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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60005
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,3, 1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), 3Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University
* These authors contributed equally

Summary

Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit verschiedenen menschlichen Bedingungen verbunden, die ihr Potenzial als Biomarker zugrunde liegen. Die modulare und einfach zu implementierende Screening-Methodik, die in diesem Papier vorgestellt wird, ermöglicht die Auswahl spezifischer Nukleinsäuresonden zur Nutzung der Nukleaseaktivität als Biomarker von Krankheiten.

Abstract

Nukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die Nukleinsäuren abbauen, indem sie die Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen katalysieren, die die Ribosezucker verbinden. Nukleasen weisen eine Vielzahl lebenswichtiger physiologischer Rollen in prokaryotischen und eukaryotischen Organismen auf, die von der Aufrechterhaltung der Genomstabilität bis hin zum Schutz vor Krankheitserregern reichen. Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit mehreren pathologischen Bedingungen verbunden, einschließlich bakterieller Infektionen und Krebs. Zu diesem Zweck hat die Nukleaseaktivität ein großes Potenzial gezeigt, als spezifischer Biomarker genutzt zu werden. Ein robustes und reproduzierbares Screening-Verfahren auf der Grundlage dieser Aktivität ist jedoch nach wie vor sehr wünschenswert.

Hierin führen wir ein Verfahren ein, das das Screening auf Nukleaseaktivität mit Nukleinsäuresonden als Substraten ermöglicht, mit dem Umfang der Unterscheidung zwischen pathologischen und gesunden Bedingungen. Diese Methode bietet die Möglichkeit, neue Sondenbibliotheken mit zunehmender Spezifität iterativ zu gestalten. Daher sind mehrere Screening-Runden notwendig, um das Design der Sonden mit verbesserten Eigenschaften zu verfeinern und dabei die Verfügbarkeit chemisch modifizierter Nukleinsäuren zu nutzen. Das beträchtliche Potenzial der vorgeschlagenen Technologie liegt in ihrer Flexibilität, hohen Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit für das Screening von Nukleaseaktivitäten im Zusammenhang mit Krankheitszuständen. Es wird erwartet, dass diese Technologie die Entwicklung vielversprechender diagnostischer Werkzeuge mit großem Potenzial in der Klinik ermöglichen wird.

Introduction

Nukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die in der Lage sind, die Phosphodiesterbindungen zu spalten, die die Rückgratstruktur von Nukleinsäuremolekülen bilden. Die große Vielfalt der Nukleasen macht ihre Klassifizierung ziemlich schwierig. Es gibt jedoch einige gängige Kriterien, die zur Beschreibung von Nukleasen verwendet werden, wie substratpräferenzium (Deoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA)), Spaltungsstelle (Endonukleasen oder Exonukleasen) oder Metallionenabhängigkeit, unter anderem1. Nukleasen sind hochkonservierte katalytische Enzyme, die sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Organismen eine grundlegendeRolle spielen und als Genbearbeitungswerkzeuge verwendet wurden und weiterhin verwendet werden 2 . Sie sind auch grundlegende Akteure in der DNA-Wartung und -Replikation, helfen, die Genomstabilität zu erhalten und nehmen an Korrekturverfahren teil3. Bei Bakterien wurden beispielsweise Nukleasen als wichtige Virulenzfaktoren identifiziert, die das überleben der Bakterien fördern können, indem sie die Wirksamkeit desImmunsystemsdes Wirts 4,5,6,7 ,8. Bei Säugetieren, Nukleasen wurden vorgeschlagen, in Apoptose9verwickelt werden , mitochondriale Biogenese und Wartung10 und Vermittlung von antibakteriellen und antiviralen angeborenen Immunantworten11. Es überrascht nicht, dass Nuklease-Aktivitätsänderungen, ob Verbesserung oder Fehlen von, in eine Vielzahl von menschlichen Krankheiten verwickelt sind. Diese Krankheiten reichen von einer Vielzahl von Krebsarten12,13 bis zu Herzhypertrophie10 oder Autoimmunerkrankungen14. Daher sind Nukleasen zu interessanten Kandidaten als Biomarker für eine heterogene Gruppe menschlicher Bedingungen geworden. Tatsächlich haben Nukleasen bereits ihr Potenzial als erfolgreiche diagnostische Instrumente zum Nachweis von Infektionen gezeigt, die durch bestimmte bakterielle Wirkstoffe wie Staphylococcus aureus oder Escherichia coli15 verursacht werden. 16. Bei vielen Krebsarten ist die Expression von Staphylokokkennuklease-Domänen-haltigem Protein 1 (SND1) Ribonuklease ein Hinweis auf eine schlechte Prognose17. Bei Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs wurden erhöhte Ribonuklease-I-Serumspiegel18 berichtet und vorgeschlagen, mit Krebszellphänotypen in Verbindung gebracht zu werden19. Bei ischämischen Herzerkrankungen, wie Myokardinfarkt oder instabiler Angina pectoris, desoxyribonuklease I (DNase I) Serumspiegel haben sich als ein gültiger diagnostischer Marker20,21.

Es wurde vermutet, dass die globale Blaupause der Nuklease-Aktivität in gesunden und Krankheitszuständen unterschiedlich sein kann. Tatsächlich haben jüngste Berichte Unterschiede in der Nukleaseaktivität verwendet, um zwischen gesunden und krebsernen Phänotypen22 zu unterscheiden oder pathogene bakterielle Infektionen artspezifisch zu identifizieren15,23. Diese Erkenntnisse haben einen neuen Weg für den Einsatz von Nukleasen als Biomarker von Krankheiten eröffnet. Daher besteht die Notwendigkeit für die Entwicklung einer umfassenden Screening-Methode, die in der Lage ist, krankheitsassoziierte Unterschiede in der Nukleaseaktivität systematisch zu identifizieren, die bei der Entwicklung neuer diagnostischer Instrumente von entscheidender Bedeutung sein können.

Hierin führen wir einen neuen In-vitro-Screening-Ansatz ein (Abbildung 1), um empfindliche und spezifische Sonden zu identifizieren, die in der Lage sind, zwischen Nukleaseaktivität bei gesunder und ungesundem Oder einer spezifischen Aktivität einer Zell- oder Bakterienart zu unterscheiden. Unter Ausnutzung der Modularität von Nukleinsäuren haben wir eine erste Bibliothek von abgeschreckten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden entwickelt, die aus einem umfassenden Satz verschiedener Sequenzen und Chemikalien bestehen, die beide wichtige Parameter für die Bibliotheksgestaltung sind. Diese Oligonukleotid-Sonden werden von einem Fluorophor (Fluorescein-Amidit, FAM) und einem Quencher (Tide Quencher 2, TQ2) an den 5' bzw. 3' Enden(Tabelle 1) flankiert. Durch die Verwendung dieses fluoreszierenden Resonanzenergietransfers (FRET) basierenden fluormetrischen Assays zur Messung der Kinetik des enzymatischen Abbaus konnten wir Kandidatensonden mit dem Potenzial identifizieren, differentiale Muster der Nukleaseaktivität zu unterscheiden. mit gesunden oder Krankheitszuständen verbunden sind. Wir haben einen iterativen Prozess entwickelt, bei dem neue Bibliotheken auf der Grundlage der besten Kandidatensonden erstellt werden, der es ermöglicht, immer spezifischere Kandidatensonden in nachfolgenden Screening-Schritten zu identifizieren. Darüber hinaus nutzt dieser Ansatz die katalytische Natur von Nukleasen, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Dies wird erreicht, indem die aktivierbare Natur der Reportersonden und die Fähigkeit von Nukleasen genutzt werden, Substratmoleküle kontinuierlich zu verarbeiten, die beide wichtige Vorteile gegenüber alternativen Antikörpern oder kleinen molekülbasierten Screening-Methoden darstellen.

Dieser Ansatz bietet ein hochmodulares, flexibles und einfach zu implementierendes Screening-Tool zur Identifizierung spezifischer Nukleinsäuresonden, die in der Lage sind, gesunde und krankheitsfördernde Erkrankungen zu unterscheiden, und eine hervorragende Plattform für die Entwicklung neuer diagnostische Nagenzwerkzeuge, die für zukünftige klinische Anwendungen angepasst werden können. Als solcher wurde dieser Ansatz verwendet, um die Nuklease-Aktivität von Salmonella Typhimurium (hier als Salmonellabezeichnet ) für die spezifische Identifizierung dieser Bakterien abgeleitet zu identifizieren. Im folgenden Protokoll berichten wir über eine Methode zum Abschirmen auf bakterielle Nukleaseaktivität mittels kinetischer Analyse.

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Protocol

1. Oligonukleotid Bibliothek Design und Vorbereitung

  1. Bibliotheksdesign
    1. Basierend auf den folgenden Kriterien entwerfen Sie eine Bibliothek von abgeschreckten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden zwischen 8 und 12-mer lang, um sekundäre Strukturbildung zu vermeiden, mit gleicher Länge für alle Sonden.
      1. Schließen Sie mindestens eine DNA- und eine RNA-Zufallssequenz ein, die eine Kombination aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T)/Uracil (U) enthält (DNA- und RNA-Sonden in Tabelle 1).
        HINWEIS: Die in Tabelle 1 beschriebenen DNA- und RNA-Sequenzen waren als Anfangssubstrate für die Klassifizierung einer unbekannten Art von Nukleaseaktivität, entweder DNase oder RNase, nützlich. Diese beiden Sequenzen werden als Ausgangspunkt für jedes Screening empfohlen, da sie eine breite Fähigkeit gezeigt haben, Nuklease-Aktivitätsprofile in Bakterien und Gewebeproben zu erkennen. Wenn die Nukleaseaktivität mit diesen DNA- und RNA-Sequenzen nicht beobachtet wird, ist die Entwicklung zusätzlicher Oligonukleotide erforderlich.
      2. Umfassen Sie Polynukleotidsequenzen, die aus einem einzigen Nukleotidtyp bestehen, um die Sequenzabhängigkeit für eine gegebene Nukleaseaktivität zu bestimmen (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C und RNA-Poly G in Tabelle 1).
      3. Unter Verwendung der gleichen Sequenz von Nukleotid-Rückständen wie die ursprünglichen DNA- und RNA-Sequenzen umfassen Sequenzen, die Nukleosidanaloge enthalten, die chemische Modifikationen an der 2'-Position des Ribosezuckers, wie 2'-Fluoro und 2'-O-Methyl, als einen strengen Schritt enthalten. zur Erhöhung der Selektivität der Nukleasen.
        1. Vollständige modifizierte Sequenzen, die vollständig aus 2'-Fluorosid-Analogen oder 2'-O-Methyl-Nukleosid-Analogen bestehen (Alle 2'-F und Alle 2'-OMe, Tabelle 1)
        2. Schließen Sie chimäre Sequenzen ein, die aus unveränderten natürlichen Purinen und 2'-Fluoropyrimidin-Nukleosid-Analogen bestehen (RNA Pyr-2'F, Tabelle 1).
        3. Schließen Sie chimäre Sequenzen ein, die aus unveränderten natürlichen Purinen und 2'-O-Methylpyrimidin-Nukleosid-Analogen bestehen (RNA Pyr-2'OMe, Tabelle 1).
        4. Schließen Sie chimäre Sequenzen ein, die aus unveränderten natürlichen Pyrimiden und 2'-Fluor-Purin-Nukleosid-Analogen bestehen (RNA Pur-2'F, Tabelle 1).
        5. Schließen Sie chimäre Sequenzen ein, die aus unveränderten natürlichen Pyrimiden und 2'-O-Methyl-Purin-Nukleosid-Analogen bestehen (RNA Pur-2'OMe, Tabelle 1).
  2. Oligonukleotid-Sonde Vorbereitung und Lagerung
    HINWEIS: Oligonukleotide werden mit der Phosphoramidit-Methode synthetisiert. Nach der Synthese werden die Oligonukleotide mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt und die Masse mittels Massenspektrometrie gemessen.
    1. Drehen Sie die lyophilisierten Oligonukleotid-Sonden mit einer Zentrifuge herunter und verdünnen Sie sie im Tris-EDTA (TE)-Puffer, um einen Nukleaseabbau zu verhindern. Bestimmen Sie das Verdünnungsvolumen entsprechend der Ausbeute jeder Sonde, um eine Lagerlösung mit einer Konzentration von 500 pmol/l zu rendern.
    2. Lyophilisierte Oligonukleotide bei 4 °C oder raumtemperatur kurzfristig lagern. Für die Langzeitlagerung (Monate bis Jahre) lyophilisierte Oligonukleotide bei -20 °C lagern. Bei Resuspension lyophilisierter Oligonukleotide in TE die Lagerlösungen bei -20 °C oder vorzugsweise bei -80 °C lagern.

2. Bakterielle Kultur

  1. Nehmen Sie eine poröse Glasperle aus der kryogenen Durchstechflasche unter sterilen Bedingungen.
  2. Um einzelne Bakterienkolonien (Salmonellen und E. coli)zu isolieren, verwenden Sie die Quadrantenmethode24, indem Sie die Perle direkt auf eine Petrischale mit Tryptic Soy Agar (TSA) Medium stutzen, das mit defibrinierten Schafen ergänzt wird. blut.
  3. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C für 24 h.

3. Supernatante Vorbereitung

  1. Übertragen Sie eine einzelne Kolonie von festen Medien auf 50 ml Tryptic Soy Broth (TSB) und brüten bei 37 °C für 24 h bei 200 Rpm.
  2. Die Kultur (1:500) in TSB (Subkultur) verdünnen und bei 37 °C für 24 h bei 200 U/min in einem Schüttelinkubator brüten.
    HINWEIS: Es wird erwartet, dass sich die Bakterienkulturen nach 24 h Inkubation in einer stationären Phase befinden und Werte über 109 KBE/ml erreichen.
  3. Nach der Inkubationszeit die Kulturen 30 min auf gekapselte sterile Schläuche und Zentrifugen bei 4.500 x g übertragen.
  4. Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn sofort. Alternativ können Sie die Überräube bei 4 °C oder -20 °C lagern.

4. Nuklease Aktivität Assay

  1. Vorbereitung von Arbeitslösungen
    1. Bereiten Sie für jede Sonde in 1,5 ml Nuklease-freien Mikrozentrifugenrohren eine 20-L-Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung (500 pmol/l) für eine Endarbeitskonzentration von 50 pmol/l verdünnen (1:10 Verhältnis). Zu diesem Zweck mischen Sie 18 l Phosphatpuffer-Saline (PBS), die MgCl2 und CaCl2 enthalten, mit 2 l Sondenlagerlösung.
      HINWEIS: Beachten Sie, dass in der Arbeitslösung die Oligonukleotide anfälliger für Nukleaseabbau sind, daher wird empfohlen, die Arbeitslösungen kurz vor der Einrichtung der Reaktion vorzubereiten.
    2. Vermeiden Sie direkten Lichtkontakt während der Vorbereitung und halten Sie im Dunkeln (in Folie gewickelt), wenn Sie mit Fluorophoren umgehen.
  2. Reaktion eingerichtet
    1. Das Fluorometer (z.B. Cytation 1) auf 37 °C vorwärmen.
    2. Bereiten Sie für jede Probe (TSB, E. coli und Salmonella ) ein Set (ein Rohr/Sonde) von 1,5 ml Nuklease-freien Mikrozentrifugenröhrchen vor und etikettierenSie entsprechend.
    3. Fügen Sie vorsichtig 96 L TSB sterile Kulturmedien, Salmonellen-Überstand oder E. coli Überstand hinzu (ab Schritt 3.4.). Anschließend fügen Sie die Sondenarbeitslösung 4 l/L/Rohr entsprechend hinzu. Führen Sie diesen Schritt bei Raumtemperatur aus.
      HINWEIS: 10 Sonden wurden für die erste Runde des Screenings und 6 Sonden für die zweite Runde verwendet.
    4. Mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten, um eine homogene Lösung zu erhalten. Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen in die Proben während des Mischens.
    5. Laden Sie 95 l jeder Lösung (Sonde + Überstand oder Kulturmedien) in einen separaten Brunnen einer schwarzen, nicht behandelten 96-Wellplatte. Minimieren Sie die Bildung von Blasen in den Brunnen beim Beladen, indem Sie sorgfältig mit der Spitze in der Nähe der Wand des Brunnens verzichten.
    6. Bedecken Sie die Platte mit ihrem Deckel. Überprüfen Sie den Deckel visuell und prüfen Sie, ob Stiftmarkierungen oder Staubpartikelansammlungen, die Messartefakte einführen können, überprüft werden. Ersetzen Sie den Deckel gegen einen neuen, wenn dies der Fall ist.
  3. Messeinrichtung
    1. Öffnen Sie die Erfassungssoftware (Gen5 3.05), indem Sie auf das Symbol für die Softwareverknüpfung klicken (Abbildung S1A).
    2. Wählen Sie Jetzt lesen aus dem Aufgaben-Manager-Fenster und wählen Sie Neu... um das kinetische Messprotokoll zu erstellen (Abbildung S1B).
    3. Klicken Sie im Dialogfenster prozedural auf Temperatur festlegen und wählen Sie 37 °C aus. Bestätigen und speichern Sie die Einstellungen, indem Sie OK drücken (Abbildung S1C).
    4. Klicken Sie im Dialogfenster mit dem Titel Procedureauf Kinetics starten. Wählen Sie dann im Popup-Dialogfenster mit dem Titel Kinetic Step2 h im Eingabefeld Laufzeit und 2 min im Intervalleingabefeld aus. Bestätigen und speichern Sie die Einstellungen, indem Sie OK drücken (Abbildung S1D).
    5. Klicken Sie im Dialogfenster mit dem Titel Prozedurauf Lesen . Wählen Sie dann im Popup-Dialogfenster mit dem Titel Lesemethode Fluoreszenzintensität als Erkennungsmethode, Endpunkt/Kinetik als Lesetyp und Filter als Optiktyp aus. Bestätigen und speichern Sie die Einstellungen, indem Sie OK drücken (Abbildung S1E).
    6. Wählen Sie im Popup-Dialogfenster Leseschritt (Kinetisch) Grün aus dem Filtersatzaus. Bestätigen und speichern Sie die Einstellungen, indem Sie OK drücken (Abbildung S2A).
    7. Wählen Sie im Dialogfeld prozedural den Deckel aus, und klicken Sie auf Überprüfen, um sicherzustellen, dass das erstellte Protokoll gültig ist. Dies wird durch ein Popup-Dialogfenster bestätigt (Abbildung S2B).
    8. Wählen Sie Protokoll in der Menüleiste und wählen Sie Prozedur (Abbildung S2C).
    9. Definieren Sie im Dialogfenster prozedurierenSie die zu messenden Brunnen (Abbildung S2D).
    10. Geben Sie den Namen des Experiments in das Eingabefeld Dateiname ein (Abbildung S2E).
    11. Laden Sie die Platte mit dem Deckel in den Plattenleser. Stellen Sie sicher, dass sich die Platte in der richtigen Ausrichtung befindet.
    12. Starten Sie die Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche "Neue Taste lesen" in der Symbolleiste klicken (Abbildung S2F).
  4. Datenanalyse
    1. Klicken Sie auf eine der gemessenen Brunnen im Dialogfenster mit dem Titel Platte 1 (Abbildung S3A).
    2. Klicken Sie auf Brunnen auswählen und alle gemessenen Brunnen in das Dialogfenster Brunnenauswahl ein. Bestätigen und speichern Sie die Einstellungen, indem Sie OKdrücken. (Abbildung S3B).
    3. Wählen Sie Daten im Dialogfeld mit dem Titel Platte 1 aus, um die tabellarischen Ergebnisse zu visualisieren (Abbildung S3C).
    4. Exportieren Sie die Daten in ein Spreadsheet, indem Sie den Schnellexport aus dem Kontextmenü auswählen (Abbildung S3C).
    5. Beschriften Sie im Spreadsheet die Datenspalten für jede Probe und jeden Prüfpunkt entsprechend.
    6. Generieren Sie kinetische Diagramme unter Verwendung des Linienstils mit Markern, indem Sie relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) im Vergleich zur Zeit (x-Achse: Zeitachse der Reaktion und y-Achse: RFUs) darstellen.
      HINWEIS: Die Beschreibung der Erstellung eines Diagramms ist anwendbar, wenn Tabellenkalkulationsprogramme (z. B. Excel) verwendet werden. Alle anderen Programme können jedoch verwendet werden, um Diagramme aus den erhaltenen Rohdaten zu generieren, indem RFU im Vergleich zur Zeit dargestellt wird.
    7. Berechnen Sie die Rate der enzymatischen Reaktion für jedes gemessene Equation 1 Intervall nach der folgenden Formel25: rate= , wobei If is RFU beim maximalen Intervallzeitpunkt und Ii RFU beim minimalen Intervallzeitpunkt ist, Und Tf und Ti sind die maximalen bzw. minimalen Intervallzeitpunkte.
    8. Wählen Sie die Rate mit dem höchsten Wert (Rmax) für jede Kurve aus. Wenn pro Probe mehr als ein Rmax vorhanden ist, wählen Sie den Wert aus, der am frühesten Messzeitpunkt auftritt.
    9. Berechnen Sie das Verhältnis zwischen Rmax und dem Durchschnittswert des Zeitintervalls, in dem Rmax auftritt: Ratenkoeffizient =Equation 2
    10. Berechnen Sie die Faltendifferenz (FD) zwischen dem Ratenkoeffizienten von Salmonellen und E. coli für jede Sonde.
    11. Betrachten Sie einen Faltendifferenzwert, der höher als 3 ist, als signifikant.
    12. Betrachten Sie die signifikanten Sonden mit den höchsten Falzdifferenzwerten (FD) als Kandidatensonden und als Grundlage für das Bibliotheksdesign in der nächsten Screening-Runde.

5. Auswahlkriterien der Screening-Runden (Abbildung 1)

  1. Erste Runde des Screenings
    1. Führen Sie den Nukleaseaktivitätstest (wie in Abschnitt 4 beschrieben) mit DNA-, RNA- und Polynukleotid-Sonden durch.
    2. Bewerten Sie die Präferenz für DNA-Chemie oder RNA-Chemie, indem Sie die Anzahl und Leistung (FD-Wert) von DNA- und RNA-Kandidatensonden vergleichen.
    3. Wählen Sie die Art der Nukleinsäurechemie aus, die die größte Anzahl von Kandidatensonden ausgibt, wie in Abbildung 1dargestellt.
  2. Zweite Runde des Screenings
    1. Führen Sie den Nukleaseaktivitätstest (wie in Abschnitt 4 beschrieben) mit vollständig modifizierten Sonden und chimären Sonden durch, die auf dem in der ersten Screening-Runde ausgewählten Nukleinsäuresubstrat basieren.
    2. Bewerten Sie die Präferenz für Sequenzen, die 2'-Fluoro- und 2'-O-Methyl-Nukleosid-Analoge enthalten, indem Sie die Ergebnisse für 2'-Fluor- und 2'-O-Methylmodifizierte Kandidatensonden vergleichen.
    3. Wählen Sie den Typ der analogen Nukleosidmodifikation aus, wodurch die größte Anzahl von Kandidatensonden dargestellt wird, wie in Abbildung 1dargestellt.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf dieser Methode, die in zwei Screening-Runden unterteilt ist. In der ersten Runde des Screenings verwendeten wir 5 DNA-Sonden (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C und DNA Poly G) sowie 5 RNA-Sonden (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C und RNA Poly G). Die Rohdaten dieser Screening-Runde sind in der Ergänzenden Tabelle 1 zu finden. In der zweiten Runde wurden chemisch modifizierte Sonden synthetisiert, indem die RNA-Sequenz durch chemisch modifizierte Nukleoside (All 2'-Fluoro und All 2'-OMethyl) oder durch die Kombination von RNA und Purinen oder Pyrimiden chemisch modifiziert (RNA Pyr-2'F, RNA) ersetzt wurde. Pyr-2'OMe, RNA Pur-2'F und RNA Pur-2'OMe). Die Rohdaten dieser Screening-Runde sind in der Ergänzenden Tabelle 2 zu finden. Eine detaillierte Beschreibung der Sequenzen finden Sie in Tabelle 1. Die Ergebnisse der ersten Screening-Runde sind in Abbildung 2dargestellt, in der Salmonellenkulturüberstandmittel eine klare Präferenz für RNA-Sonden gegenüber DNA-Sonden melden. Im Gegensatz dazu zeigen E. coli und Kulturmedienkontrollen eine sehr begrenzte Fähigkeit, RNA-Sonden zu degradieren. Darüber hinaus haben wir die Faltendifferenz (FD) zwischen den Ratenkoeffizienten von Salmonellen und E.coli (Ergänzende Tabelle 3 und Ergänzende Tabelle 4) berechnet, um die leistungsstärksten Sonden zu ermitteln. Die Berechnungen wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben durchgeführt.

Diese Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein einer RNase-Aktivität aus Salmonellenab. Basierend auf der Identifizierung von RNA als bevorzugtem Nukleinsäuretyp für Salmonella-Nukleasen haben wir eine neue Bibliothek mit chemisch modifizierten Nukleotiden entwickelt, die in der zweiten Screening-Runde verwendet werden sollen, um die Spezifität der Sonden. Abbildung 3 zeigt die kinetischen Profile der Sonden, die chemisch modifizierte Nukleotide enthalten. Interessanterweise zeigen RNA Pyr-2'OMe und RNA Pur-2'OMe das am besten abführende kinetische Verhalten im Vergleich zu RNA Pyr-2'F bzw. RNA Pur-2'F.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Salmonellen eine wichtige RNase-Aktivität haben, die für die Auswahl von Sonden verwendet werden kann, die diese Bakterien gezielt erkennen können. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass 2'-OMe chemisch modifizierte Nukleoside besser für die Art von RNAs emittierten RnAsegeeignet sind. Vor diesem Hintergrund bietet das in diesem Beitrag beschriebene Protokoll die Möglichkeit, die Verwendung von Nukleaseaktivitäten als Biomarker zu untersuchen.

Figure 1
Abbildung 1:Bakterienkulturen und Ablaufdes des Screening-Prozesses. Herstellung von Bakterienkulturen und Überstand (links). Beschreibung des Workflows für die beiden Screening-Runden. Erstes Screening: Die Präferenz für DNA oder RNA wird mit 10 Sonden bewertet. Zweites Screening: Basierend auf der Nukleinsäurepräferenz werden zusätzliche Sonden, die chemisch modifizierte Nukleotide enthalten, bewertet, um die leistungsfähigsten Substrate für eine bestimmte Nukleaseaktivität zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2:Erste kinetische Screening-Runde. Kinetische Profile von Salmonellen, E. coli und Kulturmedien (TSB) mit DNA- und RNA-Sonden. Die Nukleaseaktivität wird durch relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) dargestellt. Die Graphen sind repräsentativ für mindestens 3 individuell durchgeführte Experimente. Die verschiedenen Stichproben sind wie in der Legende des Diagramms angegeben. Die Faltendifferenzwerte (FD) wurden anhand der Ratenkoeffizienten von Salmonellen und E. coli für jede Sonde berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3:Zweite kinetische Screening-Runde. Kinetische Profile von Salmonellen, E. coli und Kulturmedien (TSB) mit chemisch modifizierten Sonden. Die Nukleaseaktivität wird durch relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) dargestellt. Die Graphen sind repräsentativ für mindestens 3 individuell durchgeführte Experimente. Die verschiedenen Stichproben sind wie in der Legende des Diagramms angegeben. Die Faltendifferenzwerte (FD) wurden anhand der Ratenkoeffizienten von Salmonellen und E.coli für jede Sonde berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Table 1
Tabelle 1: Nukleinsäuresondensequenzen. Liste aller in dieser Studie verwendeten Nukleinsäuresonden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 1
Ergänzende Abbildung 1: Messung eingerichtet. Schaltflächenklicks und Dialogfenster, die den schrittweisen Prozess beschreiben, der in der Erfassungssoftware durchgeführt wird, um die verschiedenen Messparameter einzurichten. (A) Desktop-Symbol. (B) Task-Manager-Dialogfenster. (C) Verfahren und Temperatur Dialogfenster einrichten. (D) Prozedur- und Kinetic Step-Dialogfenster. (E) Dialogfenster für Prozedur und Lesemethode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 2
Ergänzende Abbildung 2: Messung eingerichtet. Schaltflächenklicks und Dialogfenster, die den schrittweisen Prozess beschreiben, der in der Erfassungssoftware durchgeführt wird, um die verschiedenen Messparameter einzurichten. (A) Prozedur- und Leseschrittfenster (Kinetisch) Dialogfenster. (B) Prozedur-Dialogfenster (C) "Protokoll" Menüleiste. (D) Gut Auswahl Dialogfenster. (E) Eingabefeld Dateiname. (F) Führen Sie das Neue Symbol aus, das verwendet wird, um die Erfassung innerhalb der Software zu starten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 3
Ergänzende Abbildung 3: Datenanalyse. Schaltflächenklicks und Dialogfenster, die den schrittweisen Prozess in der Erfassungssoftware beschreiben, um erfasste Daten zur weiteren Analyse in ein Spreadsheet zu exportieren. (A) Plate Matrix Dialogfenster. (B) Dialogfenster "Platte" und "Well Selection". (C) Das Dialogfenster "Platte" und das Kontextmenü "Schnellexport" . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 4
Ergänzende Abbildung 4: Dritte Screening-Runde (Sequence-Preference-Optimierung). Beschreibung der verschiedenen Schritte einer zusätzlichen Screening-Runde zur Bewertung von Sequenzvariationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 5
Ergänzende Abbildung 5: Vierte Screening-Runde (Spezifitätsbewertungsrunde). Beschreibung der verschiedenen Schritte einer zusätzlichen Screening-Runde, die auf eine Erhöhung der Spezifität abzielt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 6
Ergänzende Abbildung 6: Fünfte Screening-Runde (Reaktionsparameteroptimierung). Beschreibung der verschiedenen Schritte einer zusätzlichen Screening-Runde, die darauf abzielt, die nicht zielorientierte Kreuzreaktivität durch Modulation der Nukleaseaktivität zu reduzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Table 1
Ergänzende Tabelle 1: Rohdaten aus der ersten Screening-Runde. Für jede Sonde (rot markiert, oben) wurden die Erfassungszeit und die Rohfluoreszenzwerte für TSB, E. coli und Salmonellasowie der berechnete Kurswert für jedes Intervall angegeben. Die Berechnungen wurden wie im Abschnitt Methoden beschrieben durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Supplementary Table 2
Ergänzende Tabelle 2: Rohdaten aus der zweiten Screening-Runde. Für jede Sonde (rot markiert, oben) wurden die Erfassungszeit und die Rohfluoreszenzwerte für TSB, E. coli und Salmonellasowie der berechnete Kurswert für jedes Intervall angegeben. Die Berechnungen wurden wie im Abschnitt Methoden beschrieben durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Supplementary Table 3
Ergänzende Tabelle 3: Datenanalyse für die erste Screening-Runde. Für jede Sonde (rot markiert, oben) wurden folgende Werte für TSB, E. coli und Salmonellaermittelt: Höchstwerte, minimale und maximale Intervallzeitpunkte, Ratenkoeffizient, Faltendifferenzwerte zwischen Salmonellen und E. coli über TSB und Faltendifferenzwerte zwischen Salmonellen und E. coli (gelb hervorgehoben). Die Berechnungen wurden wie im Methodenabschnitt beschrieben durchgeführt und die Berechnungsformeln und die Schritt-für-Schritt-Berechnungen werden in der Kalkulationstabelle angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Supplementary Table 4
Ergänzende Tabelle 4: Datenanalyse für die zweite Screening-Runde. Für jede Sonde (rot markiert, oben) wurden folgende Werte für TSB, E. coli und Salmonellaermittelt: Höchstwerte, minimale und maximale Intervallzeitpunkte, Ratenkoeffizient, Faltendifferenzwerte zwischen Salmonellen und E. coli über TSB und Faltendifferenzwerte zwischen Salmonellen und E. coli (gelb hervorgehoben). Die Berechnungen wurden wie im Methodenabschnitt beschrieben durchgeführt und die Berechnungsformeln und die Schritt-für-Schritt-Berechnungen werden in der Kalkulationstabelle angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Veränderungen der Nuklease-Aktivität wurden mit einer Vielzahl von Krankheitsphänotypen in Verbindung gebracht, einschließlich verschiedener Krebsarten und bakterieller Infektionen. Diese Veränderungen werden als Erreger einer Erkrankung14vorgeschlagen, während sie in anderen Fällen die Folge eines schädlichen physiologischen Ereignisses20 oder des Pathogens16,26sind. Es überrascht nicht, dass Versuche, Nuklease nukleases und Nukleaseaktivität als diagnostischer Biomarker zuverwenden, 15,22,23,26, mit erheblichem Versprechen beschrieben wurden. Daher erscheint die Etablierung eines robusten und reproduzierbaren Screening-Ansatzes für die systematische Bewertung der Nukleaseaktivität bei Krankheiten und für die Identifizierung eines spezifischen und sensiblen Berichterstatters relevant. Um dieser Notwendigkeit gerecht zu werden, haben wir eine robuste, modulare und einfach zu implementierende Screening-Plattform auf Deraszenz-Test entwickelt, die die Entdeckung neuartiger Krankheitsbiomarker und die Identifizierung empfindlicher und spezifischer Nukleinsäuresonden in parallel, durch die katalytische Wirkung von Nukleasen.

Leistungsstarke Screening-Tools wie das Kleinmolekül-Hochdurchsatz-Screening (HTS)27, die systematische Entwicklung von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX)28 oder phagendisplay29 wurden bereits berichtet, die es Identifizierung von Molekülen zur Erkennung hoher Affinität (z. B. kleine Moleküle, Aptamer oder Bindungspeptide). Im Vergleich dazu ermöglicht der hier vorgestellte Screening-Ansatz die Auswahl von Sonden, die bekannte und unbekannte Nuklease-Aktivitäten identifizieren können. Darüber hinaus ist dieser Ansatz mit In-vitro-, Ex-vivo- und In-vivo-Screening-Modellen kompatibel. Darüber hinaus verschafft die Reaktivität von Nukleasen einen offensichtlichen Vorteil gegenüber den oben genannten Ansätzen, da die Sonden-Nuklease-Interaktion kein statischer, sondern ein dynamischer Prozess ist. Dies bedeutet, dass die Aktivität der Nukpen zu einem intrinsischen Signalverstärkungsmodul für die Reportersonden wird, da mehrere Reportersonden mit einer einzelnen Nuklease interagieren können.

Wie bei jeder anderen Screening-Methode ist die Generierung und Verwaltung der ursprünglichen Bibliothek unerlässlich. Die Natur von Nukleinsäuresonden bietet eine große Flexibilität bei der Gestaltung und Erstellung einer Bibliothek und ermöglicht die Einführung unterschiedlicher Komplexitätsgrade je nach Screening-Anwendung. Die Komplexität der Bibliothek kann auf verschiedenen Ebenen eingeführt werden, einschließlich Sequenzmotiven, Nukleotidchemie, Phosphat-Rückgratchemie und Oligonukleotid-Länge. Die Modulation der Komplexität der Bibliothek ermöglicht die Identifizierung von Sonden, nicht nur wegen ihrer Fähigkeit, Nukleaseaktivitäten im Zusammenhang mit Krankheiten erfolgreich zu identifizieren, sondern auch für Eigenschaften, die mit nachfolgenden In-vivo-Anwendungen kompatibel sind. Darüber hinaus bietet eine Nukleinsäure-Basenbibliothek mehrere Vorteile gegenüber ihren Antikörper- oder Peptid-Gegenstücken. Einerseits ist die Antikörperproduktion bekanntlich umständlich und erfordert Tiere oder komplexe eukaryotische Kultursysteme, die die Kosten erhöhen und Chargenvariabilität30,31einführen. Darüber hinaus begrenzen das hohe Molekulargewicht und die Immunogenität ihre Anwendung28,32. Andererseits erfordert die Erzeugung biologischer Peptidbibliotheken in der Regel entweder virale oder bakterielle Expressionssysteme29,30, was die Komplexität des Screening-Prozesses erhöht. Chemische Peptidbibliotheken vermeiden dieses Problem, auf Kosten der Verwendung von verworrenen Perlen-basierten Systemen oder mehrere Runden teurer Peptidsynthese33. All diese Probleme werden durch die Verwendung einer Nukleinsäurebibliothek umgangen. Sobald die ursprüngliche Bibliothek eingerichtet wurde, sind die Screening-Methoden schnell und unkompliziert. Die hier beschriebene Methode dient als Plattform für zusätzliche Screening-Runden, wie z.B. Sequenzoptimierung (Ergänzende Abbildung 4), Spezifitätsauswertung (Ergänzende Abbildung 5) oder Optimierung von modulatorischen Elementen Nuklease-Aktivität, wie Metallkofaktoren (typischerweise divalente Kationen) und Chelatoren, die sehr nützlich sind, um die Spezifität der ausgewählten Sonden zu erhöhen (Ergänzende Abbildung 6).

Der in dieser Studie verwendete kinetische fluorometrische Assay kann sowohl für bakterielle als auch für zelluläre Kulturen optimiert werden, wobei das Screening in benutzerfreundlichen Mikrotiterplatten durchgeführt wird. Bei zellulären Assays ist dieses Protokoll sowohl mit Suspensions- als auch mit Monolayer-Kulturen kompatibel, die nach der Optimierung entsprechend den Notwendigkeiten des untersuchten In-vitro-Modells verwendet werden können. Wir haben mehrere kritische Schritte identifiziert, die vor dem Screening optimiert werden müssen. Dazu gehören die zu untersuchende Zellzahl oder Bakteriendichte, die Sondenkonzentration, die Fluorometerdetektorverstärkungseinstellungen oder die Implementierung eingebauter Hintergrundkorrekturmethoden. Eine Einschränkung dieser Technologie ist die Notwendigkeit einer veränderten Nukleaseaktivität, die mit dem pathologischen Zustand von Interesse verbunden ist. Ohne diese Funktion ist der Screening-Ansatz für die Auswahl der Kandidatensonden nicht realisierbar. Eine weitere Einschränkung ist die Selbstabschreckungsfähigkeit von Guaninen, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe zum Fluorophor befinden. Dieses Merkmal muss beim Entwerfen der Bibliothek berücksichtigt werden.

Die Enzymatik der gemessenen Reaktion macht es notwendig, die Ladezeiten der Platte zu berücksichtigen. Die Minimierung der Ladezeiten reduziert die Hintergrundunterschiede zwischen den verschiedenen Versuchsbedingungen. Es gibt mehrere Möglichkeiten, dieses Problem zu lösen, wie z. B. die Verlangsamung der enzymatischen Reaktion während der Beladung durch den Einsatz eiskalter Reagenzien oder die Verwendung automatisierter Ladesysteme, wobei letztere die Kosten, aber auch den Durchsatz erheblich erhöht. Darüber hinaus stellen kinetische Messungen eine große Verbesserung gegenüber statischen Messungen dar und liefern ein vollständiges und realistischeres Bild der Dynamik der katalytischen Aktivität von Nukleasen.

Zusammenfassend bietet unser Protokoll ein vielseitiges, robustes und reproduzierbares Screening-Verfahren zur Identifizierung empfindlicher und spezifischer Nukleinsäuresonden zum Nachweis der mit der Krankheit verbundenen Nukleaseaktivität, die große Hürden alternative Screening-Methoden. Wir gehen davon aus, dass diese Screening-Technologie die Entwicklung neuartiger diagnostischer Werkzeuge unter einer Vielzahl von Bedingungen ermöglichen wird, mit einer einfachen Übersetzung in die Klinik.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren würdigen Luiza I. Hernandez (Linköping University) für ihre sorgfältige Überarbeitung des Manuskripts und wertvolle Ratschläge. Diese Arbeit wurde von der Knut and Alice Wallenberg Foundation und dem Strategic Research Area in Materials Science on Advanced Functional Materials der Universität Linköping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No. 2009-00971) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black bottom, non-treated 96 well plate Fisher Scientific 10000631
Cytation1 BioTek CYT1FAV
Eppendorf tubes Thermofisher 11926955
Escherichia coli ATCC 25922
Microbank cryogenic storage vial containing beads Pro-Lab Diagnostics 22-286-155
Nucleic acid probes Biomers.net #
Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 Gibco™ 14040117
Salmonella enterica subs. Enterica ATCC 14028
Tris-EDTA Fisher Scientific 10647633
Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood Thermo Fisher Scientific 10362223
Tryptic Soy Broth Sigma Aldrich 22092

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References

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Biochemie Ausgabe 153 Screening-Methode Nukleasen Biomarker Nukleinsäuren Sonden Nukleaseaktivität Diagnosewerkzeug Substrat
Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden
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Balian, A., Garcia Gonzalez, J., Bastida, N., Akhtar, K. T. K., Borsa, B. A., Hernandez, F. J. Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes. J. Vis. Exp. (153), e60005, doi:10.3791/60005 (2019).

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