاية.
هنا ، نقدم طريقه تمكن من فحص نشاط النيوداز باستخدام مجسات الحمض النووي كركائز ، مع نطاق التمييز بين الظروف المرضية والصحية. هذا الأسلوب يوفر امكانيه تصميم مكتبات التحقيق الجديدة ، مع زيادة الخصوصية ، بطريقه تكراريه. التالي ، فان جولات متعددة من الفحص ضرورية لصقل تصميم المجسات مع ميزات محسنه ، مع الاستفادة من توافر الأحماض النووية المعدلة كيميائيا. وتكمن الإمكانات الكبيرة للتكنولوجيا المقترحة في مرونتها واستنساخها العالية وبراعتها في فحص نشاط النيوداز المرتبط بظروف المرض. ومن المتوقع ان تسمح هذه التكنولوجيا تطوير أدوات التشخيص واعده مع إمكانات كبيره في العيادة.
Introduction
Nucleases هي فئة من الانزيمات القادرة علي المرابط السندات فوسفوديستر التي تشكل الهيكل الأساسي لجزيئات الحمض النووي. التنوع الشاسع لل نوكليسيس يجعل تصنيفها صعبه نوعا ما. ومع ذلك ، هناك بعض المعايير الشائعة المستخدمة لوصف النوكلينس ، مثل تفضيل الركيزة (حمض ديكسيريبونريك (DNA) أو حمض الريبونسيك (RNA)) ، موقع الانشقاق (الكريات النووية أو التبرئة) ، أو التبعية أيون المعادن ، من بين أمور أخرى1. Nucleases هي الانزيمات الحفازه المحفوظة للغاية التي لها ادوار أساسيه في كل من الكائنات الحية النواة والنواة وقد استخدمت ، والاستمرار في استخدامها ، وأداات تحرير الجينات2. وهي أيضا جات فاعله أساسيه في صيانة الحمض النووي وتكراره ، مما يساعد علي الحفاظ علي استقرار الجينوم والمشاركة في عمليات القراءة المضادة3. في البكتيريا ، علي سبيل المثال ، تم تحديد نوكليسيس كعوامل الضراوة الهامه ، قادره علي تعزيز بقاء البكتيريا عن طريق الحد من فعاليه الجهاز المناعي للمضيف4،5،6،7 ،8. في الثدييات, وقد اقترح نوكليسيس ان تكون متورطة في المبرمج9, التكوين الحيوي الميتوكوندريا والصيانة10 والوساطة من الاستجابات المناعية الفطرية المضادة للبكتيريا والمضادة للفيروسات11. وليس من المستغرب ان تكون التغيرات في نشاط النيواز ، سواء كانت تعزيزا أو نقصا ، متورطة في مجموعه واسعه من الامراض البشرية. وتتراوح هذه الامراض من مجموعه واسعه من السرطانات12,13 إلى تضخم القلب10 أو امراض المناعة الذاتية14. ولذلك ، أصبحت نوكليسيس المرشحين مثيره للاهتمام كما المؤشرات الحيوية لمجموعه غير متجانسة من الظروف البشرية. في الواقع, وقد أظهرت بالفعل نوكليسيس إمكاناتها كاداات تشخيصيه ناجحه للكشف عن الإصابات الناجمة عن عوامل بكتيرية محدده, مثل المكورات العنقودية الذهبية أو القولونية15, 16. في العديد من أنواع السرطان ، والتعبير عن مكورات النيوداز التي تحتوي علي المجال البروتين 1 (SND1) ريبونكليوداز يدل علي سوء التكهن17. في مرضي سرطان البنكرياس ، تم الإبلاغ عن مستويات المصل المرتفعة (RNase I)18 واقترح ان تكون مرتبطة بالأنماط الظاهرية للخلايا السرطانية19. في حالات القلب الدماغية ، مثل احتشاء العضلة القلبية أو الذبحة الصدرية غير المستقرة ، فقد ثبت ان مستويات مصل الدم (dnase i) لتكون علامة تشخيصيه صالحه20،21.
وقد تم الافتراض بان المخطط العالمي للنشاط النواسي قد يكون مختلفا في الدول الصحية والامراض. في الواقع ، استخدمت التقارير الاخيره الاختلافات في نشاط النيوداز للتمييز بين الأنماط الظاهرية الصحية والسرطانية22 أو للتعرف علي العدوى البكتيرية المسببة للامراض بطريقه محدده من النوع15،23. وقد فتحت هذه النتائج وسيله جديده لاستخدام الجزيئات الحيوية للمرض. ولذلك ، توجد ضرورة لوضع طريقه فرز شامله قادره علي التحديد المنهجي للاختلافات المرتبطة بالامراض في نشاط النيوداز ، والتي قد تكون ذات اهميه رئيسيه في تطوير أدوات تشخيصيه جديده.
هنا ، نقدم ونقدم وصفا لنهج الفحص الجديد في المختبر (الشكل 1) لتحديد المجسات الحساسة والمحددة القادرة علي التمييز بين نشاط النيوداز في صحة وغير صحية ، أو النشاط المحدد لنوع من الخلايا أو البكتيريا. الاستفادة من نمطيه الأحماض النووية ، قمنا بتصميم مكتبه أوليه من المجسات الفلورية التي تتكون من مجموعه شامله من المتواليات المختلفة والكيميائية ، وكلاهما معلم مهم لتصميم المكتبة. ويحيط بهذه المسبارات القليلة النواة فلوكوفيري (فلوريسئين اميسيت ، فأم) والمروي (المد والجزر 2 ، TQ2) في 5 ' و 3 ' ينتهي علي التوالي (الجدول 1). باستخدام هذا الرنين الفلوري نقل الطاقة (الحنق) علي أساس الفحص الفلوري لقياس حركيه التحلل الانزيمي ، تمكنا من تحديد التحقيقات المرشح مع امكانيه التمييز بين الأنماط التفاضلية للنشاط النيوداز المرتبطة بالدول الصحية أو المرض. قمنا بتصميم عمليه تكراريه ، حيث يتم إنشاء المكتبات الجديدة استنادا إلى أفضل التحقيقات المرشحة ، والتي تسمح بتحديد التحقيقات المرشحة الأكثر تحديدا في خطوات الفرز اللاحقة. وعلاوة علي ذلك ، فان هذا النهج يستفيد من الطبيعة الحفازه لل نوكليسيس لزيادة الحساسية. ويتحقق ذلك من خلال الاستفادة من طبيعة activatable من التحقيقات مراسل وقدره نوكليسيس لمعالجه جزيئات الركيزة باستمرار ، وكلاهما يمثل المزايا الرئيسية علي الأجسام المضادة البديلة أو الصغيرة المستندة إلى جزيء طرق الفرز.
ويوفر هذا النهج أداه فحص ذات وحدات عاليه ومرنه وسهله التنفيذ لتحديد المجسات الخاصة بالأحماض النووية القادرة علي التمييز بين الدول الصحية والامراض ، ومنصة ممتازة لتطوير أدوات التشخيص التي يمكن تكييفها للتطبيقات السريرية في المستقبل. وعلي هذا النحو ، استخدم هذا النهج لتحديد النشاط النيوداز المستمدة من السالمونيلا التيفوئيد (المشار اليها هنا باسم السالمونيلا) لتحديد محدد لهذه البكتيريا. في البروتوكول التالي ، نقوم بالإبلاغ عن طريقه لفحص نشاط النيوداز البكتيري باستخدام التحليل الحركي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تصميم المكتبات واعدادها
- تصميم المكتبة
- بناء علي المعايير التالية تصميم مكتبه من الفلورسنت الفلورية القليلة من المجسات بين 8 و 12-مير طويلة لتجنب تشكيل الهيكل الثانوي ، مع طول متساو لجميع التحقيقات.
- وتشمل علي الأقل DNA واحد وتسلسل الحمض النووي الريبي عشوائية واحده تحتوي علي مزيج من الأدنين (a) ، الغوانين (G) ، السيتوزين (C) وألغام (T)/uracil (U) (الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي تحقيقات في الجدول 1).
ملاحظه: كانت تسلسلات الحمض النووي و RNA الموصوفة في الجدول 1 مفيده كركائز أوليه لتصنيف نوع غير معروف من نشاط النواز ، اما Dnase أو rnase. ويوصي بهذين التسلسلين كنقطه انطلاق لأي فحص ، لأنهما اظهرا قدره واسعه علي الكشف عن ملامح نشاط النيوداز في عينات البكتيريا والانسجه. إذا لم يلاحظ نشاط النيوداز مع هذه التسلسلات الحمض النووي والجيش النيبالي الريبي ، مطلوب تصميم المزيد من القلة الكريات. - باستخدام نفس تسلسل بقايا النوكليوتيد كتسلسل الحمض النووي الاولي والجيش النيبالي الريبي ، وتشمل متواليات التي تحتوي علي النظير النيونوسايد إيواء التعديلات الكيميائية في 2 '-موقف السكر الريبوز ، مثل 2 '-فلورو و 2 '-O-ميثيل ، كخطوه صارمة لزيادة الانتقائية لل nucleases.
- تضمين تسلسلات معدله بالبالكامل تتكون بالكلية من 2 '-فلورو النظير النيونوسيد أو 2 '-O-الميثيل النظير النيونوسيد (كل 2 '-F وجميع 2 '-OMe ، الجدول 1)
- وتشمل متواليات خيالي تتكون من البورينات الطبيعية غير المعدلة و 2 '-فلورو بيريميدين النظير النيونوسيد (RNA pyr-2'f ، الجدول 1).
- وتشمل متواليات خيالي التي تتكون من البورينات الطبيعية غير المعدلة و 2 '-O-ميثيل بيريميدين النظير النيونوسيد (RNA pyr-2'ome ، الجدول 1).
- وتشمل متواليات خيالي التي تتكون من بيريمينيس الطبيعية غير المعدلة و 2 '-فلورو البيورين النظير النيونوسيد (RNA Pur-2'f ، الجدول 1).
- وتشمل متواليات خيالي تتكون من بيريمينيس الطبيعية غير المعدلة و 2 '-O-ميثيل البيورين النظير النيونوسيد (RNA Pur-2'ome ، الجدول 1).
- وتشمل علي الأقل DNA واحد وتسلسل الحمض النووي الريبي عشوائية واحده تحتوي علي مزيج من الأدنين (a) ، الغوانين (G) ، السيتوزين (C) وألغام (T)/uracil (U) (الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي تحقيقات في الجدول 1).
- بناء علي المعايير التالية تصميم مكتبه من الفلورسنت الفلورية القليلة من المجسات بين 8 و 12-مير طويلة لتجنب تشكيل الهيكل الثانوي ، مع طول متساو لجميع التحقيقات.
- [اولنوكليوكليوتيد] تحقيق تحضير وتخزين
ملاحظه: يتم توليف قله الكريات الوحيدة بواسطة الأسلوب الفوسفاراميسيت. بعد التوليف ، يتم تنقيه قله الكريات الوحيدة باستخدام اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) وتقاس الكتلة عن طريق قياس الطيف الكتلي.- قم بتدوير المجسات بالتجميد باستخدام جهاز الطرد المركزي وتمييعها في المخزن المؤقت تريس-أدتا (TE) لمنع تدهور النيوداز. تحديد حجم التخفيف وفقا لمحصول كل مسبار لتقديم حل الأسهم مع تركيز 500 pmol/μL.
- يحفظ المجفف بالتجميد عند 4 درجه مئوية أو درجه حرارة الغرفة لفتره قصيرة. للتخزين علي المدى الطويل (من أشهر إلى سنوات) ، وتخزينها بالتبريد المجفف القلة الكريات في-20 درجه مئوية. عند أعاده تعليق القلة المجففة بالتجميد في TE ، تخزين حلول الأسهم في-20 درجه مئوية أو ، ويفضل ، في-80 درجه مئوية.
2-الثقافة البكتيرية
- خذ حبه زجاجيه مساميه واحده من قارورة التخزين المبردة تحت ظروف معقمه.
- لعزل المستعمرات البكتيرية الفردية (السالمونيلا والقولونية) ، استخدم الطريقة الرباعية24 من خلال التلويح/المتداول حبه مباشره علي طبق بيتري التي تحتوي علي الصويا التريتيك أجار (TSA) المتوسطة تستكمل مع الأغنام بتحد الدم.
- احتضان الثقافة في 37 درجه مئوية لمده 24 ساعة.
3. اعداد سوبرناتانت
- نقل مستعمره واحده من وسائل الاعلام الصلبة إلى 50 mL الصويا التريتيك مرق (مكتب تقييس الاتصالات) واحتضان في 37 درجه مئوية ل 24 ح في 200 دوره في الدقيقة.
- تمييع الثقافة (1:500) في تقييس (الثقافة الفرعية) واحتضان في 37 درجه مئوية ل 24 ح في 200 دوره في الدقيقة في حاضنه الاهتزاز.
ملاحظه: من المتوقع انه بعد 24 ساعة من الاحتضان الثقافات البكتيرية في مرحله ثابته تصل القيم اعلي من 109 كفو/mL. - بعد فتره الحضانة ، نقل الثقافات إلى الأنابيب المعقمة المغطية والطاردة المركزية في 4,500 x g لمده 30 دقيقه.
- جمع ماده طافي واستخدامه علي الفور. بدلا من ذلك ، تخزين supernatants في 4 درجه مئوية أو-20 درجه مئوية.
4. مقايسة النشاط النواسي
- اعداد حلول العمل
- اعداد الحل 20 μL العمل لكل مسبار في 1.5 mL النيوداز الحرة أنابيب الطرد المركزي عن طريق تمييع (1:10 نسبه) حل الأسهم (500 pmol/μL) للتركيز العمل النهائي من 50 pmol/μL. لهذا الغرض ، مزيج 18 μL من الفوسفات العازلة المالحة (تلفزيوني) التي تحتوي علي MgCl2 و cacl2 مع 2 μl من الحل الأسهم التحقيق.
ملاحظه: انتبه إلى انه في حل العمل ، فان قله عدد الكريات الوحيدة أكثر عرضه للتدهور النواسي ، ولذلك ، فمن المستحسن لاعداد حلول العمل فقط قبل اعداد رد الفعل. - تجنب ملامسه الضوء المباشر اثناء التحضير واحفظه في الظلام (ملفوف في ورق القصدير) ، عند التعامل مع الفلوبورس.
- اعداد الحل 20 μL العمل لكل مسبار في 1.5 mL النيوداز الحرة أنابيب الطرد المركزي عن طريق تمييع (1:10 نسبه) حل الأسهم (500 pmol/μL) للتركيز العمل النهائي من 50 pmol/μL. لهذا الغرض ، مزيج 18 μL من الفوسفات العازلة المالحة (تلفزيوني) التي تحتوي علي MgCl2 و cacl2 مع 2 μl من الحل الأسهم التحقيق.
- رد فعل اعداد
- قبل الحارة فلوميتر (علي سبيل المثال ، الخلايا 1) إلى 37 درجه مئوية.
- اعداد مجموعه (أنبوب واحد/مسبار) من 1.5 mL النيوداز الحرة أنابيب الطرد المركزي لكل عينه (تقييس ، e. كولاي و السالمونيلا) والتسمية وفقا لذلك.
- بعناية أضافه 96 μl من مكتب تقييس الاعلام الثقافة العقيمة ، السالمونيلا ماده طافي أو e. القولونية ماده طافي (من الخطوة 3.4.). وبعد ذلك ، أضافه 4 μL/أنبوب من التحقيق حل العمل وفقا لذلك. تنفيذ هذه الخطوة في درجه حرارة الغرفة.
ملاحظه: استخدمت 10 تحقيقات للجولة الاولي من الفرز و 6 تحقيقات للجولة الثانية. - اخلط جيدا عن طريق التنضيد لاعلي ولأسفل للحصول علي حل متجانس. تجنب إدخال فقاعات الهواء في العينات اثناء المزج.
- تحميل 95 μl من كل حل (مسبار + ماده طافي أو ثقافة وسائل الاعلام) في بئر منفصلة من أسفل اسود ، غير المعالجة 96 لوحه جيدا. تقليل تشكيل فقاعات في الآبار عند التحميل عن طريق الاستغناء بعناية مع غيض علي مقربه من جدار البئر.
- غطي الصفيحة بغطاءها. فحص بصريا الغطاء والتحقق من علامات القلم أو تراكم الغبار الجسيمات التي قد إدخال التحف القياس. استبدل غطاء واحد جديد إذا كانت هذه هي الحالة.
- اعداد القياس
- افتح برنامج الاستحواذ (Gen5 3.05) بالنقر علي أيقونه اختصار البرنامج (الشكل S1A).
- حدد قراءه الآن من نافذه أداره المهام واختر جديد... لإنشاء بروتوكول القياس الحركي (الشكل S1B).
- انقر علي تعيين درجه الحرارة في اطار الحوار بعنوان الاجراء وحدد 37 درجه مئوية. تاكيد وحفظ الإعدادات عن طريق الضغط OK (الشكل S1C).
- انقر فوق بدء الحركية في اطار الحوار بعنوان الاجراء. ثم في نافذه الحوار المنبثقة ، بعنوان الخطوة الحركية، حدد 2 ح في مربع الإدخال وقت التشغيل و 2 دقيقه في مربع إدخال الفاصل الزمني . تاكيد وحفظ الإعدادات عن طريق الضغط OK (الشكل S1D).
- انقر فوق قراءه في اطار الحوار بعنوان الاجراء. ثم في نافذه الحوار المنبثقة ، بعنوان طريقه القراءة، حدد كثافة الفلورية كطريقه الكشف ، نقطه النهاية/الحركية كنوع القراءة والفلاتر كنوع البصريات. تاكيد وحفظ الإعدادات عن طريق الضغط OK (الشكل S1E).
- في نافذه الحوار المنبثقة بعنوان قراءه الخطوة (الحركية)، حدد الأخضر من مجموعه عوامل التصفية. تاكيد وحفظ الإعدادات عن طريق الضغط OK (الشكل S2A).
- في اطار الحوار المعنون الاجراء، حدد استخدام الغطاء وانقر فوق التحقق من الصحة للتاكد من صحة البروتوكول الذي تم إنشاؤه. يتم تاكيد ذلك بواسطة اطار حوار منبثق (الشكل S2B).
- حدد البروتوكول في شريط القوائم واختر الاجراء (الشكل S2C).
- في نافذه الحوار المعنونة الاجراء، حدد الآبار التي سيتم قياسها (الشكل S2D).
- ادخل اسم التجربة في مربع إدخال اسم الملف (الشكل S2E).
- تحميل لوحه مع غطاء لها في قارئ لوحه. تاكد من ان اللوحة في الاتجاه الصحيح.
- بدء الاستحواذ بالنقر فوق " قراءه زر جديد " في شريط الاداات (الشكل S2F).
- تحليل البيانات
- انقر علي أحد الآبار المقاسه في نافذه الحوار بعنوان لوحه 1 (الشكل S3A).
- انقر فوق تحديد الآبار وتضمين كافة الآبار المقاسه في نافذه الحوار تحديد البئر . تاكيد وحفظ الإعدادات عن طريق الضغط علي OK. (الشكل S3B).
- حدد البيانات في نافذه الحوار بعنوان اللوحة 1 لتصور النتائج المجدولة (الشكل S3C).
- تصدير البيانات إلى ورقه انتشار عن طريق تحديد التصدير السريع من قائمه السياق (الشكل S3C).
- في ورقه الانتشار ، تسميه أعمده البيانات وفقا لكل عينه والتحقيق.
- توليد الرسوم البيانية الحركية ، وذلك باستخدام خط مع علامات نمط ، من خلال التامر وحدات مضان النسبية (rfu) مقابل الوقت (محور س: الجدول الزمني للتفاعل ومحور ص: rfus).
ملاحظه: وصف إنشاء رسم بياني قابل للتطبيق عند استخدام برامج جداول البيانات (علي سبيل المثال ، Excel). ومع ذلك ، يمكن استخدام اي برامج أخرى لتوليد الرسوم البيانية من البيانات الخام التي تم الحصول عليها ، عن طريق التامر RFU مقابل الوقت. - حساب معدل رد الفعل الانزيمي لكل فتره تقاس وفقا للصيغة التالية25:
معدل = ، حيث إذا كان rfu في الفاصل الزمني القصوى نقطه الوقت والثاني هو rfu في الحد الأدنى الفاصل الزمني نقطه ، و Tf و Ti هي الحد الأقصى والحد الأدنى الفاصل الزمني النقاط ، علي التوالي. - حدد المعدل الذي يحتوي علي اعلي قيمه (Rmax) لكل منحني. إذا كان هناك أكثر من Rmax واحد لكل نموذج ، حدد الواحد الذي يحدث في أقرب نقطه زمنيه للقياس.
- احسب النسبة بين Rmax ومتوسط قيمه الفاصل الزمني الذي يحدث فيه rmax : معامل المعدل =
- حساب الفرق اضعاف (فد) بين معامل معدل السالمونيلا و e. كولاي لكل مسبار.
- النظر في قيمه الفرق اضعاف اعلي من 3 كما كبيره.
- النظر في التحقيقات الهامه مع اعلي القيم الفرق اضعاف (فد) كتحقيقات المرشح وكاساس لتصميم المكتبة في جولة الفرز المقبل.
معدل = ، حيث إذا كان rfu في الفاصل الزمني القصوى نقطه الوقت والثاني هو rfu في الحد الأدنى الفاصل الزمني نقطه ، و Tf و Ti هي الحد الأقصى والحد الأدنى الفاصل الزمني النقاط ، علي التوالي.
5-معايير اختيار جولات الفرز (الشكل 1)
- الجولة الاولي من الفحص
- قم باجراء فحص النشاط النواسي (كما هو موضح في القسم 4) باستخدام الحمض النووي ، RNA ومسبار بولينوكليوتيد.
- تقييم تفضيل الكيمياء DNA أو كيمياء الحمض النووي الريبي عن طريق مقارنه عدد والأداء (FD القيمة) من الحمض النووي وتحقيقات المرشح RNA.
- حدد نوع كيمياء الحمض النووي الذي يجعل أكبر عدد من مجسات المرشحين ، كما هو موضح في الشكل 1.
- الجولة الثانية من الفحص
- اجراء فحص النشاط النواسي (كما هو موضح في القسم 4) باستخدام التحقيقات المعدلة بالبالكامل وتحقيقات الشمبانزي المصممة علي أساس الركيزة الحمضية النووية المختارة في جولة الفحص الاولي.
- تقييم التفضيل نحو المتواليات التي تحتوي علي 2 '-فلورو و 2 '-O-الميثيل النظير النيونوسيد من خلال مقارنه النتائج التي تم الحصول عليها ل 2 '-فلورو و 2 '-س-ميثيل تحقيقات المرشح المعدلة.
- حدد نوع التعديل التناظري الجانبي الذي يجعل أكبر عدد من مجسات المرشحين ، كما هو موضح في الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 تدفق العمل لهذه المنهجية ، الذي ينقسم إلى جولتين للفحص. ويمكن الاطلاع علي البيانات الاوليه لجولة الفرز هذه في الجدول التكميلي 1. في الجولة الثانية ، تم توليفها التحقيقات المعدلة كيميائيا عن طريق استبدال تسلسل الجيش النيبالي الريبي مع النيونوسيدس المعدلة كيميائيا (كل 2 '-فلورو وجميع 2 '-OMethyl) أو من خلال الجمع بين الحمض الريبي النيبالي والبورينات أو بيريميدينس كيميائيا تعديل (RNA Pyr-2'F Pyr-2'OMe ، الجيش النيبالي الريبي Pur-2'Ome والجيش النيبالي الريبي Pur-2'OMe). ويمكن الاطلاع علي البيانات الاوليه لجولة الفرز هذه في الجدول التكميلي 2. ويمكن الاطلاع علي وصف مفصل للتسلسل في الجدول 1. وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها من الجولة الاولي للفحص في الشكل 2، حيث تبلغ supernatants الثقافة السالمونيلا تفضيلا واضحا لتحقيقات RNA علي تحقيقات الحمض النووي. في المقابل, e. كولاي والثقافة وسائل الاعلام الضوابط تظهر قدره محدوده جدا لتتحلل تحقيقات RNA. الاضافه إلى ذلك ، قمنا بحساب الفرق اضعاف (فد) بين معاملات معدل السالمونيلا و e. كولاي (الجدول التكميلي 3 والجدول التكميلي 4) من أجل تحديد أفضل التحقيقات أداء. وأجريت الحسابات علي النحو الموصوف في قسم البروتوكول.
هذه النتائج تشير إلى وجود نوع RNase من النشاط المستمدة من السالمونيلا. واستنادا إلى تحديد الحمض النووي الريبي كنوع من أنواع الأحماض النونوديه المفضلة لدي السالمونيلا ، فقد صممنا مكتبه جديده باستخدام النيوبوتيديس المعدل كيميائيا لاستخدامها في الجولة الثانية من الفحص الرامية إلى زيادة خصوصية تحقيقات. ويبين الشكل 3 الملامح الحركية للمسابر التي تحتوي علي النوكليودات المعدلة كيميائيا. ومن المثير للاهتمام ، RNA Pyr-2'OMe والحمض الريبي النيبالي Pur-2'OMe تظهر أفضل أداء السلوك الحركي بالمقارنة مع الجيش النيبالي الريبي Pyr-2'Ome والحمض الريبي النيبالي Pur-2'Ome ، علي التوالي.
وتشير هذه النتائج إلى ان السالمونيلا لديها نشاط RNase الهامه التي يمكن استخدامها لاختيار التحقيقات قادره علي الاعتراف علي وجه التحديد هذه البكتيريا. وعلاوة علي ذلك ، لاحظنا ان 2 '-OMe النيونوسيدس المعدلة كيميائيا هي أكثر ملاءمة لنوع RNAses يفرزها السالمونيلا. ومع وضع هذا في الاعتبار ، فان البروتوكول الموصوف في هذه المساهمة يتيح امكانيه استكشاف استخدام نشاط النيوداز كمؤشر حيوي.
الشكل 1: ثقافات البكتيريا وسير العمل في عمليه الفرز. اعداد البكتيريا الثقافات والديدان (اليسار). وصف سير العمل لجولتي الفرز. الفحص الأول: يتم تقييم تفضيل الحمض النووي أو RNA باستخدام 10 مجسات. الفحص الثاني: استنادا إلى تفضيل الأحماض النووية ، يتم تقييم المجسات الاضافيه التي تحتوي علي النيوكليودات المعدلة كيميائيا للتعرف علي أفضل الركائز أداء لنشاط النيواز معين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: جولة الفحص الحركي الاولي. الملامح الحركية من السالمونيلا، e. كولاي والثقافة وسائل الاعلام (مكتب تقييس الاتصالات) باستخدام الحمض النووي وتحقيقات RNA. يتم تمثيل نشاط النيوداز من قبل وحدات الفلورية النسبية (RFU). الرسوم البيانية هي تمثيليه لما لا يقل عن 3 التجارب التي أجريت بشكل فردي. يتم تسميه العينات المختلفة كما هو موضح في وسيله إيضاح الرسم البياني. وقد تم حساب قيم فرق الطي (FD) باستخدام معاملات معدل السالمونيلا و e. كولاي لكل مسبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: جولة الفحص الحركي الثانية. الملامح الحركية من السالمونيلا، e. كولاي والثقافة وسائل الاعلام (مكتب تقييس الاتصالات) باستخدام المجسات المعدلة كيميائيا. يتم تمثيل نشاط النيوداز من قبل وحدات الفلورية النسبية (RFU). الرسوم البيانية هي تمثيليه لما لا يقل عن 3 التجارب التي أجريت بشكل فردي. يتم تسميه العينات المختلفة كما هو موضح في وسيله إيضاح الرسم البياني. وقد تم حساب قيم فرق الطي (FD) باستخدام معاملات معدل السالمونيلا و e. كولاي لكل مسبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تسلسل مسبار الحمض النووي. قائمه بجميع المجسات الحمضية النووية المستخدمة في هذه الدراسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: اعداد القياس. نقرات الزر وإطارات الحوار التي تصف العملية المتدرجة التي يتم تنفيذها في برنامج الاستحواذ لاعداد معلمات القياس المختلفة. (ا) أيقونه سطح المكتب. (B) نافذه حوار أداره المهام. (C) الاجراء ودرجه الحرارة اعداد إطارات الحوار. (د) الاجراء وإطارات الحوار الخطوة الحركية. (ه) الاجراء وإطارات الحوار أسلوب القراءة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: اعداد القياس. نقرات الزر وإطارات الحوار التي تصف العملية المتدرجة التي يتم تنفيذها في برنامج الاستحواذ لاعداد معلمات القياس المختلفة. (ا) الاجراء وقراءه الخطوة (الحركية) إطارات الحوار. (B) اطار حوار الاجراء (C) "بروتوكول" شريط القوائم. (د) نافذه الحوار اختيار جيد. (ه) مربع إدخال اسم الملف. (و) تشغيل رمز جديد يستخدم لبدء الاستحواذ داخل البرنامج. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3: تحليل البيانات. نقرات الزر ونوافذ الحوار التي تصف العملية المتدرجة التي تم تنفيذها في برنامج الاستحواذ لتصدير البيانات المكتسبة إلى ورقه انتشار لمزيد من التحليل. (ا) اطار الحوار مصفوفة اللوحة. (B) لوحه وإطارات الحوار اختيار جيد. (C) نافذه الحوار لوحه وقائمه سياق التصدير السريع . يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 4: جولة الفرز الثالثة (تحسين تفضيلات التسلسل). وصف للخطوات المختلفة التي تنطوي عليها جولة الفرز الاضافيه التي تهدف إلى تقييم الاختلافات في التسلسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 5: جولة الفرز الرابعة (جولة تقييم الخصوصية). وصف للخطوات المختلفة التي تنطوي عليها جولة الفرز الاضافيه التي تهدف إلى زيادة الخصوصية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 6: جولة الفرز الخامسة (تحسين معلمه التفاعل). وصف للخطوات المختلفة التي تنطوي عليها جولة فحص اضافيه تهدف إلى الحد من التفاعلات غير المستهدفة عبر تحوير النشاط النيوداز. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1 التكميلي: البيانات الخام من جولة الفرز الاولي. لكل مسبار (المسمية باللون الأحمر ، في الأعلى) ، تم الإبلاغ عن الوقت الاستحواذ والقيم الفلورية الخام لمكتب تقييس الاعلام ، e. كولاي و السالمونيلا، إلى جانب قيمه المعدل المحسوب لكل فتره زمنيه. وأجريت الحسابات علي النحو الموصوف في قسم الأساليب. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول 2 التكميلي: البيانات الاوليه من جولة الفرز الثانية. لكل مسبار (المسمية باللون الأحمر ، في الأعلى) ، تم الإبلاغ عن الوقت الاستحواذ والقيم الفلورية الخام لمكتب تقييس الاعلام ، e. كولاي و السالمونيلا، إلى جانب قيمه المعدل المحسوب لكل فتره زمنيه. وأجريت الحسابات علي النحو الموصوف في قسم الأساليب. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول 3 التكميلي: تحليل البيانات لجولة الفرز الاولي. لكل مسبار (المسمية باللون الأحمر ، في الأعلى) ، تم الحصول علي القيم التالية ل تقييس ، e. القولونية و السالمونيلا: قيم المعدل الأقصى ، الحد الأدنى والحد الأقصى للنقاط الزمنيه الفاصل ، معامل معدل ، والقيم الفرق اضعاف بين السالمونيلا و e. القولونية علي تقييس واضعاف القيم الفرق بين السالمونيلا و e. القولونية (المشار اليها باللون الأصفر). تم اجراء الحسابات كما هو موضح في قسم الأساليب وصيغ الحساب والحسابات خطوه بخطوه موضحه في جدول البيانات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول 4: تحليل البيانات لجولة الفرز الثانية. لكل مسبار (المسمية باللون الأحمر ، في الأعلى) ، تم الحصول علي القيم التالية ل تقييس ، e. القولونية و السالمونيلا: قيم المعدل الأقصى ، الحد الأدنى والحد الأقصى للنقاط الزمنيه الفاصل ، معامل معدل ، والقيم الفرق اضعاف بين السالمونيلا و e. القولونية علي تقييس واضعاف القيم الفرق بين السالمونيلا و e. القولونية (المشار اليها باللون الأصفر). تم اجراء الحسابات كما هو موضح في قسم الأساليب وصيغ الحساب والحسابات خطوه بخطوه موضحه في جدول البيانات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ارتبطت تعديلات نشاط النيواز بمجموعه واسعه من الأنماط الظاهرية للامراض ، بما في ذلك أنواع مختلفه من السرطان والتهابات البكتيرية. ويقترح ان تكون هذه التعديلات العامل المسبب للشرط14، في حين انها في حالات أخرى هي نتيجة لحدث فسيولوجي ضار20 أو العامل المسبب للامراض16،26. ليس من المستغرب ، وقد وصفت محاولات لاستخدام نوكليسيس والنشاط النيوداز كالبيولوجية التشخيصية15،22،23،26، مع وعد كبير. وبناء علي ذلك ، يبدو ان وضع نهج فرز قوي وقابل للتكرار من أجل التقييم المنهجي لنشاط النيوداز في الامراض ولتحديد مراسل محدد وحساس أمر وجيه. ولمعالجه هذه الضرورة ، قمنا بتطوير منصة فرز قويه ومعياريه وسهله التنفيذ استنادا إلى فحص مضان ، الذي يسمح باكتشاف العلامات الحيوية للامراض الجديدة وتحديد مجسات الحمض النووي الحساسة والمحددة في موازيه ، باستخدام العمل الحفاز لل nucleases.
أدوات فحص قويه مثل الجزيئات الصغيرة فحص الانتاجيه العالية (الشام)27، والتطور المنهجي لل يغاندس عن طريق الإثراء الاسي (selex)28 أو عرض بالعاثيه29 وقد سبق الإبلاغ عنها ، والتي تسمح تحديد جزيئات التعرف علي التقارب العالية (علي سبيل المثال ، جزيئات صغيره ، الابتامرات أو ملزمه-الببتيدات). المقارنة ، فان نهج الفرز المعروض هنا يسمح باختيار المجسات التي يمكن ان تحدد نشاط النيوداز المعروف وغير المعروف. وعلاوة علي ذلك ، وهذا النهج متوافق مع في المختبر ، الجسم السابق وفي نماذج الفحص المجرية. وعلاوة علي ذلك ، فان الطبيعة التفاعلية لل نوكليسيس تعطي ميزه واضحة علي النهج المذكورة أعلاه ، في ان التفاعل التحقيق-النيوداز ليست ساكنه ، ولكن عمليه ديناميكية. وهذا يعني ان النشاط nucleases ' يصبح وحده تضخيم اشاره جوهريه لتحقيقات مراسل لان العديد من التحقيقات مراسل يمكن ان تتفاعل مع النيوداز واحد.
وكما هو الأمر في اي طريقه أخرى للفحص ، فان إنشاء وأداره المكتبة الاوليه أمر أساسي. وتوفر طبيعة مجسات الحمض النووي مرونة كبيره في تصميم وإنشاء المكتبة وتسمح بإدخال درجات متفاوتة من التعقيد تبعا لتطبيق الفحص. ويمكن إدخال تعقيد المكتبة علي مستويات مختلفه بما في ذلك الزخارف المتسلسلة ، وكيمياء النوكليوتيد ، وكيمياء الفوسفات الاساسيه ، وطول القلة الوحيدة الكريات. تحوير تعقيد المكتبة يسمح لتحديد المجسات ، ليس فقط لقدرتها علي التعرف بنجاح النشاط النيوداز المرتبطة بالمرض ولكن أيضا لخصائص متوافقة مع التطبيقات اللاحقة في الجسم الآخر. وعلاوة علي ذلك ، توفر مكتبه قاعده الأحماض النووية العديد من المزايا علي الأجسام المضادة أو نظرائهم الببتيد. من ناحية ، من المعروف جيدا إنتاج الأجسام المضادة لتكون مرهقه ، والتي تتطلب الحيوانية أو نظم الثقافة البدائية النواة ، مما يزيد من التكلفة وإدخال تقلب دفعه30،31. وعلاوة علي ذلك ، فان الوزن الجزيئي العالي و والاستمناع الحد من تطبيقها28،32. من ناحية أخرى ، وتوليد المكتبات الببتيد البيولوجية عاده ما يتطلب اما الفيروسية أو البكتيرية نظم التعبير29،30، وزيادة تعقيد عمليه الفرز. المكتبات الببتيد الكيميائية تجنب هذه المشكلة ، علي حساب استخدام النظم المستندة إلى حبه ملتوية أو جولات متعددة من التوليف الببتيد مكلفه33. يتم التحايل علي كل هذه المشاكل باستخدام مكتبه الأحماض النووية. وبمجرد إنشاء المكتبة الاوليه ، تكون طرق الفحص سريعة ومباشره. والطريقة الموصوفة هنا هي بمثابه منصة لجولات الفرز الاضافيه ، مثل تحسين التسلسل (الشكل التكميلي 4) ، وتقييم الخصوصية (الشكل التكميلي 5) أو التحسين الأمثل للعناصر النمطية نشاط النيوداز ، مثل العوامل المعدنية المختلطة (العادات الثنائية التكافؤ) ومزيلات المعدن ، والتي هي مفيده جدا لزيادة خصوصية التحقيقات المختارة (الشكل التكميلي 6).
ويمكن تحسين الفحص الإشعاعي الحركي المستخدم في هذه الدراسة لكل من الثقافات البكتيرية والخلوية ، مع اجراء الفحص في لوحات ميكروتير سهله الاستخدام. في حاله المقايسات الخلوية ، هذا البروتوكول متوافق مع كل من الثقافات المعلقة والاحاديه الطبقة ، والتي ، بعد التحسين ، يمكن استخدامها وفقا لضروريات النموذج في المختبر الذي يتم دراسته. لقد حددنا العديد من الخطوات الحاسمة التي تتطلب التحسين قبل الفحص. وتشمل هذه الخلايا رقم الخلية أو كثافة البكتيريا التي سيتم فحصها ، وتركيز المسبار ، وإعدادات الكشف عن المقياس الفلوري ، أو تنفيذ أساليب تصحيح الخلفية المدمجة. أحد القيود علي هذه التكنولوجيا هو الحاجة إلى نشاط النيوداز المتغيرة المرتبطة بالحالة المرضية للفائدة. وبدون هذه الميزة ، فان نهج الفرز لاختيار التحقيقات المرشحة ليس ممكنا. وهناك قيد آخر هو قدره الذاتي التبريد من guanines عندما تكون علي مقربه من فلوكوفيري. يجب مراعاه هذه الخاصية عند تصميم المكتبة.
الطبيعة الانزيميه للتفاعل الذي يجري قياسه يجعل من الضروري النظر في أوقات تحميل اللوحة. سيؤدي تقليل أوقات التحميل إلى تقليل اختلافات الخلفية بين الظروف التجريبية المختلفة. هناك عده خيارات للتغلب علي هذه المشكلة ، مثل تباطؤ التفاعل الانزيمي اثناء التحميل باستخدام الكواشف الجليد الباردة ، أو باستخدام أنظمه التحميل الألى ، علي الرغم من ان هذا الأخير يزيد من التكاليف إلى حد كبير ، ولكن أيضا الانتاجيه. وعلاوة علي ذلك ، القياسات الحركية هي تحسن كبير علي القياسات الساكنة ، وتوفير صوره كامله وأكثر واقعيه من ديناميات النشاط الحفاز.
وباختصار ، فان بروتوكولنا يوفر طريقه فرز متعددة وقويه وقابله للتكرار لتحديد المجسات الحساسة والمحددة للحمض النووي للكشف عن نشاط النيوداز المرتبط بالمرض ، والذي يتغلب علي العقبات الرئيسية طرق الفرز البديلة. ونحن نتوقع ان هذه التكنولوجيا الفرز سوف تسمح بتطوير أدوات تشخيصيه جديده في العديد من الظروف ، مع سهوله الترجمة إلى العيادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ الاعتراف بالسيدة لويزا ا. هيرنانديز (جامعه لينكوبينغ) لمراجعتها المتانيه للمخطوطة وإسداء المشورة القيمة لها. وقد حظي هذا العمل بدعم مؤسسه كنوت واليس فالينبرغ ومنطقه البحوث الاستراتيجية التابعة للحكومة السويدية في مجال علوم المواد المتعلقة بالمواد الوظيفية المتقدمة في جامعه لينكوبينغ (الكلية غرانت SFO-مات-ليو رقم 2009-00971).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
References
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, Pt 1 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A.
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. Manual of Clinical Enzyme Measurements. , Worthington Diagnostics. (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J.
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
